胃爾康改善腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)人胃上皮GES-1細胞炎癥和腸化的研究

懷佳萍 陳燕萍 丁進 葉曉華 陳躍華*

胃黏膜腸上皮化生（IM）是從慢性胃炎、萎縮到異型增生、腺癌的胃癌級聯(lián)反應(yīng)過程的中間階段，是胃的癌前病變［1］。目前已有研究表明IM與胃癌的發(fā)病呈正相關(guān)［2］。MUC2是一種分泌型黏蛋白，在正常胃黏膜中不表達，但在腸化的胃黏膜中表達。SOX2是胃特異性轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎干細胞的分化、形態(tài)改變具有重要意義，在消化道腫瘤如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等中均有異常表達。在IM過程中，MUC2表達量呈逐漸增多趨勢，而SOX2表達則逐漸減少［3］。已有學(xué)者證實胃爾康能降低實驗性大鼠胃癌前病變的發(fā)生率。本實驗通過體外炎癥細胞模型的建立，觀察胃爾康對MUC2和SOX2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）細胞來源：由源培生物細胞庫提供人胃黏膜上皮細胞系GES-1，用含10%血清白蛋白1640培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）藥物：胃爾康成分為黨參、天花粉、烏梅、五味子、山楂、木香、馬錢子粉等，由浙江家和制藥有限公司提供（國藥準(zhǔn)字Z10970120），以PBS溶解成濃度為16 mg/ml的母液待用。人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購于Peprotech公司，配置母液濃度為1 mg/ml備用。

1.2 方法 （1）分組：本實驗分為四組：空白組（GES-1）、對照組（GES-1+PBS溶液）、模型組（GES-1+TNF-α）、治療組（GES-1+ TNF-α+胃爾康）。其中模型組在TNF-α溶液刺激下培養(yǎng)24 h，治療組則在TNF-α溶液刺激8 h后再加入胃爾康溶液培養(yǎng)16 h。（2）細胞增殖抑制試驗（MTT還原法）：在96孔細胞培養(yǎng)板（5000個細胞/孔）中接種GES-1細胞，經(jīng)過24 h常規(guī)培養(yǎng)后，分別加入濃度為0、1、5、10 ng/μl的TNF-α溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束時每孔加入10 μl CCK-8，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測量各組在450 nm處吸光值。根據(jù)平均光密度（OD）計算細胞活力的百分比：細胞活力百分比=OD處理組/OD對照組100%。用同樣方法在GES-1細胞中分別加入濃度為0、10、20、40、80、160 μg/ml的胃爾康溶液，并計算細胞活力。實驗至少各重復(fù)3次。（3）IL-22含量測定：在6孔培養(yǎng)板中（5萬個/孔）接種GES-1細胞，根據(jù)MTT還原法確定TNF-α和胃爾康濃度對細胞進行相應(yīng)處理，細胞上清液中IL-22含量則由ELISA法測定。（4）MUC2和SOX2蛋白表達測定：在6孔培養(yǎng)板中（5萬個/孔）接種GES-1細胞，同理根據(jù)MTT還原法確定的TNF-α和胃爾康濃度對細胞進行相應(yīng)處理，用western blot法測定MUC2和SOX2蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT還原法結(jié)果 GES-1細胞分別加入不同濃度的TNF-α刺激后，細胞活性無明顯變化，即不同濃度TNF-α對細胞無明顯損害，亦無促細胞增長作用，故后續(xù)實驗選擇5 ng/ml濃度進行。不同濃度胃爾康刺激后與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故選擇對細胞既無明顯抑制也無促進作用的濃度40 μg/ml作為后續(xù)實驗濃度。

2.2 胃爾康治療后GES-1細胞形態(tài)學(xué)變化 空白組和對照組GES-1細胞生長良好，多數(shù)呈圓梭形，大小一致，核圓，呈小島狀生長，逐漸擴大成片，均貼壁生長，多為不規(guī)則的多角形（見圖1A、B）。模型組加入TNF-α培養(yǎng)后表現(xiàn)為細胞變圓，邊界不清，腫脹，間隙增寬，呈分枝狀、核質(zhì)融合狀態(tài)，圓形漂浮細胞和細胞碎片增多（見圖1C）。治療組加入胃爾康后GES-1表現(xiàn)為貼壁細胞逐漸增多，細胞形態(tài)逐漸復(fù)原（見圖1D）。

圖1 各組GES-1細胞生長狀態(tài)和形態(tài)顯微鏡下改變（×200）

2.3 各組IL-22含量比較 見表1。

表1 各組IL-22含量比較（±s）

表1 各組IL-22含量比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 n IL-22（pg/ml）空白組 12 55.9±16.4對照組 12 58.1±9.8模型組 12 86.5±13.9*治療組 12 67.8±11.0#

