電子煙對小鼠視網(wǎng)膜組織及超微結(jié)構(gòu)影響的研究

年 申，喬妮妮，羅阿麗，李 娟，王善偉，米亞靜，張光偉

0引言

吸煙對身體的多個器官造成不同程度的影響，是世界上老年人死亡的重要原因之一。近年來電子煙以戒煙、清肺等為宣傳口號,在全球快速流行，獲得了越來越多的消費者青睞[1]。電子煙(又稱電子尼古丁傳送系統(tǒng)，Electronic nicotine delivery systems,ENDS)由電池(供電系統(tǒng))、霧化器(霧化系統(tǒng))和液體(電子煙霧化液)構(gòu)成[2-3]。電子煙霧化液在加熱后氣化并向開口端噴出,噴出的蒸汽在大氣中冷凝，形成類似于傳統(tǒng)香煙煙霧的微小霧滴被吸食者吸入[4]。有文獻(xiàn)報道[5-6]電子煙煙液可能含有有毒成分,如有害金屬、甲醛、丙烯醛等,對人體健康產(chǎn)生影響。文獻(xiàn)報道吸煙與許多眼部疾病密切相關(guān)，其主要是通過氧化應(yīng)激或缺氧機(jī)制造成視網(wǎng)膜的損傷,但電子煙與眼部疾病的關(guān)系鮮有報道，本文旨在探討小鼠在被電子煙煙霧染毒后小鼠視網(wǎng)膜各層組織病理學(xué)變化、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變及其與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系，為臨床上防治相關(guān)視網(wǎng)膜疾病提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取18只c57BL雄性小鼠(8周齡，體質(zhì)量18～22g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，均為無特定病原體級實驗動物(SPF級動物)。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查小鼠眼前節(jié)、眼底未發(fā)現(xiàn)異常。整個實驗中，18只小鼠均置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng):室溫25℃±1℃，濕度60%±10%和交替的12h明暗周期(早上8點到晩上8點)，并給予相同的水量和食物[7-8]。動物實驗符合視覺與眼科協(xié)會規(guī)定的對于動物眼科和視覺研究的使用要求(動物處死采用水合氯醛過量麻醉后處死，僅使用動物的一只眼球用于實驗)，同時獲得了西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2電子煙特唯普(Truvape，英國)。

1.1.3儀器與試劑模擬人體呼吸系統(tǒng)吸煙的仿生裝置(專利201721438419.0)，靜式染毒柜(中國天津合普)，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX41)，透射電子顯微鏡(HitachiHT 7800)，激光共聚焦顯微鏡(Thermo Celllnsight CX5),石蠟切片機(jī)(徳國Leica RM2235)，圖像分析系統(tǒng)(Leica Q550CW)，Anti-beta Ⅲ Tubulin antibody(英國Abcam,1∶1000)，8-OHdG(美國Santa Cruz,1∶1000)，Goat Anti-Mouse lgG H&L(英國Abcam,1∶500)，蘇木素(Sigma)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立本研究應(yīng)用仿生模擬人體呼吸系統(tǒng)吸煙發(fā)生裝置模擬人體吸煙行為習(xí)慣，按人20支/天吸煙量(每根煙含12mg尼古丁)計算,依小鼠體表面積換算需要電子煙煙液的量。通過發(fā)明專利裝置，將電子煙煙霧傳送至靜式染毒柜，每天2次，每次染毒30min,持續(xù)12wk。

1.2.2動物分組18只c57BL小鼠隨機(jī)分為A組、B組和C組。A組為對照組(6只),不做特殊處理，B組為0mg尼古丁電子煙組(6只)，C組為12mg尼古丁電子煙組(6只)。B組和C組進(jìn)行電子煙煙霧干預(yù)，每天2次，一次30min。干預(yù)12wk后，處死小鼠，摘取眼球。

1.2.3小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)觀察各組小鼠水合氯醛(100g/L)腹腔麻醉,處死小鼠后取眼球，將小鼠眼球分別固定于40g/L多聚甲醛溶液內(nèi)[9]。依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%(1min，2次)、95%(3min，2次)、100%(5min，2次)乙醇逐級脫水，浸蠟，石蠟包埋并切片(片厚4μm)。部分經(jīng)過視神經(jīng)切片行HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)的改變并測量每張切片中央部視網(wǎng)膜全層、視神經(jīng)纖維層、內(nèi)叢狀層的厚度；隨機(jī)選取5張切片并求得平均值作為該眼球的中央部平均視網(wǎng)膜、視神經(jīng)纖維層、內(nèi)叢狀層厚度。其余經(jīng)過視神經(jīng)切片行免疫熒光染色。

