骨碎補在骨重建中作用的研究進展

范佳俊 陳烽 高威 陳哲*

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（陳哲）

骨碎補為槲蕨科槲蕨屬植物的干燥根莖，味苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎強骨、續(xù)傷止痛、活血散瘀的功效。自古在中醫(yī)廣泛用于治療跌撲閃挫、筋骨折傷、骨質(zhì)缺損、牙齒松動等癥。骨骼作為動態(tài)的活性組織，通過持續(xù)舊骨吸收和新骨形成修復(fù)損傷、維持自身完整的生理結(jié)構(gòu)及骨量平衡的過程稱為骨重建。現(xiàn)代中醫(yī)研究及西醫(yī)臨床研究已經(jīng)證明骨碎補在骨質(zhì)疏松及骨折愈合中促骨形成的骨重建作用。柚皮苷是骨碎補的主要活性成分［1］，是經(jīng)提煉、純化得到的一種單體物質(zhì)。其傳承骨碎補的藥用價值，在西醫(yī)基礎(chǔ)研究中展現(xiàn)出在骨缺損修復(fù)重建方面的潛力。

1 中醫(yī)研究現(xiàn)狀

從《黃帝內(nèi)經(jīng)》的“腎主骨”之說，到《素問》指出的“腎之和骨也，主骨生髓，在體為骨。腎者，精之所處，其充在骨”。中醫(yī)學(xué)歷來認(rèn)為“腎藏精，主骨生髓，滋養(yǎng)骨骼，骨的生成需要腎氣推動、腎精滋養(yǎng)”。骨碎補屬于補腎強骨、益精補髓的中藥，《本草新編》曰“入骨，用之以補接傷碎最神”。馬曉飛等［2］對97例患者應(yīng)用以骨碎補為君藥的活血益骨湯進行脊柱骨折術(shù)后促骨折愈合的治療，實驗組患者在緩解術(shù)后骨折部位疼痛及骨折愈合方面的有效率較對照組提高15%。王寶峰［3］對93例患者應(yīng)用以骨碎補為君藥的健骨益腎方，對脊柱骨折行手術(shù)加藥物的聯(lián)合治療，健骨益腎方可顯著提升患者血清骨鈣素、堿性磷酸酶水平，改善視覺模擬評分（VAS）及Oswestry功能障礙指數(shù)（ODI評分），促進骨折愈合。關(guān)一等［4］報道椎弓根螺釘內(nèi)固定聯(lián)合加味復(fù)元活血湯治療胸腰椎骨折，患者住院時間更少、骨折愈合時間明顯縮短，術(shù)后隨訪顯示遠期療效可靠、持久、安全。陳勍等［5］使用強骨飲對120例股骨粗隆間骨折術(shù)后患者進行骨重建治療，隨訪顯示實驗組患者對側(cè)股骨粗隆再發(fā)骨折發(fā)生率明顯下降，有效降低骨折風(fēng)險。

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)屬“骨痿”范疇?！杜R證指南醫(yī)案·瘺》指出：“腎藏精，精生血，血虛則筋骨失養(yǎng)”。腎精虧損，則骨骼失其所養(yǎng)，髓虛而骨枯，然發(fā)骨病，發(fā)為骨痿?！端貑枴ゐ粽撈吩疲骸澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”?！澳I者，水臟也。金水不能勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要與腎臟的盛衰有關(guān)。多因腎虛、氣血瘀滯導(dǎo)致，腎虛為發(fā)病之本，血瘀為發(fā)病之標(biāo)，可以采用“補腎填精”的方法治療骨質(zhì)疏松患者。段曉棟［6］應(yīng)用益腎壯骨湯，方中以骨碎補補腎活血、止痛續(xù)傷為君藥，對患者行抗骨質(zhì)疏松治療，治療后患者骨密度明顯提升。強骨飲方中以骨碎補主補腎強骨，輔以其他藥物活血通絡(luò)、補益氣血，應(yīng)用于抗骨質(zhì)疏松治療中，有降低骨吸收率［7］、改善骨密度、緩解骨質(zhì)疏松性疼痛等作用［8］。

