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      超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油工藝及抗疲勞活性研究

      2021-02-06 07:57:46馬挺軍
      中國糧油學(xué)報(bào) 2021年1期
      關(guān)鍵詞:籽油超臨界游泳

      潘 迪 馬挺軍

      (北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

      黃榆(Ulmusmacrocarpa)為榆科榆屬落葉喬木或灌木植物,高達(dá)20 m,胸徑30 cm,分布于我國東北及華北、西北部分省區(qū),朝鮮、俄羅斯也有分布[1]。作為防護(hù)林工程的優(yōu)良樹種之一,黃榆可防風(fēng)固沙、固土保水、城市綠化,不僅生態(tài)價(jià)值巨大,還具有較高的藥用價(jià)值。研究表明黃榆提取物具有抗腫瘤、抗過敏[2]、抗氧化、抗皮膚衰老[3]、抗高脂血[4]、免疫[5]等藥理功效。本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得黃榆籽中,脂肪含量9.44 g/100 g,蛋白質(zhì)23.5 g/100 g,總糖(以葡萄糖計(jì))4 g/100 g,灰分3.65 g/100 g,水分及揮發(fā)物5.044 g/100 g。因此,黃榆籽油具有廣闊的開發(fā)前景。

      植物油的提取方法有壓榨法[6],浸提法[7],超聲波輔助法[8],水酶法[9]等,雖然都取得了一定效果,但壓榨法出油率低、浸提法和超聲輔助法存在溶劑殘留、水酶法酶的選擇性高等缺點(diǎn)。而超臨界二氧化碳萃取法可以克服上述提取方法的不足,它是在超臨界狀態(tài)下使用二氧化碳作為溶劑,可以在較低的溫度下進(jìn)行萃取,不會(huì)對(duì)熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響,更不會(huì)引起部分物質(zhì)的氧化,具有綠色、無毒、無溶劑殘留、萃取率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),但該方法儀器設(shè)備昂貴,且相關(guān)理論及技術(shù)要求較高,不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),目前也僅用作小油種提取油脂的中試和小批量生產(chǎn)[10-12]。高妮娜等[13]比較了壓榨法、溶劑浸提法、水酶法和超臨界CO2萃取法對(duì)奇亞籽油品質(zhì)特性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取法的油脂得率最高(85.5%),其次是溶劑浸提法(65.8%)和壓榨法(40.9%),水酶法最低(33.2%)。阿吉姑·阿布都熱西提等[14]采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了萃取壓力、溫度、CO2流量和萃取時(shí)間對(duì)巴旦杏仁油超臨界CO2萃取得率的影響,結(jié)果表明萃取壓力35 MPa、萃取溫度40 ℃、二氧化碳流量6 L/min、萃取時(shí)間4 h 為最優(yōu)條件,在此條件下巴旦杏仁油萃取得率達(dá)到43.10%。Achicanoy等[15]采用超臨界二氧化碳萃取番茄籽油,得到的最佳萃取條件為壓力38.1 MPa,溫度64 ℃,萃取率為21.07%。故本實(shí)驗(yàn)采用超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油。

      劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)增加能量消耗,加速活性氧的積累,導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生身體疲勞[16]。而補(bǔ)充具有抗氧化能力的物質(zhì),可以提高抗氧化酶活性,從而延長運(yùn)動(dòng)能力,減少身體疲勞[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道,油脂中的亞油酸、亞麻酸和油酸等不飽和脂肪酸,具有抗氧化、降血脂、增強(qiáng)免疫力等功效[18]。此外,植物油脂中的活性成分如植物甾醇、生育酚、黃酮類、多酚類等,也具有抗氧化、抗衰老活性[19]。黃榆籽油作為新型的植物油脂,也受到了關(guān)注,但目前國內(nèi)對(duì)黃榆籽油體內(nèi)抗疲勞、抗氧化作用的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以黃榆籽為原料,采用超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油,在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn),研究萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)黃榆籽油萃取率的影響;然后對(duì)在此條件下萃取的黃榆籽油進(jìn)行理化性質(zhì)分析;并將其灌喂小鼠,通過小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn),分析小鼠體內(nèi)抗疲勞、抗氧化活性,以期為黃榆籽油的開發(fā)利用提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      黃榆籽采自吉林省國家級(jí)向海自然保護(hù)區(qū)蒙古黃榆樹林(內(nèi)蒙古科爾沁保護(hù)區(qū)黃榆林5,6月(該樹一般兩年結(jié)一次果,果熟5-6月);CO2純度99.99%,食用級(jí);色拉油 Aceties Monterreal S.A;香菇多糖片;鼠維持顆粒飼料 生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0012;尿素氮測(cè)定試劑盒(BUN)、乳酸試劑盒(LA)、肝糖試劑盒(LG)、丙二醛試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-Px);氫氧化鈉、甲醇、三氟化硼均為分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      PE AutoSystem XL-TurbeMass GC/MS聯(lián)用儀,毛細(xì)管色譜柱為SE254型(30 m×0.25 mm×0.25 μm),超臨界流體萃取系統(tǒng),UV-1601PC型可見紫外分光光度計(jì),雷杜Chemray360全自動(dòng)生化分析儀,HD型單列恒溫水浴鍋,小鼠籠具規(guī)格300 mm×180 mm×130 mm,材質(zhì)為PC聚碳酸酯。

