正交試驗(yàn)法優(yōu)化菱角多糖提取工藝

李嬌 劉悅 劉德江 張皓 孫宏萊 程海濤

摘要：菱角多糖具多種藥理活性。為了優(yōu)選出熱水浸提法提取菱角多糖的最佳工藝條件，本研究以菱角多糖的提取率為指標(biāo)，選取料液比、提取溫度、提取時(shí)間為影響因素，在綜合單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，采用苯酚—硫酸法測定多糖的含量。結(jié)果表明：多糖提取率隨料液比的增加，呈先升后降的趨勢，料液比為1：30時(shí)提取率最高，為2.72%；提取溫度為70℃時(shí)，多糖提取率最高，為2.96%；提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取率最高，為1.81%，之后提取率減少。綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到菱角多糖的最佳提取工藝為料液比1：30、溫度60℃、時(shí)間120 min。熱水浸提菱角多糖工藝操作簡便易行，具有實(shí)用價(jià)值，可依據(jù)該工藝條件制定菱角多糖提取工藝。

關(guān)鍵詞：菱角；多糖；正交試驗(yàn)

中圖分類號：S917.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號：cjas2020-0003

Orthogonal Test Method to Optimize Extraction Technology of Water Chestnut Polysaccharide

Li Jiao， Liu Yue， Liu Dejiang， Zhang Hao， Sun Honglai， Cheng Haitao

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi 154007， Heilongjiang， China）

Abstract： Water chestnut polysaccharide has a variety of pharmacological activities. In order to optimize the best process condition for extracting Trapa bispinosa polysaccharide by hot water extraction， in this study， the extraction rate of Trapa bispinosa polysaccharides is taken as an index， and the material-liquid ratio， extraction temperature and extraction time are selected as influencing factors. Based on the comprehensive single-factor experiment， the L9 （34） orthogonal experiment is used to optimize the process， and the phenol-sulfuric acid method is used to determine the polysaccharide content. The results show that the extraction rate of polysaccharide increases first and then decreases with the increase of the ratio of material to liquid. When the ratio of material to liquid is 1：30， the extraction rate is the highest （2.72%）. When the extraction temperature is 70℃， the extraction rate of polysaccharide is the highest （2.96%）. When the extraction time is 120 minutes， the extraction rate is the highest （1.81%）， and then the extraction rate decreased. Based on the above single factor test results， an orthogonal test is carried out， and the best extraction process for Trapa bispinosa polysaccharide is 1：30， the extraction temperature is 60℃， and the extraction time is 120 min. The extraction process of Trapa bispinosa polysaccharide by hot water extraction is simple and practical， and the process of extracting Trapa bispinosa polysaccharide can be formulated according to the process conditions.

Keywords： Trapa bispinosa； Polysaccharides； Orthogonal Test

0引言

菱角（Trapa bispinosa）為菱屬植物果實(shí)，菱屬植物是一種一年生浮葉水生草本植物，生長于熱帶和亞熱帶區(qū)域的淺水滯水區(qū)，廣泛分布在全國各地，其中東北地區(qū)和長江流域分布最多[1]。菱角中含有多種活性物質(zhì)，因此菱角提取物具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力等特性[2]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)許多植物[3]多糖具有免疫刺激作用，所以菱角多糖具有的免疫活性及抗氧化作用也引起了人們的廣泛關(guān)注[4-5]。尚慶坤等[6]第一次從菱角殼中提取到了4種多糖化合物，并確定了其單糖組成，分別是阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖。董向東等[7]、劉陽[8]均探究了菱角多糖的抗氧化活性，即進(jìn)行了羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)。

隨著分離分析及醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，人們越來越重視菱角藥用成分和生理活性的研究[9-11]，因此對這些成分的提取工藝研究也變得十分必要。劉陽等[12]比較了4種多糖純化方法對東北菱粗多糖的純化效果；劉冬敏等[13]采用超聲波輔助優(yōu)化了菱角殼中黃酮、總酚和皂苷的提取條件；侯莉莉等[14]采用響應(yīng)面法，優(yōu)化了菱角殼總黃酮的提取工藝；Raza等[15]采用超聲輔助響應(yīng)面法優(yōu)化了菱莖中多糖的提取條件，并測定了其抗氧化能力。綜上，對于菱角多糖水提工藝的研究還鮮有報(bào)道，為了更好地開發(fā)利用菱角中的多糖資源，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法確定了菱角中多糖提取的最優(yōu)水提工藝，為菱角中多糖的提取及其藥材資源開發(fā)提供參考。