1.2.4視網(wǎng)膜Tuj1和8-OHdG免疫熒光染色各組石蠟切片脫蠟后,Proteinase K(20μg/mLPBS)15min修復(fù)抗原,用免疫熒光封閉液封閉60min,Tuj1、8-OHdG一抗4℃孵育過夜,羊抗小鼠二抗室溫避光孵育1h,含DAPI的封閉液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。用細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)計數(shù)節(jié)細(xì)胞層Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5張切片并求得平均值作為該眼球的平均節(jié)細(xì)胞層Tuj1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察將3組小鼠眼球標(biāo)本分別置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛前固定2～4h,洗滌，10g/L鋨酸固定1～2h,洗滌；乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂滲透、包埋與聚合、切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察RPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并拍照[10]。

2結(jié)果

2.1小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)觀察對照組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)正常,各層結(jié)構(gòu)完整,層次分明。內(nèi)界膜(internal limiting membrane,ILM)清晰完整;視神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer，NFL)神經(jīng)纖維排列較好；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)內(nèi)細(xì)胞核多呈卵圓形,在中央部排列成假復(fù)層,周邊部呈單層排列，較密集，可見多個毛細(xì)血管；內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)結(jié)構(gòu)較完整；內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)細(xì)胞核排列整齊，染色均勻，約5～6層；外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)和外核層(outer nuclear layer，ONL)細(xì)胞核排列整齊、緊密，有一定極向性；外界膜(external limiting membrane,ELM)、視錐視桿細(xì)胞(rods and cones)和RPE層均形態(tài)正常，RPE層細(xì)胞呈矮立方狀單層排列,細(xì)胞漿內(nèi)含色素(圖1A)。0mg尼古丁組測得小鼠視網(wǎng)膜厚度178.8±6.92μm,內(nèi)界膜較完整，局部不清晰；視神經(jīng)纖維層神經(jīng)纖維部分改變、消失，排列不規(guī)則；視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)細(xì)胞核為卵圓形,部分形態(tài)異常,排列紊亂，染色不均一,疏密不一，局部可見細(xì)胞核的缺失，毛細(xì)血管較對照組減少；內(nèi)叢狀層結(jié)構(gòu)較好，內(nèi)核層細(xì)胞核排列較規(guī)則，外叢狀層、外核層、外界膜、視錐視桿細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮層均未見明顯改變(圖1B)。12mg尼古丁組各層結(jié)構(gòu)改變與0mg尼古丁組基本一致(圖1C)。3組小鼠視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維層厚度和內(nèi)叢狀層厚度見表1。三組間視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維層厚度和內(nèi)叢狀層厚度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=44.65，P<0.0001；F=56.64，P<0.0001；F=24.42，P<0.001)。0mg和12mg尼古丁組視網(wǎng)膜、視神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層厚度與對照組相比均顯著變薄(P<0.01)，但是0mg和12mg尼古丁組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.3716、0.7201、0.5369)，見圖2～4。

圖1 三組小鼠視網(wǎng)膜HE染色情況(×400) A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。

圖2 三組小鼠視網(wǎng)膜厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C組：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。b P<0.001 vs A組。

圖3 三組小鼠視神經(jīng)纖維層厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C組：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。b P<0.001 vs A組。

圖4 三組小鼠內(nèi)叢狀層厚度的比較 A組：正常對照組；B組：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C組：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。b P<0.001 vs A組。

表1 三組小鼠視網(wǎng)膜、視神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層的厚度

2.2小鼠視網(wǎng)膜Tuj1免疫熒光染色Tuj1可以與神經(jīng)細(xì)胞中Ⅲ類β-微管蛋白特異性結(jié)合，因此常作為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)志。本實驗將在GCL層的Tuj1和DAPI雙染的細(xì)胞定義為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。對照組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列緊密有序,大小相似，胞漿內(nèi)可見強(qiáng)的紅色免疫熒光信號,視神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層也可見紅色免疫熒光信號(圖5A、D)；0mg尼古丁組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂，疏密不一,胞漿內(nèi)可見較強(qiáng)的紅色免疫熒光信號，視神經(jīng)纖維層紅色免疫熒光信號較弱,內(nèi)叢狀層內(nèi)也可見紅色免疫熒光信號(圖5B、E)；12mg尼古丁組紅色免疫熒光信號強(qiáng)弱與0mg尼古丁組相似(圖5C、F)。對照組、0mg尼古丁組和12mg尼古丁組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目(85.5±2.38、81.75±2.63、81±3.16個/毫米)無明顯差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.089，P=0.0952，圖6)。

