殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制

藍(lán)蔚青，楊 歆，王 蒙，梅 俊，謝 晶

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院// 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心// 3.食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

水產(chǎn)品在貯藏期間，微生物是導(dǎo)致其腐敗的主因[1]。微生物種群發(fā)生群落演替，其中部分優(yōu)勢(shì)菌起主導(dǎo)作用，產(chǎn)生腐敗臭味和異味等代謝產(chǎn)物，稱(chēng)之為該類(lèi)水產(chǎn)品的特定腐敗菌（Specific Spoilage Organism，SSO）[2]。SSO 具有調(diào)節(jié)和代謝產(chǎn)生一系列化合物與生物活性物質(zhì)的能力，還可能含有從魚(yú)體內(nèi)非蛋白氮衍生出的各種有機(jī)揮發(fā)性化合物（volatile organic compounds，VOCs），產(chǎn)生異味，影響產(chǎn)品的感官、質(zhì)地與新鮮度[3-4]。腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）為革蘭陽(yáng)性菌，是大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）貯藏后期的SSO，能分泌蛋白酶與脂肪酶，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解與脂質(zhì)氧化，影響其品質(zhì)[5-6]。目前有部分學(xué)者開(kāi)展了對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)理分析，如蘇萌萌等[7]研究得出綠原素能使腐生葡萄球菌細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致膜電位變化，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；朱亞珠等[8]發(fā)現(xiàn)山梨酸鉀、異抗壞血酸鈉與雙乙酸鈉復(fù)合保鮮劑能明顯抑制腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)速率，導(dǎo)致菌體核酸與蛋白質(zhì)外泄。本課題組前期在生物保鮮劑對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制方面也開(kāi)展了部分研究工作[9-11]。

殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子多糖，是甲殼質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物。其無(wú)毒、抗菌活性、可生物降解性和生物相容性、成膜性等優(yōu)勢(shì)能夠提高產(chǎn)品的綜合品質(zhì)，延長(zhǎng)其貨架期[12-14]。此外，殼聚糖還可與具有抗氧化、抗菌或其他活性的功能化合物結(jié)合使用，以提升其綜合作用效果[15-16]。由于殼聚糖對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌具有高效廣譜的殺滅效果，一直受到研究者的關(guān)注，具有較大的商業(yè)潛力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)殼聚糖在抑菌方面有著顯著的效果，李佳藝等[17]研究得出殼聚糖，茶多酚和溶菌酶復(fù)合保鮮可有效減緩魚(yú)肉品質(zhì)變化；Vivek 等[18]使用殼聚糖介導(dǎo)的綠色合成法制備穩(wěn)定銀納米粒子與聚乙烯醇共混，形成靜電紡纖維復(fù)合納米層，得出此復(fù)合材料能抑制包裝食品的微生物降解，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期一周。學(xué)者還探討了殼聚糖對(duì)微生物的作用機(jī)制，其中李小芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜是殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌作用的主要位點(diǎn)，殼聚糖通過(guò)改變細(xì)胞膜的滲透性使細(xì)胞膜破壞，伴隨大量細(xì)胞內(nèi)容物泄露；柯松等[20]分析了殼聚糖的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)殼聚糖在特定分子量、特定pH 時(shí)，針對(duì)某種菌時(shí)會(huì)有最適抑菌濃度，超過(guò)該濃度，殼聚糖的抑菌效果將不會(huì)增強(qiáng)，甚至可能下降。然而，目前還未見(jiàn)有殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)測(cè)定殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），隨后通過(guò)分析微生物生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率值、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）含量、蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）含量與生物膜生成量等指標(biāo)的變化，結(jié)合掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察殼聚糖作用后腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)的變化，綜合評(píng)價(jià)殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制，以期為殼聚糖更好應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心分離純化，鑒定后于-80 ℃超低溫下甘油管凍存。