1材料與設(shè)備

1.1材料與試劑

材料：實(shí)驗(yàn)所用菱角采集自黑龍江省哈爾濱市依蘭縣，將其干燥，粉碎待用。

試劑：無水乙醇，苯酚，濃硫酸。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備

UV-8000紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；JFSD-70實(shí)驗(yàn)室粉碎磨，上海嘉定糧油儀器有限公司；800Y全能小鋼磨，永康市鉑歐五金制品有限公司；FA2004電子天平，上海浦春計(jì)量儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；L-550臺式低速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取105℃恒重干燥2 h的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容后搖勻，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取濃度0.10 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞試管中，加水至2 mL，加入5%的苯酚試液1 mL、濃硫酸5 mL，立即振蕩混勻，沸水浴 20 min，冷水冷卻10 min，于490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如式（1）。

y=0.7915x+0.008R2=0.9967………………（1）

2.2樣品溶液含量的測定

將待測樣品稀釋10倍后，吸取2 mL，置于10 mL具塞試管中，再分別加入濃度5%的苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，立即振蕩混勻，反應(yīng)20 min，于490 nm處測定吸光度。

2.3多糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法[12]測定多糖含量，計(jì)算多糖提取率。多糖提取率的計(jì)算見公式（2）。

2.4熱水浸提單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1料液比的選擇稱取5份3.00 g菱角粉末，分別加入30、60、90、120、150 mL蒸餾水，即料液比分別為1：10、1：20、1：30、1：40、1：50。設(shè)置溫度60℃，提取時(shí)間120 min，提取1次，恒溫水浴浸提。將浸提液抽濾，離心（4000 r/min， 10 min），棄掉沉淀留取上清液，將其減壓濃縮至一定體積后，加入4倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉24 h，醇沉液離心（4000 r/min， 10 min），棄去上清液，用蒸餾水溶解沉淀，將其濃縮定容至50 mL待測。之后的實(shí)驗(yàn)步驟按照2.3進(jìn)行操作。

2.4.2提取溫度的選擇稱取5份3.00 g菱角粉末，加入90 mL蒸餾水，分別設(shè)置溫度40、50、60、70、80℃，提取時(shí)間120 min，提取1次，恒溫水浴浸提。將浸提液抽濾，離心（4000 r/min， 10 min），棄掉沉淀留取上清液，將其減壓濃縮至一定體積后，加入4倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉24 h，醇沉液離心（4000 r/min， 10 min），棄去上清液，用蒸餾水溶解沉淀，將其濃縮定容至50 mL待測。之后的實(shí)驗(yàn)步驟按照2.3進(jìn)行操作。

2.4.3提取時(shí)間的選擇稱取5份3.00 g菱角粉末，加入90 mL蒸餾水，分別設(shè)置時(shí)間60、90、120、150、180 min，提取溫度60℃，提取1次，恒溫水浴浸提。將浸提液抽濾，離心（4000 r/min， 10 min），棄掉沉淀留取上清液，將其減壓濃縮至一定體積后，加入4倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中醇沉24h，醇沉液離心（4000r/min， 10 min），棄去上清液，用蒸餾水溶解沉淀，將其濃縮定容至50 mL待測。之后的實(shí)驗(yàn)步驟按照2.3進(jìn)行操作。

2.5正交實(shí)驗(yàn)

2.5.1正交實(shí)驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，菱角多糖水提工藝采用三因素三水平設(shè)計(jì)，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）作為參考因素，按照L9（34）正交表進(jìn)行菱角多糖水提工藝正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)方案，見表1。

2.5.2樣品制備及指標(biāo)測定分別稱取菱角粉末3.00 g，按照正交設(shè)計(jì)表的各個(gè)因素水平進(jìn)行提取，每組實(shí)驗(yàn)1個(gè)平行，提取液濃縮定容至10 mL，80%醇沉，4℃冰箱中靜置過夜，醇沉液離心（4000 r/min， 10 min），棄去上清液，溶解沉淀，將其濃縮定容至50 mL，以下實(shí)驗(yàn)步驟按照2.1操作，計(jì)算多糖提取率。

2.6數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖，各提取條件平行測定1次。通過SPSS 21設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

3結(jié)果與分析

3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1料液比以料液比和多糖提取率制作曲線，見圖1。

從圖1可以看出，在5個(gè)不同料液比水平上，隨著料液比的增加多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在1：30處達(dá)到最高，表明料液比過高反而會增加耗能、降低菱角多糖提取率[16]，因此選取1：20、1：30、1：40作為正交實(shí)驗(yàn)中料液比的3個(gè)水平。

3.1.2提取溫度以提取溫度和多糖提取率制作曲線，見圖2。

從圖2可以看出，菱角中的多糖提取率于70℃時(shí)達(dá)到最高，之后開始下降，這一現(xiàn)象說明過高的提取溫度可能會導(dǎo)致多糖水解[17]，從而導(dǎo)致菱角多糖的提取率下降，因此選取60、70、80℃作為正交實(shí)驗(yàn)中提取溫度的3個(gè)水平。