2.3小鼠RPE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變RPE細(xì)胞位于Bruch膜上,對照組RPE細(xì)胞內(nèi)可見黑色素顆粒,細(xì)胞頂部可見十分豐富的細(xì)長微絨毛(圖7A)；0mg尼古丁組RPE細(xì)胞內(nèi)仍可見黑色素顆粒，但是細(xì)胞頂部微絨毛數(shù)量明顯減少，僅可見零星的微絨毛，殘存的微絨毛長度變短(圖7B)；12mg尼古丁組RPE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變與0mg尼古丁組相似(圖7C)。

2.4小鼠視網(wǎng)膜8-OHdG免疫熒光染色正常組小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)偶爾在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)見到核呈淡紅色的8-OHdG免疫熒光信號，其余各層未見明顯陽性表達(dá)(圖8A、D)。實驗組(0mg尼古丁組和12mg尼古丁組)小鼠視網(wǎng)膜GCL內(nèi)可見多個核漿著色的較強(qiáng)紅色8-OHdG免疫熒光信號,內(nèi)核層內(nèi)可見較弱紅色8-OHdG免疫熒光信號，其余各層未見明顯陽性表達(dá)(圖8B、C、E、F)。

3討論

近年來電子煙因具有戒煙、清肺的宣傳作用，且具有與傳統(tǒng)香煙相近的外觀、煙霧、味道和吸食口感而被消費者青睞[6]。Farsalinos等[11]對20種電子煙煙液與傳統(tǒng)香煙煙氣的體外毒性效應(yīng)進(jìn)行分析表明，電子煙煙液的細(xì)胞毒性均小于傳統(tǒng)香煙煙氣，但仍有毒性影響，可能主要與煙液內(nèi)添加的香味成分有關(guān)。Bahl等[12]報道不同電子煙煙液的細(xì)胞毒性差距很大，Behar等[13]則進(jìn)一步證明電子煙煙液造成的細(xì)胞毒性與其內(nèi)的肉桂添加劑有關(guān)。有研究證實[14],電子煙煙液可致小鼠肺、膀胱等器官DNA損傷。傳統(tǒng)香煙與視網(wǎng)膜相關(guān)疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性有密切關(guān)系，但電子煙是否也會造成視網(wǎng)膜病理改變并繼而引發(fā)相關(guān)疾病卻鮮有報道。

圖5 三組小鼠視網(wǎng)膜Tuj1(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色情況(×200) A,D：正常對照組；B,E：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C,F：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。三角指示在神經(jīng)纖維層Tuj1的染色，箭頭指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

圖6 三組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的比較 A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。

圖7 三組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞頂部微絨毛的改變(×4000) A：正常對照組；B：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。

視網(wǎng)膜是一層柔軟而透明的膜,緊貼在脈絡(luò)膜內(nèi)面，可以感受光的刺激。視網(wǎng)膜從外向內(nèi)分為10層，分別為色素上皮層(由單層色素上皮細(xì)胞構(gòu)成)、視桿視錐層(由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的外突構(gòu)成)、外界膜(由Müller細(xì)胞的外突末端連接而成)、外核層(由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的細(xì)胞體組成)、外叢狀層(由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的內(nèi)突及雙極細(xì)胞的樹突構(gòu)成)、內(nèi)核層(由雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞和Müller細(xì)胞的胞體構(gòu)成)、內(nèi)叢狀層(由雙極細(xì)胞的軸突和無長突細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞的樹突構(gòu)成)、節(jié)細(xì)胞層(由節(jié)細(xì)胞的胞體組成)、神經(jīng)纖維層(由節(jié)細(xì)胞的軸突組成)、內(nèi)界膜(由Müller細(xì)胞的內(nèi)突末端連接而成)。有研究顯示在慢性吸煙人群中神經(jīng)纖維層的厚度明顯減少[15]，在本實驗中我們也觀察到類似的結(jié)果，即兩個實驗組的神經(jīng)纖維層厚度較對照組明顯減少，這說明電子煙也可能對視網(wǎng)膜造成與傳統(tǒng)煙相似的損傷。但是三組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)細(xì)胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，我們推測可能是由于個體間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的差異較大造成的[15]。但值得關(guān)注的是我們觀察到實驗組內(nèi)叢狀層厚度較對照組明顯減少，有研究表明內(nèi)叢狀層厚度的變化可一定程度反映神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的變化[16]，雖然如前所述三組間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但是實驗組的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較對照組明顯紊亂，這一現(xiàn)象也許和內(nèi)叢狀層厚度減少有關(guān),這還需在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步探討。

