內(nèi)嵌納凝膠陰離子交換聚甲基丙烯酸羥乙酯復(fù)合晶膠分離苯乳酸研究

賀亞維，張頌紅，黃杰，劉流，李國(guó)華，贠軍賢

（1 陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712000； 2 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州310032）

引 言

苯乳酸（PLA）是一種天然、安全、無(wú)毒副作用的有機(jī)酸，其水溶性良好，理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有廣譜抑菌性[1-3]。PLA 不僅可作為新型生物防腐劑，還是藥物中間體和合成新型高分子材料聚苯乳酸的關(guān)鍵單體。因此，在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)中有很好的應(yīng)用潛力[4-6]。PLA 可經(jīng)乳酸菌、植物乳桿菌、芽孢桿菌、白地霉菌等多種微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化合成[7-12]，但其在發(fā)酵液和轉(zhuǎn)化液中的濃度不高，而且該過(guò)程中會(huì)形成其他有機(jī)酸副產(chǎn)物。因此，從發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液中分離獲得高純度的PLA，顯得尤為關(guān)鍵。

晶膠是一種由單體經(jīng)低溫冷凍聚合和結(jié)晶致孔得到的新型分離介質(zhì)，其內(nèi)部有尺寸數(shù)微米至數(shù)百微米的相互連通超大孔隙，具有傳質(zhì)阻力小、對(duì)流傳質(zhì)效果好、生物相容性優(yōu)良和分離操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[13-17]。晶膠基質(zhì)孔壁表面經(jīng)接枝功能基團(tuán)或引入配基后，可用于細(xì)胞、蛋白、酶、抗體等分離[18-26]。但是，晶膠介質(zhì)內(nèi)部的超大孔隙導(dǎo)致其比表面積較小，經(jīng)常規(guī)接枝修飾后其吸附容量較低。針對(duì)此不足，許多學(xué)者致力于制備內(nèi)嵌微/納米粒的復(fù)合晶膠，利用微/納米粒子的高比表面積來(lái)增大晶膠的吸附量[27-33]。

納凝膠是一種由物理或化學(xué)交聯(lián)而成的納米級(jí)三維網(wǎng)狀聚合物體系，具有尺寸可控、比表面積大、分散穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[34-35]，其良好的生物相容性和功能化修飾方便的特點(diǎn)使其在藥物靶向輸送方面也受到廣泛關(guān)注[36-40]，此外，在酶固定化方面也有一定的應(yīng)用[41]。但是，納凝膠作為獨(dú)立分離介質(zhì)方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。如果將疏水性納凝膠內(nèi)嵌于晶膠介質(zhì)中得到新型復(fù)合晶膠介質(zhì)，不但可以保持晶膠的超大孔隙特征，有利于微生物細(xì)胞或生物大分子通過(guò)，同時(shí)還可以彌補(bǔ)晶膠介質(zhì)有效吸附面積小的不足，并借助納凝膠的吸附優(yōu)勢(shì)提高對(duì)目標(biāo)物的吸附容量。將疏水性納凝膠內(nèi)嵌于親水性晶膠之中，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同疏水性能蛋白質(zhì)或小分子的選擇性吸附。

本文以疏水性甲基丙烯酸丁酯為單體，通過(guò)超聲乳液聚合反應(yīng)制備得到尺寸較小、粒度均勻、分散穩(wěn)定的聚甲基丙烯酸丁酯納凝膠；然后以甲基丙烯酸羥乙酯和所得納凝膠為基材，通過(guò)低溫結(jié)晶致孔和聚合反應(yīng)，得到內(nèi)嵌納凝膠的納晶膠介質(zhì)；再采用原位接枝法接枝功能單體N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨，得到內(nèi)嵌納凝膠的陰離子交換復(fù)合晶膠，即納晶膠。測(cè)定了不同配比納晶膠的基礎(chǔ)性能，并對(duì)其從發(fā)酵液中層析分離苯乳酸的性能進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，97%）、聚乙二醇二丙 烯 酸 酯（PEGDA，Mn=250）、四 甲 基 乙 二 胺（TEMED，99%），Sigma-Aldrich；甲基丙烯酸丁酯（BMA，99%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%）、十二烷基硫酸鈉（SDS，98%）、過(guò)硫酸銨（APS，98%）、N,N,N-三甲基乙烯基苯甲氯化銨（VBTAC，99%）及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