3.1.3提取時(shí)間以提取時(shí)間和多糖提取率制作曲線，見圖3。

從圖3可以看出，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在120 min時(shí)多糖提取率最高，考慮到隨著時(shí)間的延長多糖會逐漸分解[18]，分別選取90、120、150 min作為正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的3個(gè)水平。

3.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

菱角多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果，見表2。

由表2的直觀分析結(jié)果可知，提取溫度對菱角多糖提取的影響最大，其次是料液比，提取時(shí)間的影響最小，即各因素對菱角多糖提取率的主次作用為B>A>C。由表2可得最優(yōu)組合為A2B1C2，即料液比1：30，提取溫度為60℃、提取120 min時(shí)，效果最佳。

4討論

4.1實(shí)驗(yàn)材料的選取

菱角在中國的栽培歷史悠久，它既可以生食、熟食，還可用于釀酒、入藥等。菱角中富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等多種活性物質(zhì)，具有廣泛的食用和藥用價(jià)值[19]。董向東等[7]以提取去殼菱角淀粉后的離心液為原料，采用蛋白酶酶解法制備多糖，優(yōu)化提取條件，其所用的菱角購自某菜市場，而非野生菱角，且該方法提取多糖較為繁瑣。牛鳳蘭等[20]采用硅膠柱層析法和高效液相色譜法，初步提取和分離了東北菱中的化學(xué)成分，但該研究的過程復(fù)雜冗長，且需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)。

4.2影響因素的選取

天然糖類常用的提取方法包括熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法和生物酶輔助提取法等[21-23]，其中熱水浸提法是傳統(tǒng)的糖類提取方法，相較于其他3種方法，操作更為簡單安全。本實(shí)驗(yàn)基于正交實(shí)驗(yàn)法熱水浸提菱角多糖，選取了對水提多糖影響較大的料液比、提取溫度、提取時(shí)間為影響因素，進(jìn)行工藝優(yōu)化。尚慶坤等[6]對菱角多糖進(jìn)行了提取和結(jié)構(gòu)分析，但未對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。侯莉莉等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了菱角殼總黃酮的提取工藝，但沒有對菱角多糖水提工藝進(jìn)行優(yōu)化。王鑫[24]以出膏率為指標(biāo)，加入生物酶輔助提取法，優(yōu)化了菱角殼水提物的提取工藝，得到菱角殼水提物的最佳提取率為0.175%，與本實(shí)驗(yàn)的最佳提取率3.79%差距較大的可能原因有2個(gè)：一是菱角的來源不同，且前者使用的是菱角殼，未使用菱角果肉；二是前者計(jì)算的是總糖減去還原糖之后的菱角總糖，而本實(shí)驗(yàn)計(jì)算的是菱角粗多糖。任思堂[25]以菱角多糖提取率為指標(biāo)，討論了溫度、提取時(shí)間、加水量及pH對菱角多糖提取率的影響程度，并確定了最佳的提取工藝，即溫度80℃、加水量25倍、pH 7、時(shí)間4 h、提取3次。其中，加水量與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，造成提取溫度和提取時(shí)間與本實(shí)驗(yàn)存在差異的可能原因，除了實(shí)驗(yàn)材料的來源大不相同外，也可能是菱角所處的生長時(shí)期以及實(shí)驗(yàn)條件的差異所致。另外，本實(shí)驗(yàn)未探究提取次數(shù)和pH對菱角多糖提取率的影響，因此，在今后的研究中可以探究這2個(gè)因素對菱角多糖提取率的影響。

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化植物多糖提取工藝的研究已經(jīng)有過很多報(bào)道[26-28]，但對于水生植物多糖水提工藝優(yōu)化的研究還很少。近年來，菱角中生物活性的功能性作用受到了越來越廣泛的關(guān)注。菱角多糖水提工藝的優(yōu)化，為其臨床研究提供了更有力的保證，但是本實(shí)驗(yàn)只提取了菱角中的多糖成分，之后還可對菱角中的成分進(jìn)行分離鑒定，同時(shí)對菱角中代謝物的差異性進(jìn)行分析，為菱的種質(zhì)資源保護(hù)及功能性資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

5結(jié)論

多糖的提取效率與提取方法、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、設(shè)備、材料粉碎度等因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選取了對多糖得率影響較大的料液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素，通過單因素實(shí)驗(yàn)比較了這3個(gè)因素對菱角多糖提取率的影響，然后采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出了最佳的水提工藝，結(jié)果表明：在60℃提取溫度、料液比為1： 30、提取120 min時(shí)，菱角多糖的提取率最高，為3.79%。該提取工藝操作簡便易行，粗多糖得率高，穩(wěn)定性好，提高了菱角多糖的經(jīng)濟(jì)和綜合開發(fā)價(jià)值，也為進(jìn)一步開發(fā)及利用菱角多糖提供了科學(xué)依據(jù)。

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