殼聚糖（白色粉末，脫乙酰度為90%，分子質(zhì)量70～ 80 ku），上海維編科技有限公司；聚四氟乙烯（poly tetra fluoroethylene，PTFE）膜過(guò)濾器，生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）與蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；氯化鈉、無(wú)水乙醇、戊二醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DDB-11A 型電導(dǎo)率儀，杭州齊威儀器有限公司；ZQZY-70B 型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Synergy2 型自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司；QYC-200 型全溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；DNP-9162BS-型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV-2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；MIRAFE-SEMs 型分析型高分辨掃描電鏡，捷克Tescan 公司等。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液與殼聚糖溶液制備 菌懸液制備：參考藍(lán)蔚青等[11]方法，將腐生葡萄球菌菌種從-80 ℃冰箱中取出，在胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)24 h。隨后，挑取單菌落在10 mL 胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）中，在37 ℃、150 r/min 恒溫?fù)u床活化培養(yǎng)18 h；再以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入10 mL的TSB 中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h，經(jīng)5 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體后棄去上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

殼聚糖溶液制備：用體積分?jǐn)?shù)1%乙酸為溶劑溶解殼聚糖，配制成不同濃度的殼聚糖溶液，通過(guò)0.22 μm PTFE 膜過(guò)濾器過(guò)濾滅菌待用。

1.3.2 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測(cè)定 參照王小敏等[21]的方法，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的MIC。由二倍稀釋法將殼聚糖液梯度稀釋?zhuān)蛊渥罱K質(zhì)量濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625與0.312 5 mg/mL，依次將不同濃度的殼聚糖加入菌液，并混和均勻。將加樣后的96 孔板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定D（600 nm）值，孔內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)被完全抑制的最低樣品濃度即為該樣品的MIC。隨后，結(jié)合D值和孔液澄清情況選出最澄清的3 個(gè)所代表的殼聚糖溶液濃度，將己制備的供試菌菌懸液分別接入3 支滅菌后的TSB 試管中?；靹蚝髮⒃嚬苤糜?7 ℃、150 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，同時(shí)從3 支試管中各吸取100 μL 在TSA 平板上涂布后培養(yǎng)，以不加入殼聚糖溶液的菌液為對(duì)照組。

1.3.3 微生物生長(zhǎng)曲線繪制 將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中，以無(wú)菌水處理組為對(duì)照。37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，每1 h 取樣，測(cè)定其D（600 nm）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，繪制殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線影響。

1.3.4 電導(dǎo)率值測(cè)定 采用盧曉等[22]的方法，稍作修改。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中后繼續(xù)培養(yǎng)，每2 h 取樣一次。將1 mL 培養(yǎng)液4 000 r/min 離心10 min，上清液稀釋20 倍后，用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率，以不加殼聚糖為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）含量測(cè)定 將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，每2 h 取樣一次，取2 mL 細(xì)菌溶液置于離心機(jī)中，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，取上清液，按AKP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行堿性磷酸酶含量測(cè)定，以不加殼聚糖為對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.6 過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT)含量測(cè)定 參考廖石榴等[23]的方法，將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h，每2 h 取樣一次，取10 mL 懸浮液低溫超聲2 min 后，4 ℃、4 000 r/min 離心12 min，取上清液，按CAT 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶含量測(cè)定，以不加殼聚糖為對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.7 蘋(píng)果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH）含量測(cè)定 參考周磊等[24]的方法，稍作修改。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h，每2 h 取樣一次，取2 mL 懸浮液4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，棄上清液，用Tris-HCl（0.1 mol/L，pH 7.4）洗滌3 次，再加入等體積溶菌酶（2.0 g/L），38 ℃靜置15 min，待菌體發(fā)黏時(shí)冰浴，再加入Tris-HCl，5 000 r/min 離心12 min，取上清液按CAT 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶含量測(cè)定，以不加殼聚糖為對(duì)照，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.8 生物膜生成量測(cè)定 將制備好的菌懸液與TSB 培養(yǎng)基按體積比1∶3 的比例加入96 孔板中，每孔200 μL，在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，取出孔板，棄去浮游菌，用250 μL 無(wú)菌生理鹽水清洗2 次，然后60 ℃干燥固定30 min，每孔加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫溶液200 μL，染色5 min 后，用250 μL 無(wú)菌生理鹽水清洗3 次，干燥，再加入體積分?jǐn)?shù)33%的冰乙酸200 μL，放置10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)D（595 nm）值。