激光粒度儀（Zetasizer Nano ZS90），英國(guó)馬爾文儀器有限公司；低溫恒溫槽（THD-3030）、數(shù)控超級(jí)恒溫槽（SC-15），寧波天恒儀器廠；紫外檢測(cè)儀（HD-21-88），上海琪特分析儀器有限公司；臺(tái)式掃描電鏡（SEM）（Hitachi S-4700），日本日立高新技術(shù)公司；透射電子顯微鏡（TEM）（JEM-1200EX），日本電子株式會(huì)社。

1.3 pBMA納凝膠的制備

將單體BMA 和交聯(lián)劑EDMA 按質(zhì)量比9∶1 配制成總質(zhì)量濃度為10%的溶液；再加入乳化劑十二烷基硫酸鈉（SDS），其濃度為混合溶液總質(zhì)量的2%，在35℃水浴條件下超聲乳化30 min；然后再加入引發(fā)劑APS 和加速劑TEMED，其中APS 和TEMED 濃度分別為BMA+EDMA 總質(zhì)量的1.5%和3.0%；繼續(xù)超聲5 min，再經(jīng)過(guò)1 h 反應(yīng)后得到淡藍(lán)色透明的pBMA 聚合物乳液。反應(yīng)制得的納凝膠用激光粒度儀測(cè)定平均粒徑、粒徑分布和Zeta電位。

1.4 pHEMA納晶膠的制備

以單體HEMA 和納凝膠pBMA 為復(fù)合基材，PEGDA 為交聯(lián)劑，在引發(fā)劑APS 和加速劑TEMED的共同作用下，進(jìn)行冷凍聚合制備納晶膠。制備過(guò)程 中，HEMA、pBMA 和PEGDA 的 總 質(zhì)量 濃 度 為15%，其中HEMA 與pBMA 的質(zhì)量比分別為9∶1，8∶2和7∶3 三種，HEMA 與PEGDA 的質(zhì)量比為77∶23。將以上物料配比的水溶液混合均勻后置于冰水浴中預(yù)冷40 min，然后分別加入APS 和TEMED，其中APS 和TEMED 濃度均為HEMA 和PEGDA 總質(zhì)量的0.8%，然后迅速移至-15℃條件下冷凍反應(yīng)6 h，再放入-20℃冰箱內(nèi)繼續(xù)低溫聚合反應(yīng)18 h，得到內(nèi)嵌納凝膠的新型復(fù)合晶膠——納晶膠。將充分反應(yīng)后的納晶膠介質(zhì)于室溫下解凍，然后用大量超純水沖去未聚合單體。以1 mol·L-1VBTAC為接枝單體，對(duì)納晶膠介質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，得到陰離子交換型納晶膠介質(zhì)。納晶膠的制備、接枝機(jī)理和接枝過(guò)程與文獻(xiàn)[26-27]相同。

1.5 pHEMA納晶膠的基礎(chǔ)性能

納晶膠的基礎(chǔ)性能主要由孔隙結(jié)構(gòu)、孔隙率、滲透率和等板高度（HETP）等體現(xiàn)。采用稱重法測(cè)定孔隙率，流量-壓差法測(cè)定滲透率，用掃描電鏡（SEM）分析孔隙結(jié)構(gòu)，通過(guò)脈沖示蹤法測(cè)定不同流速下的停留時(shí)間分布（RTD）曲線，根據(jù)相應(yīng)的公式進(jìn)行計(jì)算得到HETP，測(cè)定方法同文獻(xiàn)[22,26-27]。

1.6 pHEMA納晶膠的層析性能

以牛血清白蛋白（BSA）為模型蛋白，研究不同配比陰離子交換型納晶膠介質(zhì)的層析性能，整個(gè)過(guò)程用紫外檢測(cè)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。用0.02 mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB,pH=7.2）平衡納晶膠，將1 mg·ml-1BSA 溶液以1 cm·min-1速度上樣至飽和，用一定體積的PB 沖洗未吸附的BSA，直到流出液的吸光值趨于穩(wěn)定，再用1 mol·L-1的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液以每管0.39 ml 收集，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)BSA 濃度，最終獲得納晶膠介質(zhì)的吸附容量，方法同文獻(xiàn)[22,26-27]。