      1.3 動(dòng)物

      雄性ICR小鼠 60只,起始體重(17.9±1.0)g,6周齡,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0009。

      實(shí)驗(yàn)小鼠被圈養(yǎng)在籠子里,每籠6只。在恒溫(20~25 ℃)和濕度50%~70%下,每日12 h/12 h光/暗交替照明(早上8點(diǎn)到晚上8點(diǎn)光照),并且小鼠在SPF(特異性無病原體)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)可自由食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌飲用水。

      1.4 實(shí)驗(yàn)方法

      1.4.1 黃榆籽油的超臨界流體萃取

      參考王玉玲等[20]的方法,取清理去雜后的黃榆籽,在干燥箱中于105 ℃烘烤2 h后粉碎,過60目篩子,備用。準(zhǔn)確稱取一定量的黃榆籽粉投入萃取釜中,調(diào)節(jié)系統(tǒng)的溫度、壓力至設(shè)定值,CO2流量為2.5 L/min,然后進(jìn)行循環(huán)萃取。當(dāng)達(dá)到設(shè)定時(shí)間后,從出料口收集產(chǎn)物并計(jì)算萃取率,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均。按下式計(jì)算黃榆籽油的萃取率。

      萃取率=(萃取的黃榆籽油質(zhì)量/黃榆籽粉質(zhì)量)×100%

      1.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

      按照1.4.1的實(shí)驗(yàn)方法,以黃榆籽油萃取率為試驗(yàn)指標(biāo),分別考察萃取壓力(10、20、30、40、50、60 MPa)、萃取溫度(10、20、30、40、50、60 ℃)、萃取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)對(duì)黃榆籽油萃取率的影響,采用控制變量法,確定各個(gè)因素的大致范圍。

      1.4.3 正交試驗(yàn)

      在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時(shí)間(C)為考察因素,每個(gè)因素選取3個(gè)水平,萃取率為考察指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。具體因素水平值見表1。

      表1 正交試驗(yàn)因素水平表

      1.4.4 黃榆籽油的理化性質(zhì)分析

      酸價(jià)按GB 5009.229—2016測(cè)定,過氧化值按GB 5009.227—2016測(cè)定,碘值按GB/T 5532—2008測(cè)定,皂化值按GB/T 5534—2008 測(cè)定,水分及揮發(fā)值含量按GB 5009.236—2016測(cè)定。

      1.4.5 抗疲勞、抗氧化實(shí)驗(yàn)

      1.4.5.1 動(dòng)物分組及飼喂

      適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分為5組,每組12只:正常對(duì)照組(NC)、陽性對(duì)照組(PC)、低劑量組(LD)、中劑量組(MD)和高劑量(HD)。樣品低、中、高劑量組每只小鼠每天分別灌胃黃榆籽油2.5、5、10 mL/kg(以體質(zhì)量bw計(jì),下同);正常對(duì)照組小鼠每只每天灌喂等量色拉油10 mL/kg;陽性對(duì)照組小鼠每只每天灌喂香菇多糖300 mg/kg。每日1次,連續(xù)28 d,灌胃期間自由取食和飲水。

      不同劑量黃榆籽油的配制方法:高劑量直接應(yīng)用黃榆籽油原油,中、低劑量組用色拉油稀釋配制,用時(shí)攪拌器混勻。密封,4 ℃冰箱貯藏,備用;使用時(shí)充分搖勻,每次給藥剩余藥液廢棄。

      1.4.5.2 小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)

      參考馬挺軍等[21]的方法,小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)如下:末次給藥1 h后,在小鼠尾部負(fù)小鼠體重5%的鉛皮,投入水溫為(27±0.5) ℃,水深40 cm的游泳箱中游泳,從放入小鼠開始計(jì)時(shí),至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的時(shí)間作為力竭游泳時(shí)間,觀察并記錄小鼠的力竭游泳時(shí)間。

