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    殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制

    2021-02-03 10:19:00藍(lán)蔚青
    關(guān)鍵詞:腐生菌體懸液

    藍(lán)蔚青,楊 歆,王 蒙,梅 俊,謝 晶

    (1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院// 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心// 3.食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海 201306)

    水產(chǎn)品在貯藏期間,微生物是導(dǎo)致其腐敗的主因[1]。微生物種群發(fā)生群落演替,其中部分優(yōu)勢(shì)菌起主導(dǎo)作用,產(chǎn)生腐敗臭味和異味等代謝產(chǎn)物,稱(chēng)之為該類(lèi)水產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific Spoilage Organism,SSO)[2]。SSO 具有調(diào)節(jié)和代謝產(chǎn)生一系列化合物與生物活性物質(zhì)的能力,還可能含有從魚(yú)體內(nèi)非蛋白氮衍生出的各種有機(jī)揮發(fā)性化合物(volatile organic compounds,VOCs),產(chǎn)生異味,影響產(chǎn)品的感官、質(zhì)地與新鮮度[3-4]。腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)為革蘭陽(yáng)性菌,是大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)貯藏后期的SSO,能分泌蛋白酶與脂肪酶,導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解與脂質(zhì)氧化,影響其品質(zhì)[5-6]。目前有部分學(xué)者開(kāi)展了對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)理分析,如蘇萌萌等[7]研究得出綠原素能使腐生葡萄球菌細(xì)胞膜受損,導(dǎo)致膜電位變化,胞內(nèi)物質(zhì)泄漏;朱亞珠等[8]發(fā)現(xiàn)山梨酸鉀、異抗壞血酸鈉與雙乙酸鈉復(fù)合保鮮劑能明顯抑制腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)速率,導(dǎo)致菌體核酸與蛋白質(zhì)外泄。本課題組前期在生物保鮮劑對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制方面也開(kāi)展了部分研究工作[9-11]。

    殼聚糖是一種天然的陽(yáng)離子多糖,是甲殼質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物。其無(wú)毒、抗菌活性、可生物降解性和生物相容性、成膜性等優(yōu)勢(shì)能夠提高產(chǎn)品的綜合品質(zhì),延長(zhǎng)其貨架期[12-14]。此外,殼聚糖還可與具有抗氧化、抗菌或其他活性的功能化合物結(jié)合使用,以提升其綜合作用效果[15-16]。由于殼聚糖對(duì)革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌具有高效廣譜的殺滅效果,一直受到研究者的關(guān)注,具有較大的商業(yè)潛力。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)殼聚糖在抑菌方面有著顯著的效果,李佳藝等[17]研究得出殼聚糖,茶多酚和溶菌酶復(fù)合保鮮可有效減緩魚(yú)肉品質(zhì)變化;Vivek 等[18]使用殼聚糖介導(dǎo)的綠色合成法制備穩(wěn)定銀納米粒子與聚乙烯醇共混,形成靜電紡纖維復(fù)合納米層,得出此復(fù)合材料能抑制包裝食品的微生物降解,延長(zhǎng)食品保質(zhì)期一周。學(xué)者還探討了殼聚糖對(duì)微生物的作用機(jī)制,其中李小芳等[19]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜是殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌作用的主要位點(diǎn),殼聚糖通過(guò)改變細(xì)胞膜的滲透性使細(xì)胞膜破壞,伴隨大量細(xì)胞內(nèi)容物泄露;柯松等[20]分析了殼聚糖的抑菌性能,發(fā)現(xiàn)殼聚糖在特定分子量、特定pH 時(shí),針對(duì)某種菌時(shí)會(huì)有最適抑菌濃度,超過(guò)該濃度,殼聚糖的抑菌效果將不會(huì)增強(qiáng),甚至可能下降。然而,目前還未見(jiàn)有殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制的研究報(bào)道。

    本研究通過(guò)測(cè)定殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC),隨后通過(guò)分析微生物生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率值、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)含量、蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,MDH)含量與生物膜生成量等指標(biāo)的變化,結(jié)合掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察殼聚糖作用后腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)的變化,綜合評(píng)價(jià)殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制,以期為殼聚糖更好應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工與貯藏工程技術(shù)研究中心分離純化,鑒定后于-80 ℃超低溫下甘油管凍存。

