西羅莫司對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠外周血Treg/Th17細胞的影響*

榮愛梅，張 超，吳慧麗

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病與遺傳和胰島素抵抗相關(guān)[1]。NAFLD可逐漸發(fā)展為肝硬化。近年來，研究顯示NAFLD可能是肝細胞癌的潛在誘因[2]。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在特殊人群NAFLD發(fā)病率可達75%，已成為威脅公共健康安全的常見病[3]。西羅莫司屬免疫抑制劑。有基礎(chǔ)研究顯示西羅莫司有助于改善肝臟脂質(zhì)代謝[4]，但有關(guān)西羅莫司的臨床應(yīng)用尚存爭議。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T lymphocyte，Treg)/輔助性T細胞17(T help cell 17，Th17)在穩(wěn)定機體免疫功能和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，推測西羅莫司可能通過影響Treg/Th17比值進而影響NAFLD進展[5]。本研究應(yīng)用西羅莫司干預(yù)NAFLD模型大鼠，分析了其對動物外周血Treg/Th17比值的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 60只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量為150～200 g，平均為(175.4±24.2)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為對照組、模型組和西羅莫司干預(yù)組，每組20只。

1.2 NAFLD模型制備與處理 在西羅莫司干預(yù)組和模型組，給予高脂飲食喂養(yǎng)12 w，建立NAFLD動物模型。高質(zhì)飲食由80%普通飼料與20%高脂飼料混合構(gòu)成，其中80%普通飼料為小麥30%、玉米30%、魚粉10%、骨粉3%、豆粕7%；20%高脂飼料為膽固醇3%、豬油7%、蛋黃粉10%。在對照組大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng)14 w。在建模成功后，給予一組動物西羅莫司干預(yù)，即繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)2 w，同時給予西羅莫司(國藥準(zhǔn)字H20051140，福建科瑞藥業(yè)有限公司)1 mg.kg-1.d-1灌胃，連續(xù)干預(yù)2 w；在模型組，在建模成功后繼續(xù)給予高脂飲食喂養(yǎng)2 w。在實驗結(jié)束時，給予水合氯醛腹腔注射麻醉，取血后處死大鼠，摘取肝臟，行組織病理學(xué)檢查。

1.3 實驗室檢測 采用ELISA法檢測血清白介素-10(interleukin-10，IL-10)、IL-17和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；使用全自動生化分析儀(械注進20112400234)檢測肝功能和血脂血清生化指標(biāo)；使用FACSVia型流式細胞儀(械注進20172402482)檢測外周血Treg和Th17細胞百分比(福建三一造血技術(shù)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 三組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 見圖1。

圖1 三組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE，200×) A：西羅莫司干預(yù)組，可見少量肝血竇充血，肝細胞體積增大，脂肪變減輕；B：模型組可見肝細胞脂肪變性，肝細胞體積大小不等，部分肝竇充血；C：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞索排列整齊

2.2 三組肝功能指標(biāo)比較 干預(yù)后，西羅莫司干預(yù)組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 三組肝功能指標(biāo)比較

2.3 三組血脂指標(biāo)比較 干預(yù)后，西羅莫司干預(yù)組血清TC和LDL-C水平顯著低于模型組，而血清HDL-C水平顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.4 三組細胞因子水平比較 干預(yù)后，西羅莫司干預(yù)組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于模型組，而血清IL-10水平顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.5 三組外周血Treg/Th17細胞比較 干預(yù)后，西羅莫司干預(yù)組外周血Treg和Treg/Th17比值顯著高于模型組，Th17細胞百分比顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表2 三組血脂指標(biāo)比較

