全自動(dòng)在線HS-SPME-GC-MS/MS檢測(cè)魚塘投毒案件水樣中的13種有機(jī)磷農(nóng)藥

文/王丹 宋歌 姜紅 董林沛 趙鵬

研究建立全自動(dòng)在線頂空固相微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HS-SPME-GC-MS/MS）檢測(cè)魚塘投毒案件水樣中13種有機(jī)磷農(nóng)藥的方法// 取2 mL水樣中加入0.6 g 氯化鈉（NaCl）置于20 mL頂空瓶中，使用直徑為100 μm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取纖維，在75 ℃條件下萃取45 min，采用GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。13種有機(jī)磷農(nóng)藥在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.99，方法檢出限為0.002～0.5 ng/mL，定量限為0.006～1.8 ng/mL，精密度在1.92%～17.10%之間。該方法靈敏度高，并且操作簡(jiǎn)單，樣品的處理與分析過程全自動(dòng)進(jìn)行，提高了工作效率，適用于魚塘投毒案件水樣中13種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)。

有機(jī)磷農(nóng)藥是含有磷酰（P=O）或硫代磷酰基（P=S）的磷酸或膦酸衍生物，因?yàn)榫哂懈咝V譜、環(huán)境半衰期短、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，是當(dāng)今世界農(nóng)藥中最主要的類別之一，也是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)和使用最廣泛的農(nóng)藥類別。有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)抑制乙酰膽堿酯酶的活性，對(duì)所有以膽堿酯酶為神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)的生物都具有殺傷作用。低濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥會(huì)使魚類等水生動(dòng)物慢性中毒，影響其生長(zhǎng)和繁殖，高濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥則會(huì)直接導(dǎo)致其死亡。因?yàn)槿菀撰@得，有機(jī)磷農(nóng)藥常被不法分子用于魚塘投毒案件中，導(dǎo)致養(yǎng)殖魚大量死亡，影響生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)秩序。快速準(zhǔn)確地對(duì)魚塘投毒案件水樣中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，能夠?yàn)榘讣善萍胺ㄍピV訟提供證據(jù)。

目前檢測(cè)水樣中的有機(jī)磷農(nóng)藥主要采用氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在進(jìn)樣前需要使用液-液萃取、固相萃取等前處理方法對(duì)1 L水樣中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行提取富集，操作過程復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法通常采用直接進(jìn)樣方式或者經(jīng)固相萃取后進(jìn)樣，但是液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)于有機(jī)磷的檢出限較高。以上方法存在靈敏度低、檢材用量大、操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)等問題，無法滿足公安機(jī)關(guān)對(duì)魚塘投毒案件水樣中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)需求。實(shí)驗(yàn)建立全自動(dòng)在線頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HSSPME）結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（GC-MS/MS）檢測(cè)魚塘投毒案件水樣中13種有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢材用量少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足公安機(jī)關(guān)對(duì)于魚塘投毒案件水樣中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)需求。

儀器與試劑

儀器

氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：GCMS-TQ8050 NX，日本Shimadzu公司；

D B-5 m s色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm，美 國(guó)Agilent公司；

PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)（帶頂空萃取模塊）：瑞士CTC Analytics公司；

Milli-Q Direct純水化儀： 德國(guó)Merck Millipore公司；

100 μm聚 二 甲 基 硅 氧 烷（PDMS）萃取纖維頭：瑞士CTC Analytics公司。

試劑

敵敵畏、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷標(biāo)準(zhǔn)樣品（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，純度≥98%）；

甲醇（美國(guó)Fisher Scientific公司，色譜純）；

氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

使用甲醇將敵敵畏、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷標(biāo)準(zhǔn)品配置成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存。分別移取1.0 mL上述單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于50.0 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用一級(jí)水逐級(jí)稀釋成所需的質(zhì)量濃度。

實(shí)驗(yàn)方法

1.氣相色譜條件

色譜柱：DB-5 ms毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；

載氣：高純氦氣（99.999%），恒流模式，流速1.56 mL/min；

進(jìn)樣口溫度：260 ℃；

不分流進(jìn)樣模式；

升溫程序：初始溫度60 ℃，保 持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

2.質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源（EI源）；

離子源溫度200 ℃；

接口溫度280 ℃；

溶劑延遲時(shí)間2 min；

掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM），掃描間隔0.1 s；

碰撞氣為高純氬氣（99.999%）。

3.頂空固相微萃取條件

取2.0 mL水樣于20 mL頂空瓶中，加入0.6 gNaCl，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷蓋墊（PTFE/Silicone）的螺紋蓋，放入樣品盤中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，設(shè)置PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)參數(shù)，見表1。

表1 SPME參數(shù)設(shè)置

結(jié)果與討論

質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用Q3Scan掃描方法分析10 μg/mL的13種有機(jī)磷農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇豐度高且質(zhì)荷比大于100的特征離子作為母離子，分別篩選出13種目標(biāo)物的母離子，設(shè)置碰撞能（CE）范圍為3～45 eV，使用產(chǎn)物離子掃描方法進(jìn)一步得到各目標(biāo)物最佳CE電壓以及離子豐度比值，建立MRM分析方法。13種有機(jī)磷農(nóng)藥的總離子流色譜圖見圖1，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

圖1 13種有機(jī)磷農(nóng)藥的總離子流色譜圖

表2 目標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

萃取條件優(yōu)化

根據(jù)MRM掃描方式下各待測(cè)物的儀器響應(yīng)值，使用一級(jí)水稀釋配制質(zhì)量濃度分別為1 ng/mL的治螟磷、甲拌磷、毒死蜱、倍硫磷、特丁硫磷、地蟲硫磷，10 ng/mL滅線磷、二嗪磷、對(duì)硫磷，50 ng/mL甲基對(duì)硫磷、敵敵畏、馬拉硫磷、殺撲磷的混合工作溶液。在上述儀器條件下分別優(yōu)化萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品體積以及溶液的離子強(qiáng)度。