    殼聚糖(白色粉末,脫乙酰度為90%,分子質(zhì)量70~ 80 ku),上海維編科技有限公司;聚四氟乙烯(poly tetra fluoroethylene,PTFE)膜過(guò)濾器,生工生物工程(上海)股份有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)與蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,MDH)試劑盒,南京建成生物工程研究所;氯化鈉、無(wú)水乙醇、戊二醛等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DDB-11A 型電導(dǎo)率儀,杭州齊威儀器有限公司;ZQZY-70B 型振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;Synergy2 型自動(dòng)酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek 公司;QYC-200 型全溫培養(yǎng)搖床,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf 公司;DNP-9162BS-型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;UV-2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;MIRAFE-SEMs 型分析型高分辨掃描電鏡,捷克Tescan 公司等。

    1.3 方法

    1.3.1 菌懸液與殼聚糖溶液制備 菌懸液制備:參考藍(lán)蔚青等[11]方法,將腐生葡萄球菌菌種從-80 ℃冰箱中取出,在胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar,TSA)平板上劃線,30 ℃培養(yǎng)24 h。隨后,挑取單菌落在10 mL 胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)中,在37 ℃、150 r/min 恒溫?fù)u床活化培養(yǎng)18 h;再以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入10 mL的TSB 中,37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h,經(jīng)5 000 r/min、4 ℃離心10 min,收集菌體后棄去上清液,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水重懸,調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106CFU/mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    殼聚糖溶液制備:用體積分?jǐn)?shù)1%乙酸為溶劑溶解殼聚糖,配制成不同濃度的殼聚糖溶液,通過(guò)0.22 μm PTFE 膜過(guò)濾器過(guò)濾滅菌待用。

    1.3.2 最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)測(cè)定 參照王小敏等[21]的方法,采用微量肉湯稀釋法測(cè)定殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的MIC。由二倍稀釋法將殼聚糖液梯度稀釋?zhuān)蛊渥罱K質(zhì)量濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625與0.312 5 mg/mL,依次將不同濃度的殼聚糖加入菌液,并混和均勻。將加樣后的96 孔板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定D(600 nm)值,孔內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)被完全抑制的最低樣品濃度即為該樣品的MIC。隨后,結(jié)合D值和孔液澄清情況選出最澄清的3 個(gè)所代表的殼聚糖溶液濃度,將己制備的供試菌菌懸液分別接入3 支滅菌后的TSB 試管中?;靹蚝髮⒃嚬苤糜?7 ℃、150 r/min 搖床上振蕩培養(yǎng)24 h,同時(shí)從3 支試管中各吸取100 μL 在TSA 平板上涂布后培養(yǎng),以不加入殼聚糖溶液的菌液為對(duì)照組。

    1.3.3 微生物生長(zhǎng)曲線繪制 將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中,以無(wú)菌水處理組為對(duì)照。37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h,每1 h 取樣,測(cè)定其D(600 nm)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),D值為縱坐標(biāo),繪制殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線影響。

    1.3.4 電導(dǎo)率值測(cè)定 采用盧曉等[22]的方法,稍作修改。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中后繼續(xù)培養(yǎng),每2 h 取樣一次。將1 mL 培養(yǎng)液4 000 r/min 離心10 min,上清液稀釋20 倍后,用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率,以不加殼聚糖為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.3.5 堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)含量測(cè)定 將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中,以37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h,每2 h 取樣一次,取2 mL 細(xì)菌溶液置于離心機(jī)中,4 ℃、4 000 r/min 離心10 min,取上清液,按AKP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行堿性磷酸酶含量測(cè)定,以不加殼聚糖為對(duì)照,重復(fù)測(cè)定3 次。

    1.3.6 過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)含量測(cè)定 參考廖石榴等[23]的方法,將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中,以37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h,每2 h 取樣一次,取10 mL 懸浮液低溫超聲2 min 后,4 ℃、4 000 r/min 離心12 min,取上清液,按CAT 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶含量測(cè)定,以不加殼聚糖為對(duì)照,重復(fù)測(cè)定3 次。

    1.3.7 蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase,MDH)含量測(cè)定 參考周磊等[24]的方法,稍作修改。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中,以37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h,每2 h 取樣一次,取2 mL 懸浮液4 ℃、3 000 r/min 離心15 min,棄上清液,用Tris-HCl(0.1 mol/L,pH 7.4)洗滌3 次,再加入等體積溶菌酶(2.0 g/L),38 ℃靜置15 min,待菌體發(fā)黏時(shí)冰浴,再加入Tris-HCl,5 000 r/min 離心12 min,取上清液按CAT 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶含量測(cè)定,以不加殼聚糖為對(duì)照,重復(fù)測(cè)定3 次。