      1.4.5.3 抗疲勞生化指標(biāo)測(cè)定

      參考Xia等[22]方法并進(jìn)行修改,小鼠負(fù)重游泳1 h后,眼球采血,血凝固后2 000 r/min離心15 min,取血清凍存,用于測(cè)定血尿素氮(BUN)、血乳酸(LA)。之后立即處死小鼠,取其肝臟,經(jīng)冰凍生理鹽水漂洗后用濾紙吸干,用于測(cè)定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和肝糖原(LG)含量。其中,BUN用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定,其他指標(biāo)均按照試劑盒進(jìn)行操作。

      1.5 數(shù)據(jù)分析

      2 結(jié)果與討論

      2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

      2.1.1 萃取壓力對(duì)黃榆籽油萃取率的影響

      從圖1可以看出,萃取壓力在10~30 MPa范圍內(nèi),隨著萃取壓力的增加,黃榆籽油的萃取率逐漸增大,達(dá)到30 MPa時(shí)萃取率達(dá)到最大值40.89%。這是因?yàn)檩腿毫ι撸珻O2密度增大,從而對(duì)溶質(zhì)溶解性能增加,有利于萃取[23]。當(dāng)萃取壓力超過30 MPa時(shí),黃榆籽油的萃取率沒有明顯變化。在實(shí)際生產(chǎn)過程中,萃取壓力過大會(huì)導(dǎo)致企業(yè)的經(jīng)營成本和設(shè)備投資明顯增加。綜合考慮,選擇萃取壓力為30 MPa。

      圖1 萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)黃榆籽油萃取率的影響

      2.1.2 萃取溫度對(duì)黃榆籽油萃取率的影響

      由圖1可知,隨著萃取溫度的升高,黃榆籽油的萃取率先增大后減小。當(dāng)萃取溫度為40 ℃時(shí),萃取率達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)檩腿囟鹊纳?,蒸汽壓增大,使分子間熱運(yùn)動(dòng)加劇,提高了黃榆籽油在CO2中的溶解度進(jìn)而萃取速率提高;但是溫度升高還會(huì)導(dǎo)致CO2流體的密度降低,從而降低了黃榆籽油溶解度[24]。因此,確定了最佳萃取溫度為40 ℃。

      2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)黃榆籽油萃取率的影響

      如圖1所示,隨著萃取時(shí)間延長,黃榆籽油萃取率逐漸增大。這是因?yàn)檩腿傞_始時(shí),超臨界二氧化碳流體與黃榆籽接觸的較少,萃取率低,隨著時(shí)間延長,兩者充分接觸導(dǎo)致萃取率增大。當(dāng)萃取時(shí)間超過120 min后,黃榆籽油的萃取率趨于平緩。這是由于黃榆籽油大部分被萃取出來,萃取時(shí)間繼續(xù)延長會(huì)導(dǎo)致能耗增大。所以選擇萃取時(shí)間為120 min。

      2.2 正交實(shí)驗(yàn)

      從表2可以看出,各因素對(duì)黃榆籽油萃取率的影響順序?yàn)椋狠腿毫?萃取時(shí)間>萃取溫度(A>C>B)。根據(jù)表3的方差分析結(jié)果,萃取壓力(A)對(duì)超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油的萃取率有顯著影響,萃取溫度(B)和萃取時(shí)間(C)對(duì)黃榆籽油萃取率影響不顯著。綜合分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定最佳工藝條件為A2B3C2,即萃取壓力為30 MPa,萃取溫度為50 ℃,萃取時(shí)間為120 min,通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,該條件下的萃取率為45.26%。

      表2 L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      表3 方差分析表

      2.3 黃榆籽油的理化性質(zhì)

      GB 2716—2018規(guī)定:食用植物油的酸價(jià)(KOH)≤3 mg/g,過氧化值≤0.25 g/100 g。由表4可知,超臨界二氧化碳萃取的黃榆籽油的酸價(jià)為3 mg/g,過氧化值0.052 g/100 g,符合食用植物油標(biāo)準(zhǔn)。

      表4 黃榆籽油品質(zhì)分析

      2.4 黃榆籽油抗疲勞、抗氧化實(shí)驗(yàn)

      2.4.1 黃榆籽油對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

      力竭游泳時(shí)間是小鼠運(yùn)動(dòng)能力的體現(xiàn),也是抗疲勞試驗(yàn)指標(biāo)之一。近年來,藥用植物多糖被認(rèn)為是一種新型的天然抗疲勞劑,故選擇香菇多糖作為陽性對(duì)照組。由圖2可知,與NC組相比,各組小鼠力竭游泳時(shí)間均延長。LD、MD組均延長不顯著;HD、PC組均延長極顯著(P<0.01),分別延長了4.67倍、20.37倍。以上結(jié)果表明,香菇多糖和黃榆籽油均可延長小鼠的力竭游泳時(shí)間,在不同劑量組黃榆籽油中高劑量組效果最好。

