E- 4031 對遺傳性長QT 綜合征hERG 通道功能影響的研究

黃曉燕 王英 廉姜芳

遺傳性長QT 綜合征（hereditary long QT syndrome，hLQTs）是因編碼心肌離子通道蛋白基因突變導致心肌細胞膜離子通道功能障礙的一組臨床綜合征，常于青少年發(fā)病，是青少年猝死的主要原因。其中Ⅱ型長QT 綜合征（long QT syndrome 2，LQT2）的發(fā)生與快激活延遲整流鉀電流（rapidly activating component of delayed rectifier potassium current，IKr）的減少有關，這是由于編碼IKr通道α 亞單位的人類ether-a-go-go 相關基因（human ether-a-go-gorelated gene，hERG）的突變引起[1]。迄今為止，已發(fā)現了500 多個hERG 基因突變位點，其中大多為錯義突變[2-3]，G572R 突變是其中之一。已知G572R 突變導致其編碼的蛋白質合成和轉運障礙，突變蛋白滯留于內質網，無法轉運至細胞膜上形成有功能的離子通道，導致編碼的IKr電流減少和心室復極延遲。目前對LQT2 患者缺乏特異性診斷及有效治療方法。本研究探討藥物E-4031 對WT/G572R-hERG雜合型通道功能的影響，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基購自美國Thermo scientific 公司；轉染試劑（LipofectaminTM2000）購自美國Invitrogen 公司；兔抗hERG 多克隆抗體購自以色列Alomone 公司；E-4031 購自德國Calbiochem 公司；膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國Axon 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染 HEK293T 細胞常規(guī)用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據轉染試劑提供的實驗步驟，將2.5 μg pcDNA3-WT-hERG 質粒和2.5 μg pcDNA3-G572R-hERG 質粒，瞬時轉染HEK293T 細胞，構建WT/G572R-hERG 細胞株。同時共轉染0.8 μg綠色熒光蛋白以監(jiān)測轉染效率。

1.2.2 藥物干預 構建WT/G572R-hERG 細胞株后，將其分為兩組，觀察組加入E-4031 孵育24h，作用濃度為5 μmol/L。對照組用含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 hERG 通道蛋白表達的檢測 采用Western blot 法檢測兩組hERG 通道蛋白的表達。收集兩組細胞，加入預冷蛋白裂解液。取裂解上清液加樣，經7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜。一抗兔抗hERG 多克隆抗體1∶400 稀釋，4 ℃孵育過夜。二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體1∶1 000 稀釋，室溫孵育2 h，最后在化學發(fā)光成像儀中觀察拍照。

1.2.4 hERG 通道激活電流和尾電流的檢測 采用全細胞膜片鉗技術觀察兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子。電極外液配方：NaCl 137 mmol/L，KCl4mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl2·6H2O 1 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入NaOH 將pH 調至7.4）。電極內液配方：KCl 130 mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，Mg-ATP 6 mmol/L，HEPES 10 mmol/L（最后加入KOH 將pH 調至7.2）[4-5]。灌注電極內液后電極入水電阻為3～7 mΩ；刺激程序由Clampex 9.2 軟件和Axon 700B 放大器共同完成，信號經過Axon 700B 放大器和A/D 轉換后儲存于計算機中。將細胞鉗制在-80 mV，測試電壓以10 mV 階躍從-60 mV 刺激到+60 mV，持續(xù)時間2 s；然后去極化到-40 mV，持續(xù)4 s；最后回到-80 mV[4-5]，記錄hERG通道激活電流和尾電流的電流幅度。對在-40 mV記錄到的尾電流經最大電流標準化，用Boltzmann方程擬合，得出兩組半激活最大電壓和斜率因子并進行比較。

1.2.5 hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流的檢測 方法同hERG 通道激活電流和尾電流。測試電壓以10 mV階躍從-130 mV 刺激到20 mV，持續(xù)時間20 ms；然后測試電壓鉗制在20 mV 時記錄hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流，經最大電流標準化，用Boltzmann 方程擬合，得出兩組半失活最大電壓和斜率因子并進行比較。

1.2.6 hERG 通道失活恢復電流的檢測 方法同hERG 通道激活電流和尾電流。電壓鉗制在-80 mV，復極至50 mV 使通道失活，接著以10 mV 的階躍從-30 mV 刺激到-120 mV，持續(xù)時間3 s，記錄兩組hERG 通道失活恢復電流，用單指數方程進行擬合得到失活恢復時間常數并進行比較。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Excel 和Origin7.5 軟件對原始數據進行統(tǒng)計、擬合和作圖。計量資料以表示，兩樣本比較采用配對t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組hERG 通道蛋白表達的比較 見圖1。

