aaptamine 與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)人肺腺癌順鉑耐藥A549/DDP 細(xì)胞的協(xié)同抑制作用

苗 雙, 倪 娜, 楊麗娟, 武 艷, 李雪琳, 董洪亮, 宮凱凱

（1. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603；2. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心，山東 濱州 256603）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占腫瘤致死率的27%，隨著大氣污染和吸煙人群的增加，肺癌成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手［1-3］。以鉑類為基礎(chǔ)的化療，尤其是順鉑（DDP），是治療肺癌最為有效的化療藥物［4］，然而肺癌細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重限制了DDP 的臨床應(yīng)用［5］，因此逆轉(zhuǎn)DDP 耐藥性或增強(qiáng)其化療敏感性是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題［6-7］。aaptamine 分離自尋常海綿綱海綿，是一種具有特殊苯并二氮雜萘母核的典型海洋來(lái)源生物堿［8］。研究［9-11］表明：aaptamine 具有良好的抗腫瘤活性，在慢性髓細(xì)胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中，aaptamine能夠不依賴于P53 誘導(dǎo)P21 的表達(dá)，在較低濃度時(shí)將細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期，而在較高濃度時(shí)則不同程度地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在DDP 耐藥的人胚胎細(xì)胞癌NT2-R 細(xì)胞中，aaptamine 能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)對(duì)蛋白表達(dá)譜分析推測(cè)c-myc 和P53 可 能 為aaptamine 的 作 用 靶 點(diǎn)［12］。BOWLING 等［13］發(fā) 現(xiàn)：aaptamine 可 以 與DNA 發(fā)生交聯(lián)作用因而具有細(xì)胞毒抗病毒活性。此外，F(xiàn)UNK 等［14］發(fā) 現(xiàn)：aaptamine 能 夠 通 過(guò) 干 擾DDP引起的DNA 損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR），減輕DDP 對(duì)大鼠腎細(xì)胞的作用。鑒于aaptamine 良好的抗腫瘤活性和對(duì)化療損傷的保護(hù)作用，有必要對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于aaptamine 聯(lián)合DDP 協(xié)同抑制肺癌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)天然產(chǎn)物分離技術(shù)，獲得aaptamine 單體，且證實(shí)aaptamine 可以明顯抑制肺癌A549 細(xì)胞和H1299 細(xì)胞的增殖。本研究通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法探討aaptamine 和DDP 聯(lián)合用藥對(duì)人肺腺癌DDP 耐藥細(xì)胞A549/DDP 的協(xié)同抑制作用及其抗耐藥分子機(jī)制，以期為克服腫瘤化療耐藥瓶頸提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人肺腺癌DDP 耐藥細(xì) 胞 A549/DDP 購(gòu) 自 美 國(guó) ATCC 細(xì) 胞 庫(kù)。aaptamine 為本實(shí)驗(yàn)室從海綿Aaptos suberitoides中分離得到，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，DDP 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司，B 細(xì)胞淋巴瘤2 原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 關(guān)X 蛋 白（Bcl-2-associated X，Bax）、 三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2 （ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2） 和切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross complementing group 1，ERCC1） 單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司，Tublin 抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司，倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek 公司。

圖1 aaptamine 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of aaptamine

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549/DDP 細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。