視網(wǎng)膜色素上皮層與脈絡(luò)膜相連，是由單層色素上皮細(xì)胞構(gòu)成，排列十分規(guī)則。RPE細(xì)胞位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層和Bruch膜之間,底部緊鄰Bruch膜，由一層六面柱狀單層細(xì)胞組成，是血-眼屏障和血-視網(wǎng)膜外屏障的主要組成部分，有一定的抗氧化能力,在維持視網(wǎng)膜微環(huán)境和保護(hù)視網(wǎng)膜中神經(jīng)元等方面起到了一定的作用。Masashi等的研究表明傳統(tǒng)煙煙霧會造成小鼠視網(wǎng)膜RPE細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，這與年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生密切相關(guān)[17]。在我們實驗中，RPE層組織病理學(xué)觀察未見明顯變化，電子顯微鏡下我們觀察到兩個實驗組小鼠RPE細(xì)胞頂部微絨毛數(shù)量顯著減少且排列不規(guī)則,殘存的微絨毛結(jié)構(gòu)也被破壞，長度變短，說明電子煙對于RPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)同樣具有損傷作用，提示電子煙也可能與年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生有關(guān)。

吸煙會增加氧化應(yīng)激的水平,香煙煙霧中的化學(xué)氧化劑會引起蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)的氧化損傷[18-21]。有大量證據(jù)表明DNA氧化損傷與吸煙的影響關(guān)系密切，氧化損傷的核苷也隨著時間增加而在細(xì)胞核和線粒體DNA中積累[22]。8-OHdG是核苷2’-脫氧鳥苷的氧化形式,是DNA的氧化產(chǎn)物,它是一個很好的標(biāo)記DNA氧化損傷的指標(biāo)[23]。Higuchi等報道經(jīng)過香煙煙霧作用后，大鼠角膜內(nèi)8-OHdG可以表達(dá)上調(diào)，但是電子煙煙霧對于人體甚至視網(wǎng)膜的影響作用鮮有報道，在本實驗中我們觀測到8-OHdG在視網(wǎng)膜(節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層)的陽性表達(dá),也能反映電子煙煙霧對于視網(wǎng)膜有一定的氧化損傷作用[24]。煙草中最主要的生物堿-尼古丁會導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管收縮，造成缺氧，引起血管內(nèi)皮生長因子上調(diào)，從而誘發(fā)新生血管的形成[25]。另外，尼古丁還可以引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，在RPE細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，損傷線粒體，最終導(dǎo)致RPE細(xì)胞凋亡[25-26]。在本實驗中，我們觀察到0mg尼古丁組和12mg尼古丁組之間在視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、RPE超微結(jié)構(gòu)以及氧化損傷指標(biāo)上沒有明顯差異，這提示電子煙引起的損傷不僅僅是尼古丁的單獨作用，而應(yīng)該是由煙油中各種有害物質(zhì)的疊加作用所形成的。

圖8 三組小鼠視網(wǎng)膜8-OHdG(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色情況(×200) A,D：正常對照組；B,E：0mg尼古丁電子煙干預(yù)；C,F：12mg尼古丁電子煙干預(yù)。箭頭指示為在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層中8-OHdG染色陽性的細(xì)胞。

綜上所述，電子煙可以對小鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和RPE細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上造成改變,同時節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層均觀察到8-OHdG表達(dá)增加，我們推測可能是電子煙干預(yù)所引起的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)。但由于我們的干預(yù)時間較短，還未造成顯著的不可逆損傷，未引起明顯的組織病理學(xué)改變。這些研究結(jié)果將為我們后期進(jìn)一步探究電子煙對視網(wǎng)膜的長期影響以及相關(guān)機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步科學(xué)評價電子煙對機(jī)體的影響，積極尋求有效研究方法，為臨床診療提供科學(xué)依據(jù)。