1.7 pHEMA納晶膠對(duì)苯乳酸的吸附性能測(cè)試

用HEMA 與pBMA 質(zhì)量比為8∶2 的納晶膠介質(zhì)進(jìn)行苯乳酸吸附性能測(cè)試，整個(gè)過(guò)程仍用紫外檢測(cè)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。用超純水在1 cm·min-1流速條件下平衡納晶膠，再以相同流速上樣濃度為10 mg·ml-1PLA 溶液，待上樣平衡后，用超純水沖洗，最后用1 mol·L-1NaCl 溶液洗脫，以每管0.39 ml 收集，通過(guò)HPLC 判斷洗脫液中PLA 濃度，進(jìn)而檢測(cè)納晶膠對(duì)PLA 的吸附量。層析完成后先用2 mol·L-1NaCl 溶液洗去晶膠柱內(nèi)的所有殘留物質(zhì)，再用大量超純水清洗晶膠柱以備下次使用。

1.8 pHEMA納晶膠分離轉(zhuǎn)化液中的苯乳酸

選用上述HEMA 與pBMA 質(zhì)量比為8∶2 的納晶膠介質(zhì)從轉(zhuǎn)化液中分離苯乳酸。以本課題組保藏的Lactobacillus casei B3 為菌體，轉(zhuǎn)化苯丙酮酸（PPA）得到PLA 溶液，將轉(zhuǎn)化液用超純水稀釋5 倍，使信號(hào)在紫外檢測(cè)儀的合適范圍內(nèi)。然后以與1.7節(jié)相同的方法上樣、沖洗、洗脫及清洗，并通過(guò)HPLC測(cè)定洗脫液中PLA濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 pBMA納凝膠的制備與表征

2.1.1 pBMA 納凝膠的FT-IR 表征 圖1 為分別對(duì)BMA、EDMA 和pBMA 進(jìn)行紅外表征得到的結(jié)果，從圖1 中可以看出，2958 cm-1的峰為pBMA 納凝膠中碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)引起的紅外吸收峰，在1732 cm-1處有一個(gè)明顯的吸收峰，來(lái)自于酯基的羰基伸縮振動(dòng)引起的強(qiáng)紅外吸收峰，1465 cm-1處為碳?xì)滏I的面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，1152 cm-1處為酯基的碳氧鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，而在1600～1680 cm-1之間的碳碳雙鍵的振動(dòng)吸收峰消失，說(shuō)明BMA 與EDMA 均通過(guò)碳碳雙鍵斷裂發(fā)生了聚合反應(yīng)，pBMA 納凝膠得以成功合成。

圖1 BMA、EDMA、pBMA的紅外譜圖Fig.1 FT-IR spectra of BMA,EDMA,pBMA

2.1.2 pBMA 納凝膠的粒徑表征 圖2 為通過(guò)DLS測(cè)量的pBMA 納凝膠粒徑大小分布，其平均粒徑約為36 nm。同時(shí)，DLS 測(cè)量結(jié)果顯示其多分散系數(shù)（PDI）為0.1，Zeta 電位在-60 mV 以下，表明該納凝膠具有較好的分散性和穩(wěn)定性。

圖2 pBMA納凝膠粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of pBMA nanogels

2.2 pHEMA納晶膠的基礎(chǔ)性能

2.2.1 孔隙結(jié)構(gòu)和孔隙率 圖3為不同配比納晶膠介質(zhì)的掃描電鏡圖，從圖中可以看出，晶膠內(nèi)部為孔徑分布均勻的超大孔隙，孔隙間連通性好，與傳統(tǒng)晶膠介質(zhì)具有相同的結(jié)構(gòu)特性。各配比納晶膠的孔隙率數(shù)據(jù)可見(jiàn)表1，其中有效孔隙率在80%左右，絕干孔隙率在84%以上，該孔隙率與內(nèi)嵌SiO2的HEMA 晶膠柱[33]及未內(nèi)嵌納凝膠的HEMAVBTAC 晶膠介質(zhì)都非常接近[42]。因此HEMA 與pBMA 納凝膠的配比未對(duì)晶膠骨架的孔隙微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，所得納晶膠可作為蛋白質(zhì)等生物大分子的層析分離介質(zhì)。

