五倍子酸通過調(diào)節(jié)人肝癌HepG-2 細(xì)胞線粒體氧化磷酸化對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

張海英, 張文馨, 趙文靜, 李 偉

（1. 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 吉林省肝膽病醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS） 和糖酵解2 種糖代謝方式供應(yīng)能量ATP，常氧情況下，正常細(xì)胞糖代謝主要由線粒體OXPHOS 產(chǎn)生ATP 以提供代謝活動(dòng)所需要的能量。WARBURG 等［1］認(rèn)為：腫瘤細(xì)胞由于線粒體呼吸缺陷，即使在有氧環(huán)境中也通過糖酵解供應(yīng)大部分ATP。但近期研究［2-4］表明：多數(shù)腫瘤細(xì)胞線粒體是完整的，即使有些細(xì)胞具有更高的糖酵解，但仍保持線粒體呼吸，在某些癌癥（包括白血病、淋巴瘤、胰腺導(dǎo)管腺癌、高OXPHOS 亞型黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌和高侵襲性腫瘤等）中線粒體OXPHOS 發(fā)揮重要作用，OXPHOS 是抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。五倍子酸（3，4，5-三羥基苯甲酸，gallic acid，GA） 也稱為沒食子酸或棓酸，是一種天然多酚類化合物，已證實(shí)其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系具有抗腫瘤活性［5-8］。但GA 對(duì)肝癌細(xì)胞線粒體OXPHOS 的抑制作用尚未見報(bào)道。本研究以人肝癌HepG-2 細(xì)胞為模型，首次采用Seahorse Extracellular Analyzer 細(xì)胞能量代謝分析儀檢測(cè)GA 作用下HepG-2 細(xì)胞量代謝動(dòng)態(tài)全過程，分析細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）、線粒體細(xì)胞色素C（cytochrome C，CytC） 和細(xì)胞中ATP 水平的變化，從細(xì)胞能量代謝和與之密切相關(guān)的細(xì)胞器線粒體出發(fā)，探討GA 抗肝癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG-2 細(xì)胞（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），GA （美國(guó)Chromadex 公司），線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體分離試劑盒和胞漿蛋白抽提試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司），CytC 單克隆抗體和β-actin 抗體（美國(guó)SAB 公司），化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（上海天能科技有限公司），胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），線粒體壓力檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Seahorse Bioscience 公司），ATP 檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkinelmer 公司），高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），電泳儀和半干轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 MTT 法檢測(cè)HepG-2 細(xì)胞存活率參照文獻(xiàn)［9］方法，HepG-2 細(xì)胞以 每 孔100 μ L （1×105mL－1） 接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 后分為對(duì)照組和不同濃度GA 組（加入終濃度0、3.125、 6.250、 12.500、 25.000、 50.000 和100.000 mg·L－1GA［10］），每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，作用24、48 和72 h 后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h 后終止培養(yǎng)棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO 充分溶解紫色結(jié)晶物，酶標(biāo)儀490 nm 下測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A 值－空白對(duì)照組A 值）/（對(duì)照組A 值－空白對(duì)照組A 值）×100%。

1.3 能量代謝分析儀檢測(cè)細(xì)胞線粒OXPHOS 水平對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG-2 細(xì)胞接種于Seahorse XFp專用板（8 000 個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h 后，分為對(duì)照組及6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 組，分別加入 含0、 6.25、 12.50 和25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培養(yǎng)基作用24 h，更換能量分析專用培養(yǎng)液，按照線粒體壓力測(cè)定試劑盒說明書配制試劑，能量代謝分析儀實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞線粒體耗氧率（oxygen consumption rate，OCR），代表細(xì)胞線粒體OXPHOS 活性，并根據(jù)OCR 值分析各組HepG-2 細(xì)胞的基礎(chǔ)有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲(chǔ)備能力和ATP 產(chǎn)生量。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞MMP每孔1×106個(gè)HepG-2 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 后分組同“1.3”，分別加入含（0、6.25、12.50 和25.0 mg·L－1）GA 的DMEM 培養(yǎng)基作用12 h，收集各組細(xì)胞按照Rhodamine123 染色試劑盒操作，激發(fā)波長(zhǎng)505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，流式細(xì)胞儀測(cè)定線粒體內(nèi)Rhodamine123 的熒光強(qiáng)度，以強(qiáng)熒光細(xì)胞百分率表示MMP。

1.5 比色法檢測(cè)細(xì)胞中ATP 水平細(xì)胞分組及處理同“1.4”，離心收集各組細(xì)胞，加入提取液，冰浴超聲波破碎5 min，4 ℃、12 000 r·min－1離心3 min，取上清，置冰上檢測(cè)。嚴(yán)格按照ATP 水平測(cè)定試劑盒操作，分光光度計(jì)在波長(zhǎng)636 nm 處測(cè)定各管A 值。ATP 水平（μmol·g－1prot）=（測(cè)定A 值－對(duì)照A 值） / （ 標(biāo) 準(zhǔn) A 值 － 空 白A 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（1×103μmol·L－1）× 樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白濃度（g·L－1）。