1.3.9 掃描電鏡分析 參考Xu 等[25]方法測(cè)定腐生葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中，以37 ℃、150 r/min 振蕩7 h 后，得到進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌液。將一定量的細(xì)菌溶液以4 000 r/min 離心4 min，棄去上清液。細(xì)胞用pH 7.4 磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）進(jìn)行3 次洗滌，在4 ℃冰箱中用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定4 h。以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）依次脫水，并置于-80 ℃冰箱中冷凍保存4～8 h 后，冷凍干燥24 h。最后涂在金屬箔上固定并噴金，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用軟件Origin（Pro）8.5 繪制曲線，數(shù)據(jù)間差異通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0 中的Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由3 次平行實(shí)驗(yàn)平均值獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度MIC 確定

通過(guò)前期對(duì)菌懸液的D（600 nm）值測(cè)定，并結(jié)合菌懸液澄清度變化情況（表1）可知，0 h，對(duì)照組菌液澄清，處理組菌液呈現(xiàn)殼聚糖溶液原色；12 h，對(duì)照組菌液混濁，表明腐生葡萄球菌已進(jìn)入對(duì)數(shù)期，而2.5、1.25 與0.625 mg/mL 殼聚糖處理組試管中的菌液變得澄清；培養(yǎng)24 h 后，可觀察到對(duì)照組菌液的混濁程度加深，表明菌體已進(jìn)入穩(wěn)定期，代謝產(chǎn)物隨之積累，此時(shí)0.625 mg/mL 殼聚糖管已混濁。由后期3 個(gè)濃度加入殼聚糖處理組菌液涂布平板培養(yǎng)的最終結(jié)果判斷得出殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的MIC 為1.25 mg/mL。

表1 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)的作用效果Table 1 Effects of chitosan on the growth of Staphylococcus saprophyticus

2.2 殼聚糖處理對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線的影響

將MIC 與2MIC 殼聚糖液加入腐生葡萄球菌菌液中，對(duì)該菌的生長(zhǎng)曲線影響如圖1 所示。

圖1 表明，處理組和對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)遵循“S”型生長(zhǎng)曲線。對(duì)照組的腐生葡萄球菌在2 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h 后達(dá)到穩(wěn)定期。而MIC 處理下的腐生葡萄球菌在6 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，同時(shí)2MIC 下的腐生葡萄球菌仍處于調(diào)整期，且在9 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，表明殼聚糖能顯著抑制腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)（P＜0.05）?？赡苁且?yàn)闅ぞ厶菍儆诎被嗵?，一定程度上能為菌體生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)抑制作用在交互中占主導(dǎo)地位時(shí)，使菌體生長(zhǎng)受抑；而當(dāng)殼聚糖作為其促進(jìn)生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)時(shí)，抑制作用相對(duì)減弱[26]。

2.3 殼聚糖對(duì)堿性磷酸酶AKP酶含量的影響

堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間，當(dāng)細(xì)胞壁遭到破壞，AKP被釋放到胞外，因而可通過(guò)測(cè)定AKP含量來(lái)表征殼聚糖對(duì)細(xì)胞壁的損傷程度[9]，其變化過(guò)程如圖2所示。

圖1 殼聚糖處理對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線影響Fig.1 Effects of chitosan on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

圖2 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌AKP酶含量變化的影響Fig.2 Effects of chitosan on the AKPase content of Staphylococcus saprophyticus

圖2 表明，腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理后，其AKP酶含量明顯高于對(duì)照組，且AKP酶含量高低與殼聚糖濃度呈正比?？梢?jiàn)，腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理后，引起細(xì)胞壁的損傷，使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性與完整性發(fā)生改變。AKP酶暴露在膜外，膜的作用被削弱而發(fā)生質(zhì)壁分離，壁膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)菌失去細(xì)胞壁的保護(hù)，胞內(nèi)內(nèi)容物泄漏而死亡。其中，Raafat 等[27]研究得出革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁成分糖脂質(zhì)——脂壁酸可為殼聚糖在細(xì)胞表面提供分子連接，進(jìn)一步干擾菌體的膜功能。

