一株樟子松-褐環(huán)乳牛肝菌菌根輔助細(xì)菌的篩選和鑒定

宋小雙，鄧 勛，遇文婧，閔 凱，周 琦

（1.黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱150040；2.黑龍江省森林草原火災(zāi)及病蟲害防控重點實驗室，哈爾濱150040；3.大慶油田礦區(qū)服務(wù)事業(yè)部，黑龍江 大慶163000）

外生菌根菌在促進(jìn)植物生長、提高養(yǎng)分吸收和抗逆性方面發(fā)揮不可替代的重要作用[1-2]。 外生菌根菌在植物根際不是獨立存在的，與菌根際真菌、細(xì)菌和放線菌等微生物存在復(fù)雜緊密的相互作用[3]，菌根際微生物的存在對菌根-宿主植物共生結(jié)構(gòu)的合成、菌根菌菌絲的生長可產(chǎn)生顯著的影響[4]。 其中，菌根輔助細(xì)菌（mycorrhiza helper bacteria,MHB）是指可以促進(jìn)菌根真菌生長、在宿主植物根部定殖形成菌根共生結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)植物生長的細(xì)菌類群[5-6]，目前，主要包括農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)[7]、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)以及放線菌鏈霉菌屬(Streptomyces)[8]等。 目前, 研究者對黑松-美味牛肝菌[9-10]、黑松—黃色須腹菌[11]、馬尾松-彩色豆馬勃[12-13]、楊樹-劣味乳菇[14]等菌根輔助細(xì)菌都進(jìn)行了分離篩選研究，篩選的菌根輔助細(xì)菌包括蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、短芽孢桿菌(Brevibacillus reuszeri)、蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)等可顯著促進(jìn)菌根菌絲生長和提高菌根合成效率。

樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）是歐洲赤松（P.sylvestris）的地理變種，由于其樹高及綠化特征常被用作觀賞樹種進(jìn)行種植，此外，其具有耐寒、耐旱、適應(yīng)性強(qiáng)、生長快等特點，目前是我國“三北防護(hù)林工程”和“治沙工程”建設(shè)的主要針葉造林樹種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用[15-16]。 目前，針葉苗木苗圃生產(chǎn)中普遍面臨化學(xué)農(nóng)藥過量使用導(dǎo)致的病害發(fā)生嚴(yán)重、土壤環(huán)境破壞、苗木長勢不好等問題[17]，根際益生菌的人工引進(jìn)可以提高植物抗性、改善根際土壤微生態(tài)環(huán)境，對于苗木的生長及后續(xù)造林成活率均有重要意義[17-18]。 目前，樟子松項目組在褐環(huán)乳牛肝菌-樟子松互作研究中積累了豐富的研究成果，褐環(huán)乳牛肝菌可提高樟子松耐旱性[19-21]、耐鹽性[22]，同時褐環(huán)乳牛肝菌與根際益生菌互作可提高樟子松抗病性[23-24]。為提高褐環(huán)乳牛肝菌-樟子松菌根合成效率，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，重點聚焦褐環(huán)乳牛肝菌-樟子松菌根輔助細(xì)菌的分離篩選，并探討MHB 及其與外生菌根菌互作對樟子松生長的影響，以期為進(jìn)一步挖掘樟子松根際益生菌資源，制備復(fù)合微生物菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試外生菌根菌：褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）N94 保存于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林微生物實驗室，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)。

供試細(xì)菌：共篩選的75 株細(xì)菌分離自樟子松-褐環(huán)乳牛肝菌1 年生菌根苗根際土，菌根苗為課題組人工合成，培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)溫室。 供試細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，保存于黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林微生物實驗室。

樟子松種子：購自遼寧省彰武縣章古臺遼寧固沙所試驗林場。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH 值5.6），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，pH 值7.4），R2A 培養(yǎng)基（蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，葡萄糖0.5g，酵母粉0.5g，水解酪蛋白0.5g，磷酸氫二鉀0.3g，丙酮酸鈉0.3g，無水硫酸鎂0.024g，蒸餾水1000mL，pH 值7.0±0.2）。 上述培養(yǎng)基加入18g 瓊脂粉制備成固體培養(yǎng)基。