1.6 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞胞漿和線粒體中CytC 蛋白表達(dá)量細(xì)胞分組同“1.4”，收集GA處理48 h 的HepG-2 細(xì)胞，按照線粒體分離試劑盒操作制備線粒體裂解液，按照細(xì)胞胞漿蛋白抽提試劑盒操作制備胞質(zhì)部分裂解液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后，半干轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜（NC） 上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL 試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。膠片于暗室曝光后，掃描并觀察結(jié)果。

1.7 吖啶橙染色觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)細(xì)胞分組同“1.4”，收集GA 處理48 h 的HepG-2 細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107mL－1，95 μL 細(xì)胞懸液加入5 μL 吖啶橙儲(chǔ)存液（0.1 g·L－1），染色15 min 后取1 滴細(xì)胞懸液點(diǎn)于潔凈玻片上，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率每孔1×106個(gè)HepG-2 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后分為對(duì)照組及6.25、12.50 和25.00 mg·L－1組，更換含GA 0、 6.25、 12.50 和 25.00 mg·L－1GA 的DMEM 培養(yǎng)基作用48 h，離心收集細(xì)胞，按照Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作。每個(gè)樣品加入5 μL Annexin V 溶液和5 μL PI 溶液避光孵育15 min，最后各加入400 μL PBS緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。早期細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，晚期細(xì)胞凋亡率=晚期凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HepG-2 細(xì)胞存活率、基礎(chǔ)有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲(chǔ)備能力、ATP 產(chǎn)生量、MMP 和ATP 水平以及細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HepG-2 細(xì)胞存活率對(duì)照組HepG-2 細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，經(jīng)不同濃度GA 處理24、48 和72 h后，各劑量GA 組HepG-2 細(xì)胞存活率均不同程度降低（P＜0.05 或P＜0.01），并呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性。見圖1。

2.2 各組HepG-2 細(xì)胞線粒體OXPHOS與對(duì)照組比較，不同濃度GA 組HepG-2 細(xì)胞基礎(chǔ)有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲(chǔ)備能力和ATP 產(chǎn)生量均明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

圖1 GA 作用不同時(shí)間各組HepG-2 細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of HepG-2 cells in various groups after treated with GA for different time

圖2 各組HepG-2 細(xì)胞線粒體OXPHOSFig.2 Mitochondrial OXPHOS of HepG-2 cells in various groups

2.3 各組HepG-2 細(xì)胞MMP 和ATP 水平GA 作用24 h，HepG-2 細(xì)胞中強(qiáng)熒光細(xì)胞百分率逐漸減少。6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組強(qiáng)熒光細(xì)胞 百 分 率 即MMP 分 別 為（73.12±4.61）%、（65.49±4.32）%和（38.64±5.93）%，與對(duì)照組［（94.38±2.18）%］ 比較均明顯降低（P＜0.05），見圖3。與對(duì)照組比較，不同濃度GA 組細(xì)胞 中ATP 水 平 均 明 顯 降 低（P＜0.05 或P＜0.01），6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組 細(xì)胞中ATP 水平分別降低至61.11%、45.56% 和30.24%，見圖4。

圖3 各組HepG-2 細(xì)胞MMPFig.3 MMP of HepG-2 cells in various groups

圖4 各組HepG-2 細(xì)胞ATP 水平Fig. 4 Levels of ATP in HepG-2 cells in various groups

2.4 各組HepG-2 細(xì)胞胞漿和線粒體中Cyt C 表達(dá)量對(duì)照組HepG-2 細(xì)胞胞漿無Cyt C 特異條帶，不同濃度GA 組細(xì)胞胞漿均檢測(cè)到Cyt C 表達(dá)，隨著GA 濃度的增加胞漿中Cyt C 表達(dá)量明顯增加；各組細(xì)胞線粒體均有Cyt C 特異條帶出現(xiàn)，不同濃度GA 組線粒體中Cyt C 表達(dá)量隨著GA 劑量的增加呈降低趨勢(shì)。見圖5。

圖5 各組HepG-2 細(xì)胞胞漿和線粒體中Cyt C 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expressions of Cyt C protein in cytoplasm and mitochondria of HepG-2 cells in various groups