1.3 半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）的測(cè)定和藥物組合方案的篩選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP 細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種100 μL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后采用藥 物 處 理，DDP 濃 度 梯 度 為0、 1.25、 2.50、5.00、10.00 和20.00 mg·L－1，aaptamine 濃度梯度為0、1、2、4、8、16、32 和64 mg·L－1，每 孔行3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μ L CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，以僅加入培養(yǎng)基的對(duì)照孔為空白調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用Graphpad Prism 7.0 軟件計(jì)算IC50值，以藥物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的藥物濃度為IC50值。以aaptamine 的IC50值 為 參 考，設(shè) 置 濃 度 為5、 10、 15 和20 mg·L－1，為減少DDP 的不良反應(yīng)，將DDP 濃度設(shè)置為1 和2 mg·L－1，分別單獨(dú)加藥或兩兩組合，采用CCK-8 法考察單獨(dú)及聯(lián)合用藥后細(xì)胞的抑制率，利用CompuSyn 軟件中的Chou-Talalay 中效分析法［15］對(duì)CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI）值，若CI＜1，認(rèn)為兩藥為協(xié)同作用，CI＝1 為相加作用，CI＞1 為拮抗作用。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP 細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分為4組：對(duì)照組不加藥，aaptamine 組加入5 mg·L－1aaptamine，DDP 組 加 入1 mg·L－1DDP，聯(lián) 合 用 藥 組 加入5 mg·L－1aaptamine 和1 mg·L－1DDP，每 孔行3 個(gè)重復(fù)，分別在24、36、48、60 和72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的A 值，以僅加入培養(yǎng)基的對(duì)照孔為空白調(diào)零，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以平均A 值代表細(xì)胞增殖活性，對(duì)照組進(jìn)行均一化處理后，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制細(xì)胞生存曲線。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆數(shù)細(xì)胞分組方法同“1.4”。按每孔500 個(gè)A549/DDP 細(xì)胞的密度接種于12 孔板，每孔接種1 mL 細(xì)胞懸液。37 ℃孵育24 h 后加藥處理，后每隔3 d 更換1 次含有藥物的培養(yǎng)液，處理14 d 后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液洗脫3 次，結(jié)晶紫染色20 min，PBS 緩 沖 液 洗 脫3 次，拍 照，采 用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)，以細(xì)胞克隆數(shù)＞50 計(jì)為1 個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移率細(xì)胞分組方法同“1.4”。將A549/DDP細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右時(shí)用200 μL 無(wú)菌槍頭劃痕并加藥處理，加藥0、24 和48 h 后于倒置顯微鏡下觀察、拍照，采用Image J 軟件對(duì)劃痕距離進(jìn)行分析，并用Graphpad Prism 7.0 軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕間距－24 或48 h 劃痕間距）/0 h 劃痕間距×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率細(xì)胞分組方法同“1.4”。 將A549/DDP 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后加藥處理。藥物處理48 h 后收集細(xì)胞，采用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌2 次并輕輕重懸于100 μL 結(jié)合緩沖液中，采用5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC和5 μL PI 溶液染色，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用FlowJo 7.6 軟件進(jìn)行進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞凋亡率＝（早期凋亡細(xì)胞數(shù)＋晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ABCG2、ERCC1、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平細(xì)胞分組方法同“1.4”。 將A549/DDP 細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，每孔接種1 mL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h 后用藥處理。藥物處理72 h 后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量蛋白濃度，取30 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 后，PVDF 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（1∶1 000） 孵育過(guò)夜，TBST 清洗，二抗（1∶2 000） 孵育2 h，TBST 清洗，ECL 顯色曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Image J 分析軟件，以Tubulin 蛋白為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性、克隆數(shù)、細(xì)胞劃痕愈合率、細(xì)胞凋亡率及各蛋白表達(dá)水平和Bax/bcl-2 比值，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1aaptamine 和DDP 的IC50 值 及 聯(lián) 合 用 藥 藥 物濃度的確定首先測(cè)定aaptamine 和DDP 單獨(dú)用藥對(duì)A549/DDP 細(xì) 胞 的IC50值，aaptamine 和DDP 的IC50值分別為19.45 和12.86 mg·L－1。采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度aaptamine 與不同濃度DDP 單獨(dú)或聯(lián)合用藥后A549/DDP 細(xì)胞抑制率，并用CompuSyn 軟件計(jì)算兩者的CI，結(jié)果顯示：5、10、15 和20 mg·L－1aaptamine 與1 或2 mg·L－1DDP的CI 均小于1，說(shuō)明二者均有協(xié)同作用，當(dāng)aaptamine 濃度為5 mg·L－1、DDP濃度為1 mg·L－1時(shí)，A549/DDP 細(xì)胞的抑制率為41%。因此為減少藥物的不良反應(yīng)，選擇最小的藥物濃度，即aaptamine 5 mg·L－1和DDP 1 mg·L－1作 為 后 續(xù) 實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 各組A549/DDP 細(xì)胞增殖活性加藥處理后48、60 和72 h，與 對(duì) 照 組、aaptamine 組 和DDP 組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性Fig. 2 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.3 各組A549/DDP 細(xì)胞克隆數(shù)加藥處理后各組細(xì)胞培養(yǎng)14 d，聯(lián)合用藥組細(xì)胞克隆數(shù)（42.0±8.0）明顯低于對(duì)照組（180.5±25.0）、aaptamine組（144.5±15.0） 和 DDP 組 （115.5±12.0）（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)晶紫染色觀察各組細(xì)胞克隆形成能力Fig.3 Colonal formation abilities of cells in various groups detected with crystal violet

