腸道病毒71型感染手足口病患兒血清Th17 Treg細(xì)胞表達(dá)與病情程度相關(guān)性及預(yù)后評(píng)估

富凡春 陸許貞 沈亞 王柯尹 富馮峰

手足口?。℉FMD）是一種多發(fā)于<5歲兒童的常見(jiàn)傳染病，主要是由腸道病毒71型（EV-A71）和柯薩奇A組16型（CV-A16）病毒感染引起，重癥患者病死率高［1］，嚴(yán)重危害兒童的身體健康。HFMD發(fā)病機(jī)制主要為，EV-A71或CV-A16病毒與感染者咽部及腸道上皮表面SCARB2和PSGL-1受體結(jié)合，經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入上皮細(xì)胞，入侵人體各個(gè)系統(tǒng)，引發(fā)組織和器官炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表現(xiàn)［2］。研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群參與HFMD病情發(fā)展及預(yù)后［3］。Th17細(xì)胞是一種可分泌白介素17（IL-17）的T細(xì)胞亞群，在機(jī)體自身免疫反應(yīng)和防御反應(yīng)中起重要作用。Treg細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫反應(yīng)的細(xì)胞，其功能異常可引起自身免疫性疾?。?］。本文探討Th17和Treg細(xì)胞在HFMD患兒血清中的表達(dá)情況，并分析其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年3月本院確診HFMD患兒80例，HFMD診斷參照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的手足口病診療指南（2018年版）［5］。根據(jù)此指南將患兒分為輕癥組42例，重癥組38例。輕癥組患兒男22例，女20例，平均月齡（29.76±16.96）個(gè)月。重癥組患兒男21例，女17例，平均月齡（31.42±15.91）個(gè)月。選擇30例同期體檢健康患兒為對(duì)照組，其中男

17例，女13例，平均月齡（30.98±19.75）個(gè)月。各組患兒性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。對(duì)HFMD患兒進(jìn)行3個(gè)月隨訪(fǎng)，治療后體溫正常，皮疹減少或消失，無(wú)遺留后遺癥的76例患兒為預(yù)后良好組，存在后遺癥的4例患兒為預(yù)后不良組，其中1例為遺留斜視，3例為肢體肌力下降。入組患兒臨床表現(xiàn)和體征與手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)一致，咽拭子EV71特異性核酸檢測(cè)陽(yáng)性或血清EV71特異性IgM抗體陽(yáng)性。均排除有器質(zhì)性或免疫性疾病。

1.2 方法 所有HFMD患兒在入院第1天采集外周血2 ml，置入含有肝素的抗凝血管中，用于Th17和Treg細(xì)胞含量檢測(cè)。對(duì)照組體檢兒童外周血采集方法與HFMD患兒相同。（1）采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th17細(xì)胞含量。取2 ml抗凝全血，采用Ficoll密度梯度離心法分離患兒外周血單核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后將細(xì)胞的密度用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至2×106個(gè)/ml，取2 ml的細(xì)胞懸液加入至6孔板中，再加入1 μg/ml離子霉素、100 ng/ml的佛波酯和1 g/ml的莫能菌素刺激，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，收集細(xì)胞。用PBS重懸細(xì)胞，取100 μl的細(xì)胞懸液，加入CD3-PC抗體5 μl和CD8-FITC抗體5 μl，混勻后室溫避光靜置30 min，PBS洗1次，再加入100 μl破膜劑A，混勻后室溫避光靜置15 min，1500 r/min離心5 min，收集沉淀。PBS洗1次，加入10μl IL-17-PE抗體和100 μl破膜劑B，混勻后室溫靜置30 min，PBS洗2次。用500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD3+CD8-IL-17+Th17細(xì)胞的百分比。（2）采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞含量。取100 μl的抗凝全血加入至流式管中，再加入CD4-PE抗體5 μl和CD25-PC5抗體5 μl，混勻后室溫避光靜置15 min，PBS洗1次，再加入100 μl破膜劑A，混勻后室溫避光靜置15 min，1500 r/min離心5 min，收集沉淀。用3 ml Fix/Prem緩沖液洗1次。加入20 μl Foxp3 McAb-FITC和100 μl破膜劑B，混勻后室溫靜置20 min，加入3 ml Fix/Prem緩沖液，1500 r/min離心5 min，收集沉淀。用500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的百分比。對(duì)HFMD患兒進(jìn)行3個(gè)月隨訪(fǎng)，分析預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患兒出院前最后一次收集外周血中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，LSD多重比較；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用［n（%）］表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析Th17和Treg細(xì)胞含量與HFMD患兒病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，Rs值>0.7表示高度相關(guān)，0.4

2 結(jié)果

2.1 各組患兒Th17細(xì)胞含量比較 見(jiàn)圖1。

圖1 三組患兒CD3+ CD8- IL-17+ Th17細(xì)胞百分比比較

2.2 各組患兒Treg細(xì)胞含量比較 見(jiàn)圖2。

圖2 三組患兒CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg細(xì)胞百分比比較

2.3 各因子與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 Th17細(xì)胞百分比與病情嚴(yán)重程度呈中度正相關(guān)（Rs=0.489，P=0.009），Treg細(xì)胞百分比與病情嚴(yán)重程度呈低度負(fù)相關(guān)（Rs=-0.307，P=0.031）。見(jiàn)圖3。