2.4 MUC2和SOX2蛋白表達 本實驗中空白組灰度值默認為1，以此得出相應(yīng)對照組、模型組和治療組的灰度值。結(jié)果顯示對照組中MUC2和SOX2蛋白表達與空白組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，模型組中MUC2蛋白含量明顯升高，通過胃爾康治療后MUC2蛋白表達有所下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而模型組中SOX2蛋白表達明顯少于對照組，治療組中則有所升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖2。

表2 各組MUC2和SOX2蛋白比較（±s）

表2 各組MUC2和SOX2蛋白比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別 n MUC2 SOX2空白組 12 1 1對照組 12 1.12±0.33 1.06±0.40模型組 12 2.60±0.28* 0.48±0.29*治療組 12 1.59±0.15# 0.74±0.31#

圖2 各組中MUC2和SOX2蛋白表達

3 討論

每年全球有近80萬患者因胃癌死亡，其中約50%患者來自中國［4］。IM與胃癌發(fā)生率密切相關(guān)這一觀點已被大量研究證實，而慢性萎縮性胃炎合并IM已被WHO定義為胃癌前期狀態(tài)。但已有學(xué)者證實IM具有潛在的可逆性，在特定的情況下是可以被清除或逆轉(zhuǎn)的［5］，因IM是機體對環(huán)境變化做出的一種適應(yīng)性改變，其能隨環(huán)境改變而變化。

目前采用中醫(yī)藥治療慢性萎縮性胃炎取得一定成績，不僅能改善癥狀，且能減輕病理炎癥反應(yīng)［6］。IM屬于中醫(yī)學(xué)理論中“胃脘痛”“胃痞”等范疇，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)加味香砂六君子湯對慢性萎縮性胃炎有較好療效，能減輕胃黏膜萎縮，部分逆轉(zhuǎn)腸化生情況［7］。胃爾康有益氣健脾、滋肝補腎、清熱解毒作用，能有效治療慢性萎縮性胃炎脾胃陰虛證者［8］，治療總有效率>95%，并能部分逆轉(zhuǎn)IM及不典型增生。IL-22在人體內(nèi)主要是由Th1、Th17、Th22等活化CD4+T細胞所分泌，能有效緩解炎性疾病中相關(guān)炎癥反應(yīng)，但IL-22又能促進增殖和抗凋亡為主的疾病的發(fā)生發(fā)展［9］。徐芳媛等［10］發(fā)現(xiàn)在胃癌惡性轉(zhuǎn)化過程中，存在IL-22自分泌現(xiàn)象，且在慢性胃炎經(jīng)胃癌前病變至胃癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中IL-22表達量逐漸升高。本資料結(jié)果顯示，模型組與對照組比較IL-22水平顯著增高，胃爾康干預(yù)后IL-22水平顯著降低，提示胃爾康通過抑制炎癥因子IL-22的釋放，從而減輕機體組織炎癥反應(yīng)。

IM是指正常胃黏膜被上皮樣腸黏膜所取代的形態(tài)學(xué)改變。慢性萎縮性胃炎合并IM已被歸納為胃癌癌前病變，在IM中估計每年有0.13%～0.25%患者存在胃癌風(fēng)險［11］。MUC2是一種高分子量糖蛋白，廣泛存在于人體管腔器官上皮細胞中，其表達量的變化與細胞分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。研究指出，MUC2大量表達于腸上皮胃黏膜的杯狀細胞中，而在正常胃黏膜細胞中不表達，其在胃癌組織中陽性表達率51.4%，因此，MUC2黏蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。SOX2與胃黏膜分化發(fā)育和表型有一定相關(guān)性，已有研究表明，SOX2表達情況與胃癌侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或淋巴管浸潤存在相關(guān)性。亦有多項研究報道，SOX2異常表達于結(jié)直腸癌組織中［12］。本實驗中檢測GES-1細胞中MUC2和SOX2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后GES-1細胞MUC2表達明顯升高，而SOX2表達下降。通過胃爾康治療后，MUC2表達下降，同時SOX2的表達上升，表明胃爾康可能在一定程度上能逆轉(zhuǎn)IM的發(fā)展。莫耘松等［13］發(fā)現(xiàn)胃爾康能改善慢性萎縮性胃炎患者免疫功能。陳芝蕓等［14］動物實驗亦發(fā)現(xiàn)胃爾康對實驗性大鼠胃黏膜萎縮有顯著改善作用。這些研究均與本資料結(jié)果相一致。綜上所述，胃爾康可能是通過下調(diào)MUC2表達和上調(diào)SOX2表達來改善甚至逆轉(zhuǎn)IM進程，這也可能是胃爾康在治療慢性胃炎方面的分子生物學(xué)機制之一。