    1.3.8 生物膜生成量測(cè)定 將制備好的菌懸液與TSB 培養(yǎng)基按體積比1∶3 的比例加入96 孔板中,每孔200 μL,在28 ℃條件下培養(yǎng)48 h,取出孔板,棄去浮游菌,用250 μL 無(wú)菌生理鹽水清洗2 次,然后60 ℃干燥固定30 min,每孔加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫溶液200 μL,染色5 min 后,用250 μL 無(wú)菌生理鹽水清洗3 次,干燥,再加入體積分?jǐn)?shù)33%的冰乙酸200 μL,放置10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)D(595 nm)值。

    1.3.9 掃描電鏡分析 參考Xu 等[25]方法測(cè)定腐生葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。將己制備的供試菌菌懸液分別加至MIC、2MIC 殼聚糖溶液中,以37 ℃、150 r/min 振蕩7 h 后,得到進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌液。將一定量的細(xì)菌溶液以4 000 r/min 離心4 min,棄去上清液。細(xì)胞用pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)進(jìn)行3 次洗滌,在4 ℃冰箱中用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定4 h。以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)依次脫水,并置于-80 ℃冰箱中冷凍保存4~8 h 后,冷凍干燥24 h。最后涂在金屬箔上固定并噴金,在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)用軟件Origin(Pro)8.5 繪制曲線,數(shù)據(jù)間差異通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0 中的Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析與多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由3 次平行實(shí)驗(yàn)平均值獲得。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 最小抑菌濃度MIC 確定

    通過(guò)前期對(duì)菌懸液的D(600 nm)值測(cè)定,并結(jié)合菌懸液澄清度變化情況(表1)可知,0 h,對(duì)照組菌液澄清,處理組菌液呈現(xiàn)殼聚糖溶液原色;12 h,對(duì)照組菌液混濁,表明腐生葡萄球菌已進(jìn)入對(duì)數(shù)期,而2.5、1.25 與0.625 mg/mL 殼聚糖處理組試管中的菌液變得澄清;培養(yǎng)24 h 后,可觀察到對(duì)照組菌液的混濁程度加深,表明菌體已進(jìn)入穩(wěn)定期,代謝產(chǎn)物隨之積累,此時(shí)0.625 mg/mL 殼聚糖管已混濁。由后期3 個(gè)濃度加入殼聚糖處理組菌液涂布平板培養(yǎng)的最終結(jié)果判斷得出殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的MIC 為1.25 mg/mL。

    表1 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)的作用效果Table 1 Effects of chitosan on the growth of Staphylococcus saprophyticus

    2.2 殼聚糖處理對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線的影響

    將MIC 與2MIC 殼聚糖液加入腐生葡萄球菌菌液中,對(duì)該菌的生長(zhǎng)曲線影響如圖1 所示。

    圖1 表明,處理組和對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)遵循“S”型生長(zhǎng)曲線。對(duì)照組的腐生葡萄球菌在2 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12 h 后達(dá)到穩(wěn)定期。而MIC 處理下的腐生葡萄球菌在6 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,同時(shí)2MIC 下的腐生葡萄球菌仍處于調(diào)整期,且在9 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,表明殼聚糖能顯著抑制腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)(P<0.05)??赡苁且?yàn)闅ぞ厶菍儆诎被嗵?,一定程度上能為菌體生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),當(dāng)抑制作用在交互中占主導(dǎo)地位時(shí),使菌體生長(zhǎng)受抑;而當(dāng)殼聚糖作為其促進(jìn)生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)時(shí),抑制作用相對(duì)減弱[26]。

    2.3 殼聚糖對(duì)堿性磷酸酶AKP酶含量的影響

    堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間,當(dāng)細(xì)胞壁遭到破壞,AKP被釋放到胞外,因而可通過(guò)測(cè)定AKP含量來(lái)表征殼聚糖對(duì)細(xì)胞壁的損傷程度[9],其變化過(guò)程如圖2所示。

    圖1 殼聚糖處理對(duì)腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線影響Fig.1 Effects of chitosan on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

    圖2 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌AKP酶含量變化的影響Fig.2 Effects of chitosan on the AKPase content of Staphylococcus saprophyticus