圖3 Th17和Treg細(xì)胞含量與HFMD病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

2.4 不同預(yù)后患兒血清Th17細(xì)胞含量比較 見(jiàn)圖4。

2.5 不同預(yù)后患兒血清Treg細(xì)胞含量比較 見(jiàn)圖5。

圖4 CD3+ CD8-IL-17+ Th17細(xì)胞百分比與HFMD患兒預(yù)后關(guān)系

圖5 CD4+ CD25+ Foxp3+Treg細(xì)胞百分比與HFMD患兒預(yù)后的關(guān)系

3 討論

HFMD是一種全球性常見(jiàn)傳染病，好發(fā)于嬰幼兒，重癥病例患兒大多均由EV-A17病毒感染引起，HFMD重癥患兒的病情惡化迅速，其病死率高。因此早發(fā)現(xiàn)、早治療是挽救HFMD患兒生命的重要措施。HFMD患兒多伴隨免疫系統(tǒng)的功能紊亂，因此臨床對(duì)其治療，除抗病毒治療外，給予免疫調(diào)節(jié)性藥物常可顯著改善病情［6］。

Th17屬于T淋巴細(xì)胞亞群，是由CD4+T細(xì)胞在經(jīng)過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的刺激后分化形成的效應(yīng)T細(xì)胞，主要分泌致炎細(xì)胞因子IL-17，對(duì)于引發(fā)炎癥反應(yīng)具有關(guān)鍵性作用。本資料顯示，輕癥組和重癥組患兒血清Th17細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組，表明Th17細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而增加。此外，Spearman相關(guān)性分析顯示Th17細(xì)胞含量與病情嚴(yán)重程度呈中度正相關(guān)。提示Th17細(xì)胞在HFMD的發(fā)病過(guò)程中起促進(jìn)作用，這與何媛等［7］研究結(jié)果一致。推測(cè)Th17細(xì)胞在HFMD發(fā)病中的作用機(jī)制可能與其分泌的致炎因子IL-17密切相關(guān)，IL-17經(jīng)Th17細(xì)胞分泌后，進(jìn)一步激活T細(xì)胞，并刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子、IL-6等多種炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生［8］。IL-17還可與其受體結(jié)合，激活MAPK信號(hào)途徑及NF-B信號(hào)途徑引發(fā)炎癥。此外，IL-17還可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的動(dòng)員過(guò)程引發(fā)組織炎癥反應(yīng)。這些研究均表示Th17分泌的IL-17可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，本資料中Th17細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而增加，提示在HFMD病情發(fā)展過(guò)程中，由Th17細(xì)胞分泌的IL-17致炎因子誘導(dǎo)的一系列炎癥反應(yīng)可能在HFMD病情進(jìn)展過(guò)程中起重要作用，因此臨床在治療期間，除抗病毒治療外，還應(yīng)考慮抗炎治療，這與王佳［9］提出的HFMD治療方案一致。

Treg細(xì)胞屬于T淋巴細(xì)胞亞群，是由CD4+T細(xì)胞在經(jīng)過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的刺激后分化形成的效應(yīng)T細(xì)胞，主要執(zhí)行的是免疫抑制的效應(yīng)。本研究中與輕癥組和重癥組患兒血清Treg細(xì)胞百分比低于對(duì)照組，表明Treg細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而降低，這與以往研究結(jié)果一致［10］。此外，Spearman相關(guān)性分析顯示Treg細(xì)胞含量與病情嚴(yán)重程度呈低度負(fù)相關(guān)。Treg細(xì)胞主要通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)正常機(jī)體中自身反應(yīng)性T細(xì)胞的過(guò)度活化和增殖，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)，是維持機(jī)體免疫平衡的重要細(xì)胞。本資料中Treg細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而降低，提示在HFMD病情發(fā)展過(guò)程中，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的Treg細(xì)胞含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致免疫功能的紊亂。但Treg細(xì)胞含量降低的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死有密切關(guān)系，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本資料結(jié)果顯示，預(yù)后不良患兒血清中Th17細(xì)胞含量高于預(yù)后良好患兒，預(yù)后不良患兒血清中Treg細(xì)胞含量低于預(yù)后良好患兒，提示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞含量在評(píng)估HFMD的預(yù)后方面具有一定價(jià)值，當(dāng)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞含量未恢復(fù)至正常水平時(shí)，可能導(dǎo)致HFMD患兒預(yù)后不良。

綜上，外周血Th17細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而增加，與HFMD病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。外周血Treg細(xì)胞含量隨HFMD病情嚴(yán)重程度的增加而降低，與HFMD病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，與預(yù)后呈正相關(guān)。以Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞為靶點(diǎn)對(duì)HFMD的治療及預(yù)后評(píng)估具有重要的意義。