姜黃素對結(jié)直腸癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其PTEN/PI3K/Akt 信號通路機(jī)制

裴永彬, 王桂琦, 李 衛(wèi), 姜 霞, 姜海波, 趙增仁

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外三科，河北 石家莊 050031）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展涉及多系統(tǒng)多組織的動態(tài)變化過程，多種信號通路參與結(jié)直腸癌的發(fā)病過程。在眾多分子機(jī)制中，第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白的同源基因 （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/磷酯 酰 肌 醇-3 激 酶 （phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路為非常重要的一環(huán)，該信號通路參與結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移等多種病理過程，抑制該信號通路對抑制結(jié)直腸癌生長具有重要意義［1］。姜黃素為一種植物多酚，從植物姜黃根莖中提取，具有抗氧化、抗炎、抗動脈硬化、降血脂和抗腫瘤等多種藥理作用［2］。姜黃素的抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤增殖和促進(jìn)腫瘤凋亡實(shí)現(xiàn)的［3］。姜黃素可通過多種信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用，李 秀 娟 等［4］研 究 發(fā) 現(xiàn)：姜 黃 素 可 通 過 抑 制PTEN/PI3K/Akt 信號通路進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡。姜黃素對結(jié)直腸癌也具有抑制作用，盧曉云等［5］研究發(fā)現(xiàn)：姜黃素可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抑制結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的作用。但姜黃素對結(jié)直腸癌PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響尚不清楚。本研究通過接種結(jié)直腸癌細(xì)胞建立小鼠結(jié)直腸癌模型，觀察姜黃素對結(jié)直腸癌腫瘤生長及PTEN/PI3K/Akt 信號通路的影響，探討姜黃素抑制結(jié)直腸癌的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞、主要試劑和儀器SPF 級BABL/c 小鼠，體質(zhì)量19～23 g、雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京） 2012-0001。人結(jié)直腸癌LOVO 細(xì)胞（上海中科院）。姜黃素（純度≥95%，美國Sigma公司），RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶（上海安博廣利生物科技有限公司），Western blotting 相關(guān)試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA） 多克隆抗體、兔抗鼠人髓細(xì)胞增生原癌基因c-Myc 多克隆抗體、兔抗鼠天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3 （cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase 3） 多 克 隆 抗體、兔抗鼠PTEN 多克隆抗體、兔抗鼠Akt 多克隆抗體和兔抗鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（美國CST公司）。BX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制備60 只BABL/c 小鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組，每組15只。按照文獻(xiàn)［6］的方法建立小鼠結(jié)直腸癌模型，具體方法：取結(jié)直腸癌LOVO 細(xì)胞，在RPMI-1640 全培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代，取對數(shù)期生長的結(jié)直腸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL－1，將其接種至小鼠右前肢腋部皮下，每只小鼠接種0.2 mL。接種后7 d，檢測每只小鼠腋下腫瘤直徑，腫瘤直徑＞10 mm 表示造模成功。模型組、低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組各建模成功12、14、13 和13 只小鼠。各組小鼠建模成功后處理：低、中和高劑量姜黃 素 組 分 別 給 予25、50 和100 mg·kg－1姜 黃 素 灌胃［7］，共4 周；模型組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，共4 周。

1.3 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的檢測各組小鼠末次灌胃24 h 后，脫頸處死，取出腋部皮下腫瘤組織，游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織長短徑，稱取腫瘤組織質(zhì)量，計算腫瘤體積和抑瘤率。腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2，抑瘤率=（模型組小鼠腫瘤體積—目標(biāo)組小鼠腫瘤體積）/模型組小鼠腫瘤體積×100%。

1.4 免疫組織化學(xué)染色檢測各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達(dá)情況及細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferationindex，PI）取各組小鼠腫瘤組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，加入H2O2孵育20 min 消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 緩沖液沖洗，檸檬酸修復(fù)抗原，山羊血清封閉10 min，加入一抗兔抗鼠PCNA 多克隆抗體（1∶300）過夜孵育，PBS 緩沖液沖洗，加入HRP 多聚體標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗，DAB 顯色，反應(yīng)呈棕黃色時終止染色，蒸餾水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中心樹膠封片，顯微鏡下觀察染色情況。結(jié)果判定：顯微鏡下細(xì)胞核被染成棕褐色或棕黃色為陽性細(xì)胞，在400 倍視野下拍照，計算PI，PI=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)取小鼠腫瘤組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成后4 μm 厚切片，脫蠟至水，常規(guī)HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋 白 表 達(dá) 水平取各組小鼠腫瘤組織100 mg，加入RIPA 研磨碎，提取總蛋白，BCA 法測定腫瘤組織蛋白濃度，取50 μg 蛋白上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗兔抗鼠c-Myc 多克隆抗體、兔抗鼠caspase3 多克隆抗體、兔抗鼠PTEN 多克隆抗體、兔抗鼠Akt 多克隆抗體和兔抗鼠p-Akt 多克隆抗體，稀釋比例為1∶1 000，過夜孵育，加入二抗（1∶5 000） 孵 育1 h，加 入ECL 顯 影，采 用Vilber FusionCapt Advance 軟件測定蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組小鼠腫瘤體積，腫瘤質(zhì)量，抑瘤率，腫 瘤 組 織PI，腫 瘤 組 織 中c-Myc、 caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量和抑瘤率各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05）；與低劑量姜黃素組比較，中和高劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）；與中劑量姜黃素組比較，高劑量姜黃素組小鼠腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05），抑瘤率明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量和抑瘤率Fig.1 Tumor volumes, tumor weights and inhibitory rates of tumor of mice in various groups