2.5 各組HepG-2 細(xì)胞凋亡形態(tài)表現(xiàn)及凋亡率對(duì)照組HepG-2 細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞質(zhì)呈均勻彌散綠色熒光，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則； GA 處理48 h 后不同濃度GA 組HepG-2 細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核碎裂，染色質(zhì)凝集，呈凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（圖6）。進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI 雙染定量檢測(cè)細(xì)胞 凋 亡 率，GA 作 用48 h 后，6.25、12.50 和25.00 mg·L－1GA 組 早 期 細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 為（10.8±0.8）% 、（18.7±0.7）% 和 （26.9±0.8）%，與對(duì)照組［（0.2±0.1）%］比較明顯升高（P＜0.05）；晚期細(xì)胞凋亡率分別為（1.8±0.4）%、（11.2±0.6）%和（20.1±0.5）%，與對(duì)照組［（0.3±0.1）%］比較明顯升高（P＜0.05）。見圖7。

圖6 吖啶橙染色觀察各組HepG-2 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（×100）Fig.6 Morphology of HepG-2 cells in various groups observed by acridine orange staining（×100）

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HepG-2 細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of HepG-2 cells in various groups detected by flow cytometry

3 討 論

全球50% 以上的新發(fā)和死亡肝癌患者在中國(guó)［11］。肝癌起病隱匿，外科手術(shù)是首選治療方法，但能獲得手術(shù)切除機(jī)會(huì)的患者僅占20%～30%［12］。肝癌患者術(shù)后5 年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%，存活率僅為20%～30%［13］。因此研發(fā)高效、低毒的抗肝癌藥物十分迫切［14-15］。本研究利用人肝癌HepG-2細(xì)胞，從細(xì)胞增殖、線粒體OXPHOS 抑制和細(xì)胞凋亡等方面觀察GA 對(duì)HepG-2 的抗腫瘤作用及潛在機(jī)制。

近年來，多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)［16-18］將OXPHOS 抑制劑用于腫瘤治療均取得了滿意的療效。ZHANG 等［16］研究發(fā)現(xiàn)：OXPHOS 抑制劑IACS-010759 在體內(nèi)體外可明顯抑制伊布替尼耐藥的套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。ZHAO 等［17］研究發(fā)現(xiàn)：維生素E 衍生物ESeroS GS 可通過下調(diào)己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）及具有電子傳遞功能的復(fù)合物Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ（complexⅡ/Ⅲ/Ⅳ） 等的表達(dá)，降低乳腺癌細(xì)胞MMP，同時(shí)抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解和OXPHOS，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；范霞霞等［18］研究表明：天然二萜衍生物Jar-TTA 通過雙重抑制糖酵解和線粒體OXPHOS誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與Jar-TTA 降低食管癌細(xì)胞MMP 進(jìn)而干擾線粒體OXPHOS 功能，以及下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLIT4） 和乳酸脫氫酶A（L-actate dehydrogenase A chain，LDHA）而抑制葡萄糖攝取和糖酵解進(jìn)程有關(guān)。線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM） 是OXPHOS 產(chǎn)生ATP 的部位，線粒體基質(zhì)中的三羧酸循環(huán)利用葡萄糖的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生煙酰胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NADH），并將其提供給位于線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC），線粒體ATP 合成酶利用ETC 產(chǎn)生的質(zhì)子梯度作為驅(qū)動(dòng)力催化ADP 磷酸化生成ATP［19-20］。本研究中首先采用MTT 法檢測(cè)GA 對(duì)HepG-2 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：在體外GA 可有效抑制HepG-2 細(xì)胞增殖；細(xì)胞能量代謝分析儀檢測(cè)GA可明顯抑制HepG-2 細(xì)胞線粒體OXPHOS 活性，與對(duì)照組比較，GA 處理組HepG-2 細(xì)胞基礎(chǔ)有氧呼吸、最大有氧呼吸能力、有氧呼吸儲(chǔ)備能力和ATP 產(chǎn)生量均明顯降低。

IMM 的完整和非滲透性保證了線粒體功能的正常［21］，MMP 反應(yīng)了沿著電子傳遞鏈電子傳遞而形成的質(zhì)子梯度，是線粒體功能完整性的指標(biāo)，其完整性主要由ETC 和ATP 合酶維持［22］。本研究結(jié)果顯示：GA 能明顯降低HepG-2 細(xì)胞MMP，減少ATP 產(chǎn)生。HepG-2 細(xì)胞MMP 下降，導(dǎo)致線粒體通透性增加，存在于線粒體中的Cyt C 釋放入胞漿，Cyt C 啟動(dòng)細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終激活半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡［23-25］。本研究中吖啶橙染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示： 不同濃度GA 在體外可誘導(dǎo)HepG-2 細(xì)胞凋亡，不同濃度GA 作用HepG-2 細(xì)胞48 h 后，早期細(xì)胞凋亡率達(dá)到和晚期凋亡細(xì)胞率達(dá)到均明顯提高。

綜上所述，本研究將細(xì)胞能量代謝與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)，闡明GA 可能通過降低HepG-2 細(xì)胞MMP，抑制線粒體OXPHOS 功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。GA 是否對(duì)線粒體中具有電子傳遞功能的complex Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ具有調(diào)控作用需進(jìn)一步研究。