      注:NC-空白,PC-香菇多糖組。*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。圖2 黃榆籽油對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

      2.4.2 黃榆籽油對(duì)小鼠BUN、LA、LG含量的影響

      血尿素氮BUN是蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝產(chǎn)物,當(dāng)身體不能從碳水化合物和脂肪中獲得能量時(shí),蛋白質(zhì)和氨基酸就成為分解代謝的替代來源,以滿足能量需求,因此BUN含量升高導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生疲勞[25]。此外,長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)還會(huì)增加肌肉的耗氧量,進(jìn)而導(dǎo)致缺氧,加速糖酵解,產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì),如乳酸和丙酮;而乳酸的積累會(huì)使肌肉和血液的pH降低,直接或間接導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)能力下降,造成運(yùn)動(dòng)性疲勞[26,27]。由圖3可知,與NC組相比,各組的BUN、LA含量均有所降低,HD組小鼠的BUN、LA含量顯著降低(P<0.05),分別降低了17.11%、24.37%;PC組小鼠的LA含量顯著下降了27.97%(P<0.05),而其他各組小鼠的BUN、LA含量無顯著性差異。結(jié)果說明,黃榆籽油在高劑量下能有效抑制血尿素氮和乳酸的產(chǎn)生,延緩疲勞的發(fā)生,與香菇多糖效果相一致。

      圖3 黃榆籽油對(duì)小鼠BUN、LA、LG含量的影響

      肝糖原是運(yùn)動(dòng)過程中重要的能量來源,它可以被分解轉(zhuǎn)化成葡萄糖,為機(jī)體運(yùn)動(dòng)提供更多的能量,從而延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的產(chǎn)生[28]。由圖3可見,與NC組相比,各劑量組小鼠的LG含量均有所升高,其中,PC組小鼠的LG含量極顯著升高(P<0.01),而黃榆籽油劑量組中隨著劑量的增加,小鼠的LG含量逐漸升高,在HD組時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.05),并且比PC組提高了24.04%。這說明黃榆籽油可提高小鼠體內(nèi)肝糖原的含量,且高劑量組黃榆籽油的作用效果優(yōu)于香菇多糖。

      2.4.3 黃榆籽油對(duì)小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

      MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,MDA含量降低,可以減輕氧化應(yīng)激,改善運(yùn)動(dòng)性疲勞[29]。SOD和GSH-Px是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,可清除積累的氧自由基,維持體內(nèi)平衡,減弱活性氧的作用,從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不受破壞,防止疲勞的發(fā)生[30]。由表5知,與NC組相比,各劑量組MDA含量均有所降低,PC組顯著降低(P<0.05),LD、MD組降低不顯著,HD組極顯著降低(P<0.01);與NC組相比,各劑量組SOD和GSH-Px活力均有所升高,其中,SOD活力在HD組升高極顯著(P<0.01),而在其余各組均無顯著性差異;GSH-Px活力在MD、HD組均顯著提高(P<0.05),在PC組極顯著提高(P<0.01)。這表明,黃榆籽油可以提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性,防止過度運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激,降低氧化損傷。隨著黃榆籽油劑量的增加,其作用效果越顯著,甚至優(yōu)于香菇多糖。

      表5 黃榆籽油對(duì)小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影響

      3 結(jié)論

      通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),超臨界二氧化碳萃取黃榆籽油的最佳工藝為萃取壓力30 MPa、萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間120 min,在此條件下黃榆籽油油萃取率為45.26%。

      對(duì)萃取的黃榆籽油進(jìn)行理化實(shí)驗(yàn)分析,酸價(jià)為3 mgKOH/g、過氧化值為0.052 g/100 g、碘值為7.8 gI/100 g、皂化值為300 mg/g、水分及揮發(fā)物含量為3.51 g/100 g。本試驗(yàn)測(cè)得的油脂的各項(xiàng)指標(biāo)均在食用油標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi),所以黃榆籽可以作為開發(fā)食用油的新食品原料。

      與對(duì)照組相比,黃榆籽油高劑量組可顯著延長小鼠游泳時(shí)間(P<0.05),降低BUN、LA含量(P<0.05),并提高LG含量(P<0.05);同時(shí),顯著提高SOD、GSH-Px活力(P<0.05或P<0.01),降低MDA水平(P<0.01)。表明黃榆籽油具有良好的抗疲勞、抗氧化活性,且其活性與黃榆籽油劑量呈正相關(guān),達(dá)到高劑量組時(shí)活性最強(qiáng)。

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