2.2 各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達(dá)情況及PI 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：模型組小鼠腫瘤組織中可見大量PCNA 陽性細(xì)胞；與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且呈劑量依賴性。見圖2。與模型組（78.56±12.31） 比較，低、中和高劑量姜黃素 組 小 鼠 腫 瘤 組 織PI （62.14±10.36、36.26±9.17 和19.75±5.21）明顯降低（P＜0.05）；不同劑量姜黃素組間小鼠腫瘤組織PI 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測各組小鼠腫瘤組織中PCNA 蛋白表達(dá)情況（×200）Fig. 2 Expressions of PCNA protein in tumor tissue of mice in various groups detected by immunohistochemistry staining(×200)

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)模型組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞排列紊亂，核質(zhì)比例增加，核染色深；與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中細(xì)胞排列相對整齊，核質(zhì)比例下降，核染色淺，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.3 Pathomorphology of tumor tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.4 各組小鼠腫瘤組織中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平各組小鼠腫瘤組織中Akt 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量姜黃素組比較，中和高劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白 表 達(dá) 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與中劑量姜黃素組比較，高劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見圖4 和圖5。

3 討 論

姜黃素是姜黃發(fā)揮作用的主要活性成分，具有通經(jīng)止痛和破血行氣等功效，對多種疾病具有治療作用［8］。本研究結(jié)果顯示：姜黃素可降低結(jié)直腸癌小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積，抑制結(jié)直腸癌腫瘤組織生長。近年來，姜黃素在抗腫瘤方面的作用日益受到重視，在多種惡性腫瘤中，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生長和抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用［9-10］。姜黃素對結(jié)直腸癌細(xì)胞也有抑制作用，如姜黃素可通過靶向PBK 抑制結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞增殖［11］；姜黃素可抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移［12］。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，表明姜黃素對結(jié)直腸癌的生長具有抑制作用。

本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織細(xì)胞排列相對整齊，核質(zhì)比例下降，核染色淺；腫瘤組織中PCNA 陽性細(xì)胞明顯降低，呈劑量依賴性；腫瘤組織PI 值降低，c-Myc蛋白表達(dá)水平降低，caspase3 蛋白表達(dá)水平升高。PCNA 是一種公認(rèn)的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，根據(jù)PCNA計算得到的PI 可反應(yīng)組織細(xì)胞的增殖能力［13］。c-Myc 既是一種易位基因，又是一種調(diào)節(jié)基因，可促進(jìn)細(xì)胞分裂，使細(xì)胞無限增殖獲得永生化功能，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；在惡性腫瘤中c-Myc蛋白表達(dá)水平升高，在一定程度上反映細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)［14］。本研究結(jié)果顯示：各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PCNA 和c-Myc 蛋白表達(dá)水平降低及PI 值降低，表明姜黃素具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用。caspase 家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件，caspase3 的高表達(dá)均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；caspase3 處于細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，是重要的效應(yīng)型caspase，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其活化標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段［15］。本研究中各劑量姜黃素組腫瘤組織中caspase3 蛋白表達(dá)水平升高，表明姜黃素可促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡，提示姜黃素可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對結(jié)直腸癌生長的抑制作用。

圖4 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中c-Myc 和caspase3 蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖（B）Fig. 4 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of c-Myc and caspase3 proteins in tumor tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡受多種信號通路調(diào)控，PTEN/PI3K/Akt 信號通路在腫瘤生長中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用［16］。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，各劑量姜黃素組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達(dá)水平升高，p-Akt 蛋白表達(dá)水平降低。PTEN 為抑癌基因，PTEN 表達(dá)上調(diào)可能是由于PI3K 的活化產(chǎn)物PIP3 去磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)PIP3 水平降低，進(jìn)而抑制Akt 激活，導(dǎo)致活化的p-Akt 水平降低［17-18］。c-Myc 為PTEN/PI3K/Akt 信 號 通 路 的 下游靶基因，PTEN/PI3K/Akt 信號通路的激活可促進(jìn)c-Myc 表 達(dá)，從 而 促 進(jìn) 腫 瘤 細(xì) 胞 增 殖［19］。caspase3 也 受PTEN/PI3K/Akt 調(diào) 控，PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活可抑制下游caspase3 蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡［20］。在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活，PTEN 水平降低，p-Akt 水平升高，抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路活化可抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究［21-22］顯示：姜黃素可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，姜黃素可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路抑制胃癌的生物學(xué)活性。本研究中，模型組小鼠腫瘤組織中PTEN 蛋白表達(dá)水平降低，p-Akt 蛋白表達(dá)水平升高，表明結(jié)直腸癌腫瘤組織中PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活；姜黃素處理后結(jié)直腸癌組織中PTEN 蛋白水平升高，p-Akt 蛋白水平降低，表明姜黃素可抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活。結(jié)合本研究中姜黃素對c-Myc 和caspase3 的影響，提示姜黃素可能通過抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活，導(dǎo)致下游c-Myc 蛋白水平降低、caspase3 蛋白水平升高，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對結(jié)直腸癌生長的抑制作用。

圖5 Western blotting 法檢測各組小鼠腫瘤組織中PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖（B）Fig. 5 Electrophoregram (A) and histogram(B) of PTEN, Akt and p-Akt proteins in tumor tissue of mice in various groups

綜上所述，姜黃素對結(jié)直腸癌的生長具有抑制作用，其機(jī)制可能是姜黃素通過抑制PTEN/PI3K/Akt 信號通路激活抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。