1.2 細(xì)菌菌體與外生菌根真菌干皿對抗試驗

細(xì)菌菌體懸濁液的制備：將71 株供試細(xì)菌活化后，少量接種于裝有20mL R2A 液體培養(yǎng)基（100mL 三角瓶）中，28℃180r·min-1振蕩培養(yǎng)72h。4℃5000r·min-1離心5min，用無菌生理鹽水潤洗菌體2 次后，加入適量無菌生理鹽水混勻后即為菌體懸濁液。

改良的干皿對抗法[13]：取滅菌培養(yǎng)皿，用無菌打孔器切取在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)15d 的褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌餅（直徑10mm、厚度5mm），倒置放在滅菌干培養(yǎng)皿中，每皿放置3 塊，在菌餅中央滴加25μL 供試細(xì)菌菌體懸濁液，25℃恒溫培養(yǎng)。 每隔6d 添加25μL 0.01mol·L-1的葡萄糖溶液，防止菌塊干燥。 待菌塊生長12～16d 后，借助體式顯微鏡觀測菌餅菌絲生長狀況。 以滴加生理鹽水的作為對照，每處理設(shè)6 個重復(fù)。

1.3 細(xì)菌胞外代謝產(chǎn)物對外生菌根真菌的促生測定

平板互作試驗：細(xì)菌活化后，接種于裝有20mL R2A 液體培養(yǎng)基中，28℃160r·min-1振蕩培養(yǎng)72h，0.22μm細(xì)菌過濾器過濾后即為含胞外代謝產(chǎn)物的無菌濾液。 將1mL 以上濾液與9mL PDA 培養(yǎng)基混合倒平板后，接種N94 菌塊于培養(yǎng)皿中央，置于恒溫培養(yǎng)，25℃，14d 后觀測其菌落半徑，以無菌水處理作為對照。

液體共培養(yǎng)試驗：每50mL PD 液體培養(yǎng)基中加入3 塊N94 菌餅（直徑10mm，厚度5mm），同時加入5mL 無菌濾液，25℃160r·min-1培養(yǎng)14d，定性濾紙過濾，烘箱中60℃烘至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，以PD 空白培養(yǎng)液為對照，每處理3 個重復(fù)。

1.4 MHB 潛力菌株與外生菌根菌雙接種對樟子松生長的影響

樟子松育苗[25]：將供試種子用0.5%高錳酸鉀消毒30min，清水沖洗數(shù)次后，用滅菌濕紗布包裹保濕，置于25℃人工氣候箱中催芽，每天早晚用無菌水各沖洗1 次，直至出芽。 將經(jīng)催芽的樟子松種子播入含有無菌育苗基質(zhì)（草炭土、蛭石和河沙按2∶1∶1 的體積比例配制滅菌）的營養(yǎng)缽（直徑15cm×高13cm）中，每缽30 顆種子，待幼苗出土后，定苗至每缽10 株，在溫室大棚種進(jìn)行常規(guī)管護(hù)。

菌劑制備及接種： 將褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌餅接種到250ml （500mL 三角瓶）PD 培養(yǎng)基中，25℃160r·min-1培養(yǎng)20d 制備成液體菌根菌劑。 按照1%比例（體積比）吸取R2A 種子液接種到200mL（500mL 三角瓶）R2A 液體培養(yǎng)基中，28℃160r·min-1振蕩培養(yǎng)72h，調(diào)整菌液濃度為1.0×107cfu·mL-1，進(jìn)行接種試驗。