2 西醫(yī)研究現(xiàn)狀

2.1 西醫(yī)臨床研究 骨折是常見的骨科疾病，骨折延遲愈合、骨不連是其嚴(yán)重并發(fā)癥［9］。MILLS等［10］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年每1000例人口中會有23.2例發(fā)生骨折事件，骨折后發(fā)生不愈合風(fēng)險為1.9%。骨不連發(fā)生率及數(shù)量在不同年齡、性別及骨折部位間存在明顯差異，有向年輕化發(fā)展的不良趨勢。葉靈超等［11］對108例骨折延遲愈合患者行骨碎補注射液肌注治療，實驗組患者血清中堿性磷酸酶、神經(jīng)生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2水平治療后顯著提升，與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時骨折延遲愈合患者的治療有效率也顯著提升。

骨質(zhì)疏松癥常發(fā)生于中老年人，特點是骨微結(jié)構(gòu)破壞，骨密度和質(zhì)量下降，骨脆性增加。骨碎補在西醫(yī)臨床上已被制作成成品藥物強骨膠囊廣泛使用。秦礎(chǔ)強等［12］使用強骨膠囊治療慢性阻塞性肺疾病合并骨質(zhì)疏松癥患者，治療后患者L1～4椎體及左側(cè)股骨頸骨密度得到提升，軀體疼痛VAS評分及ODI評分明顯改善。調(diào)查研究顯示［13］，我國中老年人骨質(zhì)疏松癥總體患病率約23%，其中男性患病率約16%，女性在絕經(jīng)后骨質(zhì)流失率是男性的2～10倍［14］，患病率約27%。長期骨質(zhì)疏松且不加以骨重建干預(yù)，最終會引起骨質(zhì)疏松性骨折，尤其是髖部骨折和椎骨骨折，是導(dǎo)致老年人殘疾、死亡的重要原因［15］。在治療骨質(zhì)疏松性椎體骨折患者的策略上，經(jīng)皮椎體成形術(shù)（PVP）被認(rèn)為是一種見效快、風(fēng)險小、患者滿意度高的微創(chuàng)手段［16］。但從遠期療效考慮，抗骨質(zhì)疏松治療是更為重要的后續(xù)保障。謝占成［17］對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折PVP術(shù)后患者使用強骨膠囊進行抗骨質(zhì)疏松治療，治療6個月后患者髖部及腰椎骨密度明顯提升，血清鈣、磷含量下降，堿性磷酸酶水平上升，PVP術(shù)后患者軀體疼痛癥狀進一步獲得改善。老年患者長期使用骨碎補并未出現(xiàn)肝、腎功能異常，同時藥物不良反應(yīng)發(fā)生率低，表現(xiàn)出強骨膠囊優(yōu)異的安全性。此外，薈萃分析顯示強骨膠囊擁有不亞于常規(guī)藥物如：活性維生素D3、阿侖磷酸鈉、鈣爾奇D、雌激素、骨化三醇膠丸等抗骨質(zhì)疏松療效，且安全性更佳［18］。