2.4 各組A549/DDP 細(xì)胞遷移率加藥處理24 h后，對(duì)照組、aaptamine 組、DDP 組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率分別為（55.00±5.31）%、（45.80±4.83）% 、 （29.40±3.57）% 和 （17.30±2.31）%；加藥處理48 h后，對(duì)照組、aaptamine組、DDP 組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率分別為（70.40±8.31）%、（67.70±5.25）%、（54.50±4.89）%和（27.8±2.19） %。加藥處理24 和48 后，與對(duì)照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移率明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力（×40）Fig.4 Migration abilities of cells in various groups detected by scratch assay（×40）

2.5 各組A549/DDP 細(xì)胞凋亡率對(duì)照組、aaptamine 組、DDP 組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率分別 為 （13.97±4.05）% 、（29.65±2.09）% 、（45.03±5.05）%和（56.40±2.95）%，與 對(duì) 照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

2.6 各 組A549/DDP 細(xì) 胞 中ABCG2 和ERCC1 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比值與對(duì)照組、aaptamine 組和DDP 組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中ABCG2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.01）；與對(duì)照組比較，聯(lián)合組A549/DDP 細(xì)胞中ERCC1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖6 和表1。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

圖6 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ABCG2、ERCC1、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of ABCG2，ERCC1, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

肺癌化療耐藥性的產(chǎn)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜 過(guò) 程［16-18］。研 究［19-23］表 明：ABCG2 和ERCC1在肺癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，并與鉑類耐藥有密切關(guān)聯(lián)。ABCG2 是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體家族內(nèi)一種耐藥蛋白，可以將大部分化療藥物泵出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生［24］。ERCC1 在核苷酸切除修復(fù)途徑中起到重要作用，是修復(fù)順鉑引起的DNA 損傷所必須的，其過(guò)表達(dá)與順鉑耐藥有密切關(guān)聯(lián)［24-25］。因此下調(diào)ABCG2 和（或）ERCC1 的表達(dá)，有利于逆轉(zhuǎn)DDP 耐藥，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。

表1 各組A549/DDP 細(xì)胞中ABCG2 和ERCC1 蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2 比值Tab. 1 Expression levels of ABCG2 and ERCC1 proteins and ratios of Bax/Bcl-2 in A549/DDP cells in various groups

近年來(lái)，海洋天然產(chǎn)物在抗腫瘤新藥研發(fā)中越來(lái)越受到關(guān)注［26］，目前已有6 種被FDA 批準(zhǔn)的該類 抗 腫 瘤 藥 物［27］。aaptamine 是aaptos 屬 海 綿 中 的特征性成分，前期研究［9-12，14］表明：aaptamine 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制活性，但未見(jiàn)其與DDP 聯(lián)合用藥的相關(guān)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：aaptamine 與DDP 聯(lián)合用藥可明顯抑制A549/DDP細(xì)胞的增殖、克隆形成和遷移能力，并且通過(guò)增加凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 表達(dá)水平的比例促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；另外，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和單獨(dú)用藥組均明顯下調(diào)，ERCC1 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)，表明聯(lián)合用藥抑制ABCG2 和ERCC1 的蛋白表達(dá)。 推測(cè)aaptamine 與DDP 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549/DDP 細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，其分子機(jī)制可能與抑制耐藥基因的表達(dá)有關(guān)，但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，低濃度aaptamine 聯(lián)合低濃度DDP能明顯增強(qiáng)肺癌A549/DDP 細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性，兩藥聯(lián)合使用不僅提高了藥物治療效果，還可以減少單一藥物的使用劑量，進(jìn)而減輕藥物的不良反應(yīng)。本研究為逆轉(zhuǎn)DDP 耐藥提供了新思路。