1.萃取溫度優(yōu)化

取1 mL工作溶液置于20 mL頂空瓶中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置萃取時(shí)間為30 min，分別考察溫度為45℃、60℃、75℃、90℃條件下的萃取效果。不同萃取溫度條件下13種有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積見圖2。絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥的色譜峰面積隨萃取溫度升高而增大，因?yàn)樯邷囟瓤梢栽龃髷U(kuò)散系數(shù)，加速有機(jī)磷的揮發(fā)，但是升溫會(huì)導(dǎo)致分配系數(shù)降低，影響萃取纖維對(duì)目標(biāo)物的吸附，降低萃取效率，溫度過高也會(huì)導(dǎo)致甲拌磷分解。綜合考慮后，選擇75℃為萃取溫度。

2.萃取時(shí)間優(yōu)化

取1 mL工作溶液置于20 mL頂空瓶中。使用100 μmPDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置萃取溫度為75℃，分別考察萃取30 min、45 min、60 min、75 min、90 min時(shí)的萃取效果。不同萃取時(shí)間條件下13種有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積見圖3。除二嗪磷外，其余有機(jī)磷的色譜峰面積在45～90 min范圍內(nèi)變化不大，表明萃取45 min時(shí)，有機(jī)磷在樣品基質(zhì)、頂空氣體以及纖維涂層這三相中轉(zhuǎn)移基本平衡?？紤]到時(shí)間成本，選擇萃取時(shí)間為45 min。

3.樣品體積優(yōu)化

分別取0.5 mL、1 mL、2 mL工作溶液置于20 mL頂空瓶中。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置萃取溫度為75℃，萃取時(shí)間為45 min，不同樣品體積下13種有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積見圖4。在其他條件不變的情況下，樣品體積增大，SPME的萃取相中樣品絕對(duì)量增加，可以提高檢測(cè)方法的靈敏度。但是當(dāng)樣品體積超過2 mL時(shí)，頂空萃取過程的劇烈振蕩會(huì)導(dǎo)致萃取頭接觸到液體樣品，減小萃取頭的使用壽命。因此選擇樣品體積為2 mL。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

圖4 樣品體積對(duì)萃取效果的影響

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)萃取效果的影響

4.離子強(qiáng)度優(yōu)化

取兩份2 mL工作溶液分別置于20 mL頂空瓶中，一份中加入過量NaCl使溶液達(dá)到飽和狀態(tài)。使用100 μm PDMS萃取纖維頭，PAL RSI全自動(dòng)樣品處理及進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置萃取溫度為75 ℃，萃取時(shí)間為45 min，不同鹽濃度條件下13種有機(jī)磷農(nóng)藥的峰面積見圖5。加入過量NaCl使樣品達(dá)到飽和狀態(tài)后，可將樣品間離子強(qiáng)度的差異降至最低，使有機(jī)磷農(nóng)藥在水溶液中的溶解度下降，分配系數(shù)增大，方法靈敏度提高。因此選擇加入過量NaCl使樣品達(dá)到飽和狀態(tài)。

方法學(xué)驗(yàn)證

1.線性關(guān)系、檢出限和定量限根據(jù)MRM掃描方式下各待測(cè)物的儀器響應(yīng)值，用一級(jí)水稀釋配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、1、2、5、10、15、20 ng/mL滅線磷、治螟磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、二嗪磷、毒死蜱和0.05、0.1、1、10、20、50、100、200 n g/mL敵敵畏、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按優(yōu)化后的全自動(dòng)在線頂空固相微萃取條件和儀器條件進(jìn)行萃取分析。以3倍和10倍信噪比（S/N）計(jì)算各目標(biāo)物的檢出限和定量限，以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表3，13種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限為0.002～0.5 ng/mL，定 量 限 為0.006～1.8 ng/mL，且在線性范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。

表3 13種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

表4 13種有機(jī)磷農(nóng)藥的精密度

2.精密度

根據(jù)MRM掃描方式下各待測(cè)物的儀器響應(yīng)值，各目標(biāo)物分別設(shè)置低、中、高三個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行測(cè)定六個(gè)樣品，按上述優(yōu)化的萃取方法和儀器條件進(jìn)行萃取分析，結(jié)果見表4。三種濃度下13種有機(jī)磷農(nóng)藥的精密度在1.92%～17.10%之間。樣品在加熱模塊中升溫并不斷振蕩進(jìn)行萃取時(shí)，樣品瓶壁可能會(huì)吸附部分目標(biāo)物，尤其當(dāng)基質(zhì)中目標(biāo)物濃度較低時(shí)，瓶壁的吸附作用會(huì)對(duì)精密度產(chǎn)生較大影響。

結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)建立的全自動(dòng)在線HSSPME對(duì)于魚塘水樣中的有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的提取效果，13種有機(jī)磷農(nóng)藥在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.99，方法檢出限為0.002～0.5 ng/mL，定量限為0.006～1.8 ng/mL，精密度在1.92%～17.10%之間。方法僅需2 mL魚塘水樣品，無需使用有機(jī)溶劑，綠色環(huán)保，萃取步驟為程序設(shè)定的全自動(dòng)化操作，平行性好，且萃取模塊直接搭載在氣質(zhì)聯(lián)用儀上方，樣品處理完畢直接進(jìn)樣測(cè)試，整個(gè)過程不到1.5 h，且后續(xù)樣品能智能計(jì)算萃取和進(jìn)樣時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了前處理分析一體化的功能，為公安機(jī)關(guān)檢測(cè)魚塘水中的有機(jī)磷農(nóng)藥提供了參考。