接種試驗設(shè)計：出苗30d 后進(jìn)行外生菌根菌和MHB 潛力菌株接種，接種量MHB 菌液15mL·缽-1，外生菌根菌50mL·缽-1，在苗根部附近打孔，緩緩注入菌液。 設(shè)定4 個處理：（1）單獨接種細(xì)菌；（2）單獨接種外生菌根菌；（3）復(fù)合接種細(xì)菌+外生菌根菌；（4）無菌水對照，每個處理10 缽，100 株苗，接種完畢后置于溫室中進(jìn)行常規(guī)管護(hù)。

生長指標(biāo)測定：在接種處理3 個月后，取樣進(jìn)行生長指標(biāo)測定，測量苗高、地徑指標(biāo)。

菌根侵染率測定[26]：每個處理隨機(jī)抽取5 株松苗，將樟子松苗根系小心取出洗凈，并用吸水紙將水吸干，以1cm 為標(biāo)準(zhǔn)在根系上下及周圍部位隨機(jī)取100 個根段， 用解剖鏡觀察記錄形成菌根根段數(shù)量， 計算菌根侵染率。 每處理取5 株松苗。

1.5 MHB 菌株鑒定

MHB 細(xì)菌形態(tài)、生理生化特征：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[27]和《微生物學(xué)實驗》[28]的方法進(jìn)行。

16S rRNA 基因序列分析： 將篩選得到的MHB 細(xì)菌接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，180r·min-1振蕩培養(yǎng)48h后，12000r·min-1離心5min 收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化）提取基因組DNA，使用16S rRNA 基因通用引物27F（5’-ACTCCTA CGGGAGGCAG-3’）和1492R（5’-GGCGTCTGTACAAGGCCCGG-3’）對基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 反應(yīng)體系：2×Taq PCR Mastermix 25μL、10mmol·L-127F primer 1μL、10mmol·L-11492R primer 1μL、DNA 模板1μL，加無菌ddH2O 至反應(yīng)總體積50μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30 個循環(huán)；72℃5min，4℃保存。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用Universal DNA 純化回收試劑盒（天根生化）進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送南京金瑞斯生物科技公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BlastN 比對， 并將序列提交到GenBank 中獲得基因登錄號， 將相似率較高模式菌株的16S rRNA 基因序列用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌株分類地位鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用WPS 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)編輯整理，使用SPSS 19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHB 潛力菌株對褐環(huán)乳牛肝菌的促生效應(yīng)

采用干皿對抗試驗對從樟子松-褐環(huán)乳牛肝菌菌根根際土壤中分離獲得的71 株細(xì)菌進(jìn)行MHB 潛力細(xì)菌初篩，有5 株菌對褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌絲生長表現(xiàn)出促進(jìn)作用（表1），同對照CK 相比，N94 菌絲增長率介于8.73%～32.59%，其中MHBZ039 和MHBZ043 菌株處理后，褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌絲增長率分別為20.11%和18.63%。單因素方差分析表明，不同處理之間存在顯著差異（p＜0.05）。經(jīng)MHBZ039 和MHBZ043 處理的N94 菌絲生長都較CK 濃密（圖1），MHBZ039 處理的促生效果較MHBZ043 處理得好。

表1 MHB 潛力菌株對褐環(huán)乳牛肝菌（N94）菌絲生長的影響Table 1 The effect of the MHB bacteria suspension on the hapha growth of S.luteus （N94）

圖1 MHB 潛力菌株對褐環(huán)乳牛肝菌(N94)菌絲生長的影響Figure 1 The effect of the MHB bacteria suspension on the hapha growth of S.luteus（N94）