2.2 西醫(yī)基礎(chǔ)研究 （1）柚皮苷對骨髓間充質(zhì)干細胞作用：柚皮苷是骨碎補的主要活性成分，是經(jīng)提煉、純化后得到的一種單體物質(zhì)。柚皮苷可以通過促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、成骨分化，促進成骨細胞增殖、分化、礦化參與骨形成，抑制破骨細胞活性并減少骨吸收［19］。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是存在于骨髓基質(zhì)中具有分化為成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞等多種細胞亞群的干細胞。BMSCs在體內(nèi)增殖并分化形成骨骼的能力使其成為再生醫(yī)學(xué)中重建骨骼的一種極具研究潛力的細胞［20］?，F(xiàn)階段對于BMSCs的研究主要細胞實驗中進行，1～100 μg/ml的柚皮苷溶液干預(yù)能增強人BMSCs的增殖，通過激活ERK信號通路，促進成骨相關(guān)標(biāo)志物（ALP、Runx2、Osterix、骨鈣素和I型膠原蛋白）表達［21］，促進BMSCs成骨分化，加速礦物質(zhì)積累，誘導(dǎo)鈣結(jié)節(jié)形成，濃度>200 μg/ml可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用［22］。對于不同來源的BMSCs，柚皮苷的效應(yīng)濃度也不盡相同。在大鼠BMSCs中，最佳濃度為10-5～10-6mol/L［23］，柚皮苷上調(diào)β-catenin、LRP5、Runx2及Osterix等相關(guān)蛋白的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進成骨分化［24］。MAPK、ERK、Notch、IHH以及JNK信號通路等也可能參與其中［25］。在兔BMSCs中柚皮苷效應(yīng)濃度<10-4mol/L［26］，在犬BMSCs中為10-6～10-7mol/L［27］，均促進BMSCs成骨分化和鈣鹽沉積，還有學(xué)者認(rèn)為柚皮苷的有效作用濃度在10-9～10-4mol/L［28］。（2）柚皮苷對成骨細胞作用：成骨細胞是由骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來。成熟后的成骨細胞呈單層排列覆蓋于骨表面，分泌骨膠原，合成骨基質(zhì)，釋放鈣離子使骨組織鈣化，直接影響著骨的形成和重建。細胞實驗中，柚皮苷作用下培養(yǎng)原代成骨細胞，測量顯示堿性磷酸酶活性增高，成骨細胞數(shù)量增多，骨鈣素、骨橋蛋白分泌增多，茜素紅染色可見鈣化結(jié)節(jié)形成［29］。徐高麗等［30］發(fā)現(xiàn)柚皮苷在促進成骨細胞增殖的同時，也增強其分泌I型膠原蛋白。有研究認(rèn)為，這可能與柚皮苷激活PI3K/Akt、ERK1/2信號通路，縮短成骨細胞增殖的細胞周期時間，同時使處于S期的細胞比例增高，處于凋亡期的比例下降［31］。翟遠坤等［32］認(rèn)為柚皮苷也通過雌激素信號通路，促進成骨相關(guān)因子如：堿性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、Runx2、Osterix和雌激素受體（ER）ERα及βmRNA的表達，增強成骨細胞促骨形成作用。KUANG等［33］研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷在激活A(yù)kt信號通路促進成骨細胞和骨細胞增殖同時，還可以抑制Bad信號通路抑制骨細胞凋亡和破骨細胞生成。AMPK信號通路亦可能與之有關(guān)［34］。柚皮苷對成骨細胞的作用同樣存在濃度依賴性，濃度范圍從10～1000 μmmol/L，對成骨細胞增殖作用先增強后減弱，100 μmmol/L是最佳作用濃度也被眾多研究認(rèn)同和采用［30］。動物實驗中，袁毅等［35］應(yīng)用柚皮苷治療大鼠股骨骨折，Micro-CT結(jié)果顯示骨折斷端由近到遠5 mm范圍內(nèi)骨礦物質(zhì)含量、骨體積分?jǐn)?shù)明顯增高，DR片檢查顯示柚皮苷組大鼠股骨骨折線消失更早，斷端骨痂生長速度更快，骨愈合所需時間明顯縮短。孫道喜［36］用不同濃度柚皮苷治療骨質(zhì)疏松性骨折大鼠發(fā)現(xiàn)，1～100 mg/kg柚皮苷呈劑量依賴性促進骨折區(qū)成骨細胞增殖、分化，加速原始骨小梁向成熟骨小梁改建，最大程度恢復(fù)骨質(zhì)疏松性骨折骨痂的最大載荷。WANG等［37］用柚皮苷治療去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠，測量小鼠股骨遠端、脛骨近端和腰1椎體三處骨密度均顯示小鼠骨密度明顯改善，阻斷小鼠骨骼生物力學(xué)骨強度的下降。