    圖2 表明,腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理后,其AKP酶含量明顯高于對(duì)照組,且AKP酶含量高低與殼聚糖濃度呈正比??梢?jiàn),腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理后,引起細(xì)胞壁的損傷,使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性與完整性發(fā)生改變。AKP酶暴露在膜外,膜的作用被削弱而發(fā)生質(zhì)壁分離,壁膜結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)菌失去細(xì)胞壁的保護(hù),胞內(nèi)內(nèi)容物泄漏而死亡。其中,Raafat 等[27]研究得出革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁成分糖脂質(zhì)——脂壁酸可為殼聚糖在細(xì)胞表面提供分子連接,進(jìn)一步干擾菌體的膜功能。

    2.4 殼聚糖對(duì)電導(dǎo)率值的影響

    細(xì)胞內(nèi)成分滲漏是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜受損的決定性標(biāo)志,反映菌體細(xì)胞膜的通透性變化[28]。

    由圖3 可知,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),各組處理液的電導(dǎo)率值均有所升高,而與對(duì)照組相比,MIC 和2MIC 處理的菌懸液電導(dǎo)率明顯增加(P>0.05)。表明殼聚糖處理可使腐生葡萄球菌細(xì)胞懸液的電導(dǎo)率值升高,可能是因?yàn)闅ぞ厶菍?duì)菌體細(xì)胞膜通透性產(chǎn)生影響,導(dǎo)致細(xì)胞電解質(zhì)滲漏,抑制其正常生長(zhǎng)代謝,造成菌體死亡。其中MIC 處理組電導(dǎo)率值在4~6 h 處下降,參照?qǐng)D1 中腐生葡萄球菌生長(zhǎng)曲線,可能由于MIC 處理組在4~6 h 腐生葡萄球菌處于延滯期,細(xì)胞吸收胞外電解質(zhì)如K+、Ca2+為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作準(zhǔn)備。從而導(dǎo)致電導(dǎo)率下降,而2MIC組,由于其對(duì)腐生葡萄球菌破壞力較強(qiáng),因而不受影響。與此同時(shí),對(duì)照組組菌懸液的電導(dǎo)率值也在緩慢增加,可能由于菌體的自然衰老、死亡引起膜通透性變差。此結(jié)果與菌體的生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)保持一致。

    圖3 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌電導(dǎo)率值變化的影響Fig.3 Effects of chitosan on the electrical conductivities of Staphylococcus saprophyticus

    2.5 殼聚糖對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)含量的影響

    細(xì)胞膜的損傷和酶的失活可能會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞代謝[29]。CAT 是細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶,具有清除活性氧自由基,保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整度的功能。

    圖4 表明,未經(jīng)殼聚糖處理過(guò)的腐生葡萄球菌的CAT 含量總體保持較高水平,在培養(yǎng)6 h 達(dá)到最高峰,參照?qǐng)D1 中腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線,這可能是因?yàn)樵?~6 h,腐生葡萄球菌屬于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量過(guò)氧化氫,細(xì)菌調(diào)控后產(chǎn)生大量CAT,而后腐生葡萄球菌滴度趨于穩(wěn)定,CAT 含量下降后保持穩(wěn)定。而MIC 與2MIC 處理下的菌體CAT 含量在2 h 后快速下降,且在此后保持緩慢降低,到12 h 時(shí)兩者基本一致。這可能是因?yàn)闅ぞ厶堑拇蠓肿咏Y(jié)構(gòu)在處理初期不易進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi),后經(jīng)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),破壞保護(hù)酶系統(tǒng),最終導(dǎo)致細(xì)胞菌體死亡。

    圖4 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌CAT 酶含量變化的影響Fig.4 Effects of chitosan on the CAT content of Staphylococcus saprophyticus

    2.6 殼聚糖對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)含量的影響

    MDH 是三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶類(lèi)之一,其酶含量變化可直接反映出細(xì)胞的能量代謝情況[30]。由圖5 可知,細(xì)菌培養(yǎng)2 h 后,相比于對(duì)照組菌懸液11.96 U/mg酶活力,殼聚糖處理組的MDH含量降低67%,表明殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌MDH 有明顯抑制作用。同時(shí),殼聚糖濃度對(duì)MDH 含量無(wú)顯著影響(P>0.050)。酶含量變化反映了腐生葡萄球菌對(duì)糖的氧化代謝被抑制,使菌體生長(zhǎng)繁殖受到阻礙[23]。

    2.7 殼聚糖對(duì)生物膜生成量的影響

    生物膜是一個(gè)微生物群落,其聚集在一起并附著在同一表面上,形成由胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)組成的自生保護(hù)層[31]。由圖6 可知,與對(duì)照組相比,MIC 組D(595 nm)值下降37.10%,2MIC 組D(595 nm)值下降67.74%,即隨著殼聚糖濃度的增大,抑制率明顯升高,表明殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌的生物膜形成能力有較好抑制作用。