2.2.2 滲透率 實(shí)驗(yàn)測(cè)定了納晶膠介質(zhì)內(nèi)壓降與流量的關(guān)系，并根據(jù)Darcy 定律，回歸計(jì)算得到晶膠柱的滲透率，如表2 所示。由表2 可知，隨著復(fù)合單體溶液中pBMA 納凝膠含量的增加，納晶膠的滲透率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，究其原因可能是由于部分孔隙表面被納凝膠所占據(jù)，在一定程度上增加了管壁粗糙度，同時(shí)也降低了孔隙率，從而增大了流體在其中的流動(dòng)阻力。不過(guò)，從納晶膠的滲透率數(shù)值來(lái)看，其值處于0.35×10-12～1.77×10-12m2范圍，與文獻(xiàn)中未添加納凝膠時(shí)的普通晶膠介質(zhì)[42]及包埋了顆粒的晶膠介質(zhì)[28,32-33]都比較接近，表明制備所得新型納晶膠仍具有較好的傳質(zhì)性能。

表1 納晶膠介質(zhì)孔隙率Table 1 The porosities of nano-cryogels

表2 不同配比的納晶膠長(zhǎng)度和滲透率Table 2 Permeability and length of the composite cryogel matrix with different mass ratios of HEMA to pBMA nanogels（column inner diameter：10 mm）

2.2.3 停留時(shí)間分布 圖4 為流速?gòu)? cm·min-1增大到8 cm·min-1時(shí)不同配比納晶膠介質(zhì)停留時(shí)間分布。由圖4 可知，實(shí)驗(yàn)中所用不同配比的納晶膠RTD 峰形都表現(xiàn)了較好對(duì)稱性，說(shuō)明晶膠介質(zhì)內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)分布均勻，孔隙間連通性很好。計(jì)算所得各配比納晶膠的HETP 見(jiàn)圖5，從圖中可以看出，當(dāng)納晶膠中納凝膠含量較高時(shí)，相應(yīng)的HETP 值也較大，說(shuō)明將納凝膠嵌入晶膠介質(zhì)之后在一定程度上影響了傳質(zhì)性能。不過(guò)，從總體來(lái)看，HETP 值處于0.1～0.4 cm 之間，相應(yīng)軸向擴(kuò)散系數(shù)范圍為1×10-7～8×10-5m2·s-1，這些均與之前的晶膠介質(zhì)相近[27,33,42]，說(shuō)明了以HEMA 和pBMA 納凝膠作為復(fù)合晶膠基材的納晶膠具有較好的柱效性能，可實(shí)現(xiàn)良好的傳質(zhì)效果。

圖3 陰離子交換型納晶膠介質(zhì)掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope photographs of anion-exchange nano-cryogels

圖4 納晶膠介質(zhì)停留時(shí)間分布HEMA與pBMA納凝膠質(zhì)量比：(a)9∶1;(b)8∶2;(c)7∶3Fig.4 Residence time distribution curves in nano-cryogels

圖5 納晶膠介質(zhì)在不同流速下的HETP值Fig.5 HETP values of nano-cryogels at various liquid velocities

2.3 pHEMA納晶膠的層析過(guò)程

不同配比HEMA 和pBMA 的納晶膠在1 cm·min-1流速下層析BSA（1 mg·ml-1）模型蛋白的性能結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，對(duì)于HEMA 與pBMA 質(zhì)量比分別為9∶1、8∶2 和7∶3 的三種納晶膠，其吸附容量分別為3.9、4.4 和5.4 mg·ml-1，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得新型納晶膠介質(zhì)吸附容量隨著pBMA 納凝膠含量的增加而有所上升。這是由于內(nèi)嵌納凝膠使原本光滑平整的晶膠壁面變得粗糙不平，納晶膠介質(zhì)的比表面積得以增大，有利于提高離子交換基團(tuán)的接枝量，從而提高了離子交換吸附量；另一方面，由于pBMA 納凝膠顆粒的吸附作用，使得BSA 的吸附量得以進(jìn)一步增加。

圖6 納晶膠層析BSA曲線Fig.6 Chromatographic curves of BSA in the nano-cryogels with different mass ratios of HEMA to pBMA nanogels

2.4 pHEMA納晶膠對(duì)苯乳酸的吸附性能測(cè)試

圖7 納晶膠介質(zhì)對(duì)PLA的吸附層析過(guò)程Fig.7 Chromatographic adsorption process of PLA in the nano-cryogel