表3 三組細胞因子比較

表4 三組Treg/Th17細胞比較

3 討論

NAFLD發(fā)病機制尚未完全闡明。目前認(rèn)為，NAFLD的發(fā)生存在二次打擊學(xué)說，二次打擊不僅直接損壞肝組織，啟動和加快病變進程，還增加了肝細胞壞死凋亡的易感性，臨床多通過抑制炎癥反應(yīng)、改善肝纖維化及抗氧化應(yīng)激控制NAFLD進展[6，7]，但對NAFLD治療效果仍有限。如何改進NAFLD治療效果成為臨床和基礎(chǔ)實驗研究的重點。西羅莫司是首先由加拿大學(xué)者發(fā)現(xiàn)的免疫抑制劑，既往研究多用于器官移植和抗腫瘤治療[8，9]。有人發(fā)現(xiàn)西羅莫司可顯著改善肝脂肪變程度，可能為西羅莫司用于治療NAFLD提供了依據(jù)[10]。

研究認(rèn)為采取高脂飲食建立的NAFLD大鼠模型與人類NAFLD疾病極為相近[11]。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)12周的方法建立NAFLD大鼠模型，并給予西羅莫司平行對照干預(yù)，結(jié)果顯示干預(yù)后西羅莫司干預(yù)組動物血TG、TC和LDL-C水平顯著低于模型組，提示西羅莫司有助于改善NAFLD大鼠血脂水平。研究也發(fā)現(xiàn)西羅莫司能糾正胰島素受體底物1磷酸化進程，并阻斷膽固醇聚集，進而達到改善脂代謝水平的目的[12]。但臨床也有報道認(rèn)為西羅莫司可能通過抑制血脂降解過程誘發(fā)高脂血癥[13]，但其具體機制尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為對于肝功能穩(wěn)定期的患者，西羅莫司對血脂水平無顯著的影響[14]。

炎癥反應(yīng)與NAFLD病理進展關(guān)系密切。既往報道認(rèn)為炎癥可直接阻斷胰島素信號通路，并誘發(fā)肝纖維化，損傷肝內(nèi)皮細胞[15，16]。IL-10是機體抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)重要的細胞因子，可通過抑制單核巨噬細胞的激活達到抑制炎癥反應(yīng)和降低肝內(nèi)細胞浸潤的作用[17，18]。IL-17是含有155個氨基酸的促炎因子，通過刺激成纖維細胞，加快T細胞活化作用，促進肝損傷[19，20]。有研究結(jié)果顯示治療后對照組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于西羅莫司干預(yù)組和模型組，血清IL-10水平顯著高于西羅莫司干預(yù)組和模型組[21]，提示炎癥反應(yīng)參與了NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。本研究進一步對比三組SD大鼠干預(yù)后血清IL-10、IL-17和TNF-α水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西羅莫司干預(yù)組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于模型組，而血清IL-10水平顯著高于模型組，西羅莫司干預(yù)組與對照組之間無顯著性差異，提示西羅莫司可通過抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)了外周血Treg/Th17細胞失衡狀態(tài)，達到了改善NAFLD的作用。本研究也顯示干預(yù)后西羅莫司干預(yù)組外周血Treg細胞百分比和Treg/Th17細胞比值均顯著高于模型組，而Th17細胞顯著低于模型組，提示西羅莫司可能通過調(diào)節(jié)輔助T細胞失衡狀態(tài)，抑制NAFLD的病理學(xué)進展。

報道認(rèn)為西羅莫司可通過抑制CD36蛋白表達，減少大鼠肝臟對游離脂肪酸的攝取，進而改善肝臟脂質(zhì)聚集現(xiàn)象[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)束時，西羅莫司干預(yù)組血清AST和ALT水平顯著降低，提示該藥能降低NAFLD大鼠血清酶水平，具有保護肝功能的作用[22]。有人認(rèn)為維持4～8 ng/ml血藥濃度的西羅莫司比較安全，有助于保護肝功能[23]，但臨床也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用西羅莫司可能增加發(fā)生肝功能異常的風(fēng)險[24，25]，可能與應(yīng)用的西羅莫司劑量和樣本量差異有關(guān)，有關(guān)西羅莫司對肝功能的影響還有待今后進一步觀察和研究。