2.2 MHB 潛力菌株胞外代謝產(chǎn)物對褐環(huán)乳牛肝菌生長的影響

菌根輔助細(xì)菌通過次生代謝產(chǎn)物的分泌來促進(jìn)外生菌根菌菌絲生長和菌根合成效率， 初篩獲得的5 個MHB 潛力菌株胞外代謝產(chǎn)物對N94 的生長也具有良好的促進(jìn)作用（表2，圖2）。 單因素分析結(jié)果表明，不同處理之間存在顯著性差異（p＜0.05）。 平板互作結(jié)果表明，MHB 潛力菌株發(fā)酵液處理的N94 菌落直徑較CK 增長率介于20.54%～91.89%，其中，菌株MHBZ039 和MHBZ043 的胞外代謝產(chǎn)物對N94 菌落直徑增長率分別為91.89%和85.41%。 在5 個測試菌株中效果最好。 液體共培養(yǎng)結(jié)果表明，由于MHB 潛力菌株發(fā)酵液的存在，菌絲干重與CK 相比有顯著增加，其中，菌株MHBZ039 和MHBZ043 胞外代謝產(chǎn)物對N94 菌絲生物量的增長率分別達(dá)到42.11%和25.32%。 綜合考慮MHBZ039 和MHBZ043 菌株對N94 生長的影響，可初步將MHBZ039 和MHBZ043 菌株視為具M(jìn)HB 潛力的菌株。

2.3 MHB 潛力菌株與褐環(huán)乳牛肝菌互作對樟子松苗生長的影響

菌株MHBZ039 和MHBZ043 分別與N94 組合設(shè)計單接種和雙接種樟子松1 年生苗試驗，松苗生長3 個月后，與未接種處理CK 相比，無論是單接種（細(xì)菌或外生菌根菌）處理還是雙接種處理都對樟子松苗的生長起到明顯的促進(jìn)作用，且不同處理間差異顯著（p＜0.05）。MHBZ039+N94 和MHBZ043+N94 雙接種處理松苗的苗高、地徑的增長率比CK 處理分別增加8.42%、40.32%和21.41%、34.86%。MHB 潛力菌株的存在可提高褐環(huán)乳牛肝菌與樟子松合成外生菌根菌的效率，MHBZ039+N94 和MHBZ043+N94 雙接種處理的菌根侵染率分別為57.77%和56.46%（表3）。

表2 MHB 菌株胞外代謝產(chǎn)物對褐環(huán)乳牛肝菌（N94）生長的影響Table 2 Effect of bacterial extracellular metabolites on the growth of S.luteus（N94）

圖2 MHB 菌株胞外代謝產(chǎn)物對褐環(huán)乳牛肝菌（N94）生長的影響Figure 2 Effect of bacterial extracellular metabolites on the growth of S.luteus （N94）

表3 MHB 潛力菌株與S.luteus (N94)互作對樟子松苗生長的影響Table 3 Effect of MHB strains inoculated with S.luteus (N94) on the growth of pine seedlings

2.4 MHB 菌株分類鑒定

生理生化指標(biāo)：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，MHBZ039 生長良好，37℃恒溫條件下培養(yǎng)48h 后菌落直徑可達(dá)2～4mm。 菌株MHBZ039 菌落形態(tài)規(guī)則圓形，單菌乳白色，落邊緣整齊（圖3），菌體桿狀，好氧，革蘭氏染色陰性（圖4）。 碳源利用測定中菌株MHBZ039 可利用多種碳源，葡萄糖氧化發(fā)酵試驗陽性，接觸酶試驗陽性，淀粉水解陰性，明膠液化陰性，硝酸鹽還原陽性，MR 和V-P 測定陽性（表4）。

圖3 菌株MHBZ039 菌落形態(tài)Figure 3 Colony characteristics of MHBZ039

圖4 菌株MHBZ039 菌體顯微形態(tài)Figure 4 Strain morphology of MHBZ039

表4 MHB 菌株MHBZ039 的生理生化指標(biāo)Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain MHBZ039

16S rRNA 基因測序分析：通過提取菌株MHBZ039基因組DNA，經(jīng)過PCR 產(chǎn)物序列測定，菌株MHBZ039的16S rRNA 基因PCR 產(chǎn)物長度為1396bp， 將16S rRNA 基因登錄到GenBank 中， 基因登錄號分別為MN814017，將與GenBank 中的序列比對同源性高的模式菌株序列信息， 利用MGEA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），序列分析結(jié)果，菌株MHBZ039 與Pseudomonas extremaustralis DSM17835T(KX186942.1)的同源性達(dá)到99.75%，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)， 菌株MHBZ039 為適冷假單胞桿菌（P.extremaustralis）。