黃俊波等［38］用柚皮苷治療兔雙側(cè)股骨髁間窩骨軟骨缺損，治療6個月后可見新生軟骨完全覆蓋缺損并與周圍正常軟骨組織產(chǎn)生融合，缺損處組織中II型膠原蛋白表達量明顯增高。張鏑等［39］研究亦證實柚皮苷能促進大鼠股骨干骨缺損的修復(fù)重建。（3）柚皮苷對破骨細胞作用：破骨細胞在人體主要發(fā)揮骨吸收功能，與成骨細胞功能相對應(yīng)。破骨細胞的活性決定骨的凈流失量。RANK/RANKL/OPG軸是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的重要信號通路，對破骨細胞的影響尤為重要。RANK表達于破骨細胞表面，RANKL與之結(jié)合可以觸發(fā)TRAF6，隨后激活下游NF-κB和MAPKs信號通路，改變c-fos、NFATc1和c-Jun的表達，促進破骨細胞及其前體細胞的分化與形成［40］。OPG可通過占位效應(yīng)阻止RANKL與RANK結(jié)合，防止骨的過度吸收。細胞實驗中，由RANKL誘導(dǎo)單核細胞（RAW264.7）分化為成熟破骨細胞的過程中，柚皮苷通過下調(diào)RANK、TRAP、NFATc1的表達，上調(diào)c-fos的表達，抑制破骨細胞增殖、分化及骨吸收功能，使破骨細胞在薄骨片上的骨吸收陷窩數(shù)及吸收總面積大幅下降［41］。ANG等［42］報道，柚皮苷還可以抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB和ERK的活化，進而抑制破骨細胞的形成和骨吸收功能。且破骨細胞與成骨細胞也存在微妙的關(guān)系，當(dāng)破骨細胞分泌的RANK與成骨細胞表面RANKL相結(jié)合，可以觸發(fā)RANKL反向信號傳導(dǎo)激活Runx2，從而激活成骨細胞功能促進骨形成［43］。XU等［44］發(fā)現(xiàn)在100 mg/L的濃度下柚皮苷可以發(fā)揮最佳效應(yīng)，通過上調(diào)OPG表達，使OPG/RANKL比例增加，從而抑制破骨細胞增殖及分化。同時，成骨細胞分泌的OPG也可以反作用于破骨細胞，抑制其骨吸收功能。此外，柚皮苷還通過激活線粒體凋亡途徑促進破骨細胞凋亡［45］。動物實驗中，李念虎等［46］研究報道，全關(guān)節(jié)置換術(shù)后骨組織與內(nèi)植物之間產(chǎn)生的磨屑會引起假體周圍骨溶解及骨丟失，最終導(dǎo)致內(nèi)植物松動關(guān)節(jié)置換失敗。采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）顆粒模擬碎屑，誘發(fā)小鼠模型中破骨細胞性骨溶解，并使用150 mg/kg劑量柚皮苷治療。柚皮苷治療組明顯降低模型中TRAP（+）破骨細胞數(shù)量，減少1.5倍的鈣釋放及22%的骨膠原丟失。徐展望等［47］也采用柚皮苷治療PMMA顆粒誘發(fā)的小鼠膝釘模型的骨吸收，發(fā)現(xiàn)柚皮苷治療組脛骨近端植入釘周圍單位體積內(nèi)骨量是對照組的3倍，拔出植入釘?shù)钠骄缑婕袅Ψ迨菍φ战M的2.5倍。（4）柚皮苷與生物材料的結(jié)合應(yīng)用： 柚皮苷在臨床中應(yīng)用不僅僅是其本身的單獨應(yīng)用，還有以各種支架材料作為載體的結(jié)合應(yīng)用。LAI等［48］設(shè)計制造的具有生物活性的鈦基生物材料TiO2納米管可以做到可控的緩釋柚皮苷，使柚皮苷對局部促骨形成作用保持在一個最佳濃度范圍及持久的作用時間。CHEN等［49］發(fā)現(xiàn)由明膠、β-磷酸三鈣、磷酸和柚皮苷組成的GGTN復(fù)合材料在骨移植中展現(xiàn)出較好的骨缺損修復(fù)能力，兔顱骨缺損區(qū)有大量新骨長入。WONG等［50］發(fā)現(xiàn)柚皮苷聯(lián)合膠原蛋白基質(zhì)作兔顱骨缺損骨移植，其移植后骨形成效果優(yōu)于自體骨及單純膠原蛋白基質(zhì)。

3 展望

不管是在中醫(yī)臨床上作為君藥配伍其他藥材組合為湯劑，還是西醫(yī)臨床上的成品藥物強骨膠囊，骨碎補已被廣泛應(yīng)用并展現(xiàn)其抗骨質(zhì)疏松和促骨折愈合的骨重建作用。骨碎補在骨重建過程中發(fā)揮著促骨形成，抑制骨吸收的總體效應(yīng)。鑒于骨碎補在基礎(chǔ)研究中被發(fā)掘出來的骨缺損修復(fù)重建的潛力，以后可能應(yīng)用于大段骨缺損修復(fù)。現(xiàn)有研究中，作為復(fù)合材料的膠原蛋白基質(zhì)降解過快，無法匹配新生骨爬行替代的速率；GGTN可能存在生物相容性問題；TiO2納米管由于鈦的天然生物惰性，實現(xiàn)早期骨整合是其缺陷。因此，為了更好發(fā)揮骨碎補的骨重建特性，兼具生物相容性、植入安全性及合適降解速率的生物材料支架將是下一步研究的重點。