2.4 殼聚糖對(duì)電導(dǎo)率值的影響

細(xì)胞內(nèi)成分滲漏是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜受損的決定性標(biāo)志，反映菌體細(xì)胞膜的通透性變化[28]。

由圖3 可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組處理液的電導(dǎo)率值均有所升高，而與對(duì)照組相比，MIC 和2MIC 處理的菌懸液電導(dǎo)率明顯增加（P＞0.05）。表明殼聚糖處理可使腐生葡萄球菌細(xì)胞懸液的電導(dǎo)率值升高，可能是因?yàn)闅ぞ厶菍?duì)菌體細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細(xì)胞電解質(zhì)滲漏，抑制其正常生長(zhǎng)代謝，造成菌體死亡。其中MIC 處理組電導(dǎo)率值在4～6 h 處下降，參照?qǐng)D1 中腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線，可能由于MIC 處理組在4～6 h 腐生葡萄球菌處于延滯期，細(xì)胞吸收胞外電解質(zhì)如K+、Ca2+為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作準(zhǔn)備。從而導(dǎo)致電導(dǎo)率下降，而2MIC組，由于其對(duì)腐生葡萄球菌破壞力較強(qiáng)，因而不受影響。與此同時(shí)，對(duì)照組組菌懸液的電導(dǎo)率值也在緩慢增加，可能由于菌體的自然衰老、死亡引起膜通透性變差。此結(jié)果與菌體的生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)保持一致。

圖3 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌電導(dǎo)率值變化的影響Fig.3 Effects of chitosan on the electrical conductivities of Staphylococcus saprophyticus

2.5 殼聚糖對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）含量的影響

細(xì)胞膜的損傷和酶的失活可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞代謝[29]。CAT 是細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶，具有清除活性氧自由基，保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整度的功能。

圖4 表明，未經(jīng)殼聚糖處理過(guò)的腐生葡萄球菌的CAT 含量總體保持較高水平，在培養(yǎng)6 h 達(dá)到最高峰，參照?qǐng)D1 中腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線，這可能是因?yàn)樵?～6 h，腐生葡萄球菌屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量過(guò)氧化氫，細(xì)菌調(diào)控后產(chǎn)生大量CAT，而后腐生葡萄球菌滴度趨于穩(wěn)定，CAT 含量下降后保持穩(wěn)定。而MIC 與2MIC 處理下的菌體CAT 含量在2 h 后快速下降，且在此后保持緩慢降低，到12 h 時(shí)兩者基本一致。這可能是因?yàn)闅ぞ厶堑拇蠓肿咏Y(jié)構(gòu)在處理初期不易進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，后經(jīng)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，破壞保護(hù)酶系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞菌體死亡。

圖4 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌CAT 酶含量變化的影響Fig.4 Effects of chitosan on the CAT content of Staphylococcus saprophyticus

2.6 殼聚糖對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶（MDH）含量的影響

MDH 是三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶類(lèi)之一，其酶含量變化可直接反映出細(xì)胞的能量代謝情況[30]。由圖5 可知，細(xì)菌培養(yǎng)2 h 后，相比于對(duì)照組菌懸液11.96 U/mg酶活力，殼聚糖處理組的MDH含量降低67%，表明殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌MDH 有明顯抑制作用。同時(shí)，殼聚糖濃度對(duì)MDH 含量無(wú)顯著影響（P＞0.050）。酶含量變化反映了腐生葡萄球菌對(duì)糖的氧化代謝被抑制，使菌體生長(zhǎng)繁殖受到阻礙[23]。

2.7 殼聚糖對(duì)生物膜生成量的影響

生物膜是一個(gè)微生物群落，其聚集在一起并附著在同一表面上，形成由胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）組成的自生保護(hù)層[31]。由圖6 可知，與對(duì)照組相比，MIC 組D（595 nm）值下降37.10%，2MIC 組D（595 nm）值下降67.74%，即隨著殼聚糖濃度的增大，抑制率明顯升高，表明殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的生物膜形成能力有較好抑制作用。