圖5 MHB 菌株MHBZ039 16S rRNA 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 5 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of MHB strain MHBZ039

3 討論與結(jié)論

菌根輔助細(xì)菌在外生菌根菌-植物互作中具有重要作用[29]，大量研究證實，MHB 的存在對菌根合成效率和植物生長均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。同時，外生菌根菌與輔助細(xì)菌存在協(xié)同進(jìn)化機(jī)制[6,30]，MHB 作用機(jī)制主要包括：在菌根合成過程中促進(jìn)菌根菌菌絲生長[31-32]、改善土壤微生態(tài)環(huán)境，減輕菌根菌逆境脅迫壓力[33]、代謝激素促進(jìn)植物根際發(fā)育[34-35]，提高菌根菌與植物根系接觸幾率等。 因此，要針對不同的外生菌根菌篩選其特異性的菌根輔助細(xì)菌。

本研究從樟子松-褐環(huán)乳牛肝菌1 年生菌根苗根際土壤中分離篩選菌根輔助細(xì)菌（MHB），通過干皿對抗法和胞外代謝產(chǎn)物促生測定篩選從75 株根際細(xì)菌中篩選MHB 潛力的菌株，干皿對抗試驗中，菌株MHBZ039和MNBZ043 處理后，同對照相比，褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌絲增長率分別為20.11%和18.63%。干皿對抗試驗和胞外代謝產(chǎn)物促生試驗是快速篩選菌根輔助細(xì)菌的有效方法。盛江梅等[10]在美味牛肝菌-黑松菌根輔助細(xì)菌篩選中，菌株HB12 處理的美味牛肝菌菌絲直徑同對照相比增長17.41%[10]；在對馬尾松菌根輔助細(xì)菌篩選中，短芽孢桿菌處理對彩色豆馬勃和紅絨蓋牛肝菌的菌絲增長率分別為48.6%和25.0%[13]。 結(jié)果表明，干皿對抗法是篩選菌根輔助細(xì)菌的有效手段。 菌根輔助細(xì)菌的效果還需要苗木接種試驗來進(jìn)一步驗證，本研究的樟子松盆栽試驗中，雙接種處理褐環(huán)乳牛肝菌N94+MHBZ039 和N94+MHBZ043，菌根侵染率分別為57.77%和56.46%，同單接種褐環(huán)乳牛肝菌相比， 菌根侵染率分別提高26.79%和23.92%， 輔助細(xì)菌的存在可顯著提高菌根合成效率。苗高和地徑同對照相比分別提高28.42%，40.32%和21.41%，34.86%。其中，MHBZ039 效果好于MHBZ043。輔助細(xì)菌既可提高菌根合成效率，也可發(fā)揮促生細(xì)菌的作用促進(jìn)植物生長，這與李倩等[13]的研究結(jié)論一致。 經(jīng)生理生化指標(biāo)和16S rRNA 基因分子鑒定，確定菌株MHBZ039 為適冷假單胞桿菌（P.extremaustralis）。

綜上所述，本研究從褐環(huán)乳牛肝菌N94-樟子松菌根際篩選得到一株菌根輔助細(xì)菌適冷假單胞桿菌（P.extremaustralis）MHBZ039，該菌株對褐環(huán)乳牛肝菌N94 菌絲生長和菌根合成效率具有顯著的促進(jìn)作用。 同時，MHBZ039 與褐環(huán)乳牛肝菌N94 雙接種可促進(jìn)樟子松1 年生苗的生長，菌根輔助細(xì)菌的獲得為進(jìn)一步研究褐環(huán)乳牛肝菌-菌根輔助細(xì)菌-樟子松三者互作機(jī)制打下良好基礎(chǔ)。