    圖5 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌MDH 酶含量變化的影響Fig.5 Effects of chitosan on the MDH content of Staphylococcus saprophyticus

    圖6 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌生物膜形成能力的影響Fig.6 Effects of chitosan on the biofilm formation of Staphylococcus saprophyticus

    2.8 殼聚糖處理前后腐生葡萄球菌微觀結(jié)構(gòu)

    由圖7 可知,未經(jīng)處理的腐生葡萄球菌細(xì)胞呈現(xiàn)正常形態(tài)且飽滿;然而,經(jīng)殼聚糖處理的腐生葡萄球菌培養(yǎng)7 h 后,細(xì)胞形狀不規(guī)則,表面呈不規(guī)則皺褶,出現(xiàn)破損細(xì)胞或細(xì)胞碎片,黏附聚集明顯。以上變化表明,殼聚糖破壞了腐生葡萄球菌的外部結(jié)構(gòu),導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞質(zhì)成分的泄漏。藍(lán)蔚青等[32]通過(guò)掃描電鏡觀察ε-聚賴(lài)氨酸處理腐生葡萄球菌,發(fā)現(xiàn)其可使細(xì)菌體表粗糙、扭曲變形與細(xì)胞相互黏結(jié)。

    圖7 腐生葡萄球菌經(jīng)殼聚糖處理前后的掃描電鏡Fig.7 Scanning electron micrographs of staphylococcus saprophyticus before and after treatment with chitosan

    2.9 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用分析

    綜合如上指標(biāo)分析結(jié)果,殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制如圖8 所示。

    圖8 殼聚糖對(duì)腐生葡萄球菌作用機(jī)制示意Fig.8 Action mechanism of chitosan on Staphylococcus saprophyticus

    由圖8 可見(jiàn),殼聚糖的作用位點(diǎn)多樣,其可改變細(xì)胞膜通透性,對(duì)細(xì)胞中的CAT 酶、三羧酸循環(huán)、能量代謝產(chǎn)生干擾,導(dǎo)致AKP酶、核酸及蛋白質(zhì)泄漏,使其DNA 結(jié)構(gòu)的改變,干擾群體感應(yīng)分子,使其失活,這解釋了本研究結(jié)果中CAT 酶與MDH含量降低,AKP酶含量和電導(dǎo)率值上升,同時(shí)掃描電鏡結(jié)果中殼聚糖處理后腐生葡萄球菌的外部結(jié)構(gòu)遭到破壞。然而,殼聚糖對(duì)菌體細(xì)胞膜、信號(hào)分子的分泌與接收、能量代謝與物質(zhì)循環(huán)、增殖與傳代等影響仍需深入研究,正如本研究中殼聚糖處理組明顯降低腐生葡萄球菌的生物膜生成量。該研究結(jié)果與RAI M 等[32]綜合分析結(jié)果相似;同時(shí),在菌體外部普遍存在的胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中,作為群體感應(yīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵因素的AHLs等信號(hào)分子及胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)在不同菌種間的差異性可能也會(huì)對(duì)不同菌株對(duì)殼聚糖的耐受力產(chǎn)生一定影響。因此,后期可通過(guò)群體感應(yīng)機(jī)制研究,深入探究殼聚糖對(duì)水產(chǎn)品特定腐敗菌的作用機(jī)制。

    3 結(jié)論

    本研究探究殼聚糖處理對(duì)腐生葡萄球菌的作用機(jī)制,測(cè)定,其對(duì)腐生葡萄球菌的MIC 為1.25 mg/mL,經(jīng)菌體經(jīng)MIC 和2MIC 處理后,CAT 與MDH 含量降低,電導(dǎo)率值上升,對(duì)腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線產(chǎn)生較大影響,且使腐生葡萄球菌的生物膜生成量明顯降低。掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)殼聚糖處理的腐生葡萄球菌細(xì)胞形狀不規(guī)則,表面呈不規(guī)則皺褶,出現(xiàn)破損細(xì)胞或細(xì)胞碎片,黏附聚集明顯,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞質(zhì)成分泄漏。殼聚糖能延緩腐生葡萄球菌的生長(zhǎng),抑制菌體生物膜的形成,損壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),增強(qiáng)其細(xì)胞膜通透性,隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),破壞保護(hù)代謝的酶系統(tǒng),最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

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