圖1 兩組hERG 通道蛋白表達的比較（A：兩組hERG 蛋白條帶的變化，B：兩組hERG 蛋白的灰度值比較；與對照組比較，*P＜0.05）

由圖1 可見，對照組在135 kDa 和155 kDa 出現兩條蛋白質條帶，而觀察組155 kDa 的蛋白質條帶明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子的比較 見圖2。

由圖2 可見，對照組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別是（219.34±28.98）pA 和（566.61±121.60）pA，而觀察組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別是（416.32±90.37）pA和（897.25±92.05）pA。與對照組比較，觀察組hERG 通道激活電流和尾電流的最大電流幅度分別增加了89.81%和58.35%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外對照組尾電流擬合后半激活最大電壓和斜率因子分別是（4.51±0.41）mV 和（8.99±0.37），觀察組分別是（6.37±1.09）mV 和（10.40±0.99），兩組尾電流擬合后半激活最大電壓和斜率因子比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓和斜率因子的比較 見圖3。

由圖3 可見，觀察組和對照組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓分別為（-83.39±1.45）mV和（-69.05±2.58）mV，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；斜率因子分別為（24.99±1.18）和（28.94±2.90），差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

2.4 兩組hERG 通道電流失活恢復時間常數比較見圖4。

由圖4 可見，兩組hERG 通道電流失活恢復時間常數比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。

圖2 兩組hERG 通道激活電流和尾電流的電流幅度、半激活最大電壓和斜率因子的比較（A：兩組hERG 通道激活電流和尾電流圖；B：兩組激活電流的電流幅度；C：兩組尾電流的電流幅度；D：兩組尾電流經擬合得出半激活最大電壓和斜率因子）

3 討論

LQT2 是由于hERG 基因突變引起的一組心臟離子通道病。hERG 基因編碼的蛋白是由4 個亞基組成的四聚體，每個亞基有6 個跨膜片段（S1-S6），其中S5-S6 之間的疏水性環(huán)為最保守的區(qū)域，向膜內折疊形成離子孔道的孔區(qū)。正常的hERG 通道蛋白有兩種形式：一種是存在于內質網未完全糖基化的135 kDa 大小前體；另一種是經高爾基體復雜糖基化修飾后，插入細胞膜上的成熟的155 kDa 大小通道蛋白。G572R 錯義突變位于hERG 通道的S5跨膜片段末端，572 位的甘氨酸被精氨酸所取代。G572R 突變發(fā)生時，突變的通道蛋白會與野生型蛋白結合形成雜合型通道（Western blot 表現為155 kDa和135 kDa 兩個蛋白條帶，但155 kDa 的蛋白質條帶明顯弱于野生型細胞），滯留于內質網中，從而減少野生型蛋白在細胞膜上的表達，使細胞膜上有功能的離子通道減少[6]。這些突變蛋白尤其是雜合型通道，并非功能完全喪失，若對其調控后能部分糾正或者恢復正常轉運，仍能發(fā)揮一定的代償功能[7-9]。

藥物分子對突變蛋白的改善和糾正作用一直以來都是研究的熱點[10]。E-4031 屬于Ⅲ類抗心律失常藥。有研究報道發(fā)現，G601S、R534C、A422T、V630L和N407D 突變，其編碼的HERG 鉀通道存在蛋白轉運障礙，可以被E-4031 所部分糾正或恢復，但A561V、H562P、R752W、F805C 和R823W 突變體則不能被E-4031 所糾正[11-13]。本研究發(fā)現，與對照組比較，觀察組hERG 通道蛋白質條帶明顯增強；全細胞膜片鉗檢測發(fā)現，hERG 通道激活電流幅度和尾電流幅度較干預前分別增加了89.81%和58.35%?？梢奅-4031 對G572R 突變導致的蛋白轉運障礙起到了部分改善和糾正作用。此外，E-4031 干預使得hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流的電向明顯負向移動14.34 mV，可見E-4031 干預還加速了通道電流的穩(wěn)態(tài)失活速度。

對于不同的hERG 基因突變位點，E-4031 處理有著不同的反應，這提示不同突變位點的蛋白構象及功能缺失的機制存在不同。本研究發(fā)現E-4031能改善WT/G572R-hERG 通道功能。因此，通過藥物分子對HERG 通道功能的調節(jié)作用，以期從調控蛋白質轉運角度，為改善HERG 通道功能提供有效方法。

圖3 兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流半失活最大電壓和斜率因子的比較（A：兩組hERG 通道穩(wěn)態(tài)失活電流圖；B：穩(wěn)態(tài)失活電流經擬合得出半失活最大電壓和斜率因子）

圖4 兩組hERG 通道電流失活恢復時間常數比較（A：兩組hERG通道失活恢復電流圖；B：通道電流失活恢復時間常數圖）