圖7 是以HEMA 與pBMA 質(zhì)量比為8∶2 的晶膠柱為例，在1 cm·min-1流速下，PLA 在納晶膠介質(zhì)床柱內(nèi)穿透、沖洗和梯度洗脫的曲線。根據(jù)層析曲線計(jì)算吸附容量，得到濕納晶膠介質(zhì)對(duì)PLA 的吸附容量為20.7 mg·ml-1，明顯大于未內(nèi)嵌納凝膠的HEMA-VBTCA 晶膠柱對(duì)PLA 的吸附量（14.64 mg·ml-1）[42]，證明該納晶膠對(duì)小分子目標(biāo)物具有較強(qiáng)的吸附能力，在內(nèi)嵌的pBMA 納凝膠的疏水性和因高比表面積產(chǎn)生的高吸附性共同作用下，該納晶膠的吸附苯乳酸的能力得以明顯提升。

2.5 pHEMA納晶膠分離轉(zhuǎn)化液中的苯乳酸

以Lactobacillus casei B3轉(zhuǎn)化PPA得到的PLA溶液作為分離對(duì)象，分析得到轉(zhuǎn)化原液組成為PLA 3.924 mg·ml-1（74.66%），PPA0.017 mg·ml-1（0.31%），其他雜質(zhì)25.03%。層析前，用超純水將轉(zhuǎn)化液稀釋5倍，層析過(guò)程中，上樣量為床柱體積的2倍，上樣結(jié)束后用超純水沖洗，然后用0.1 mol·L-1NaCl 洗脫液進(jìn)行洗脫，圖8 是層析轉(zhuǎn)化過(guò)程中PLA 濃度和純度隨過(guò)柱液體體積的變化。由圖8 可見(jiàn)，上樣液中的PLA 和PPA 在穿透過(guò)程和沖洗階段均未被檢測(cè)到，所吸附的PLA 被0.1 mol·L-1NaCl 溶液洗脫下來(lái)且純度較高，隨著洗脫的進(jìn)行，大部分的PLA 已解吸，導(dǎo)致洗脫液PLA濃度和純度都有所下降。

圖8 上樣液層析過(guò)程中PLA的濃度和純度變化Fig.8 Concentrations and purities of PLA with the loading liquid volume during the chromatography process of sample solution

圖9為層析過(guò)程中典型的上樣、沖洗、洗脫階段目標(biāo)產(chǎn)物PLA 和雜質(zhì)的HPLC 分析結(jié)果?？梢?jiàn)，由于沖洗和洗脫已除去了絕大部分雜質(zhì)，洗脫流出液中能檢測(cè)到濃度和純度都較高的PLA，所得PLA 純度高達(dá)89.24%，相應(yīng)的PLA回收率為93.74%。這可能是納晶膠柱效較高，且因同時(shí)具有疏水和離子交換作用，可以在靜電和疏水作用的共同作用下使目標(biāo)物PLA更高效率地得到分離。

3 結(jié) 論

將疏水性pBMA 納凝膠內(nèi)嵌于HEMA 基晶膠骨架得到新型納晶膠，再接枝功能單體，使納晶膠介質(zhì)既具有納凝膠的疏水作用和高吸附性能，也具有晶膠介質(zhì)的陰離子交換能力和良好傳質(zhì)性能。制備得到的pBMA-HEMA 納晶膠介質(zhì)孔隙率高、內(nèi)部結(jié)構(gòu)分布均勻、滲透性能和傳質(zhì)性能優(yōu)良，以稀釋5倍的轉(zhuǎn)化液按2 倍床柱體積上樣，再用0.1 mol·L-1NaCl 洗脫液進(jìn)行洗脫，分離所得PLA 純度高達(dá)89.24%，回收率為93.74%。說(shuō)明制備得到的新型納晶膠介質(zhì)，可以較好地用于從苯乳酸轉(zhuǎn)化液中分離苯乳酸，而且有望應(yīng)用于生物有機(jī)酸分子的分離等領(lǐng)域。

符 號(hào) 說(shuō) 明

E——停留時(shí)間分布函數(shù)，s-1

HETP——理論塔板高度，m

kw——晶膠介質(zhì)滲透率，m2

L——晶膠介質(zhì)長(zhǎng)度，m

圖9 層析轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同階段流出液的HPLC圖Fig.9 HPLC results of PLA and other contamination contents in the effluent sample for the chromatography process of sample solution