圖5 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌MDH 酶含量變化的影響Fig.5 Effects of chitosan on the MDH content of Staphylococcus saprophyticus

圖6 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌生物膜形成能力的影響Fig.6 Effects of chitosan on the biofilm formation of Staphylococcus saprophyticus

2.8 殼聚糖處理前后腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)

由圖7 可知，未經(jīng)處理的腐生葡萄球菌細(xì)胞呈現(xiàn)正常形態(tài)且飽滿；然而，經(jīng)殼聚糖處理的腐生葡萄球菌培養(yǎng)7 h 后，細(xì)胞形狀不規(guī)則，表面呈不規(guī)則皺褶，出現(xiàn)破損細(xì)胞或細(xì)胞碎片，黏附聚集明顯。以上變化表明，殼聚糖破壞了腐生葡萄球菌的外部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞質(zhì)成分的泄漏。藍(lán)蔚青等[32]通過(guò)掃描電鏡觀察ε-聚賴(lài)氨酸處理腐生葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)其可使細(xì)菌體表粗糙、扭曲變形與細(xì)胞相互黏結(jié)。

圖7 腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理前后的掃描電鏡Fig.7 Scanning electron micrographs of staphylococcus saprophyticus before and after treatment with chitosan

2.9 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用分析

綜合如上指標(biāo)分析結(jié)果，殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制如圖8 所示。

圖8 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制示意Fig.8 Action mechanism of chitosan on Staphylococcus saprophyticus

由圖8 可見(jiàn)，殼聚糖的作用位點(diǎn)多樣，其可改變細(xì)胞膜通透性，對(duì)細(xì)胞中的CAT 酶、三羧酸循環(huán)、能量代謝產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致AKP酶、核酸及蛋白質(zhì)泄漏，使其DNA 結(jié)構(gòu)的改變，干擾群體感應(yīng)分子，使其失活，這解釋了本研究結(jié)果中CAT 酶與MDH含量降低，AKP酶含量和電導(dǎo)率值上升，同時(shí)掃描電鏡結(jié)果中殼聚糖處理后腐生葡萄球菌的外部結(jié)構(gòu)遭到破壞。然而，殼聚糖對(duì)菌體細(xì)胞膜、信號(hào)分子的分泌與接收、能量代謝與物質(zhì)循環(huán)、增殖與傳代等影響仍需深入研究，正如本研究中殼聚糖處理組明顯降低腐生葡萄球菌的生物膜生成量。該研究結(jié)果與RAI M 等[32]綜合分析結(jié)果相似；同時(shí)，在菌體外部普遍存在的胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中，作為群體感應(yīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵因素的AHLs等信號(hào)分子及胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）在不同菌種間的差異性可能也會(huì)對(duì)不同菌株對(duì)殼聚糖的耐受力產(chǎn)生一定影響。因此，后期可通過(guò)群體感應(yīng)機(jī)制研究，深入探究殼聚糖對(duì)水產(chǎn)品特定腐敗菌的作用機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究探究殼聚糖處理對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制，測(cè)定，其對(duì)腐生葡萄球菌的MIC 為1.25 mg/mL，經(jīng)菌體經(jīng)MIC 和2MIC 處理后，CAT 與MDH 含量降低，電導(dǎo)率值上升，對(duì)腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線產(chǎn)生較大影響，且使腐生葡萄球菌的生物膜生成量明顯降低。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)殼聚糖處理的腐生葡萄球菌細(xì)胞形狀不規(guī)則，表面呈不規(guī)則皺褶，出現(xiàn)破損細(xì)胞或細(xì)胞碎片，黏附聚集明顯，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞質(zhì)成分泄漏。殼聚糖能延緩腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)，抑制菌體生物膜的形成，損壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其細(xì)胞膜通透性，隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，破壞保護(hù)代謝的酶系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。