紫葉紫薇良種組培快繁研究

饒丹丹，王湘瑩，蔡 能，喬中全，曹受金，王曉明，周 圍

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004；3.長沙市木本花卉工程技術研究中心，湖南 長沙 410005）

紫薇Lagerstroemia indica千屈菜科Lythraceae紫薇屬Lagerstroemia是一種落葉灌木或小喬木[1]。紫薇是我國夏季少花期的主要觀花樹種之一，其花色豐富，壽命長，樹齡有達200 a 的，花期長達100 多天，具有較強的抗污染和抗旱性，可耐夏季40℃高溫和-23℃的低溫，適應性廣，南北均可種植，廣泛用于城市園林、道路綠化、鄉(xiāng)村旅游、庭院綠化和盆景盆栽等。

目前，國內(nèi)外研究者紫薇育種通過常規(guī)選育、雜交育種、誘變育種等方法，培育出各色的紫薇，但因國內(nèi)紫薇育種起步較晚，擁有自主知識產(chǎn)權的紫薇優(yōu)良新品種較少。‘紫玉’紫薇作為我國擁有自主知識產(chǎn)權的紫薇優(yōu)良新品種，是通過雜交育種，從實生苗中選育出來的具有優(yōu)良性狀的紫薇彩葉新優(yōu)品種?！嫌瘛哂猩L迅速、枝干直立性強、主干明顯、葉緣起伏、成熟葉紫紅色、花純白色的特點，是很好的觀葉觀花植物，在園林觀賞和后期養(yǎng)護等方面具有較高的觀賞價值和一定的經(jīng)濟價值，可用于園林綠化、行道樹種、庭院綠化、園林花鏡花帶營造和盆栽盆景等，應用前景極大。

紫薇的常規(guī)繁殖方式有種子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖3 種繁殖方式[2]，但是常規(guī)的繁殖方式繁殖速度慢，并且在前期通過植物組織培養(yǎng)來培育紫薇苗木，既具有繁殖系數(shù)高、繁殖速度快，又能保持紫薇優(yōu)良的品種性狀，可以在短時期獲得大量具有優(yōu)良種性的優(yōu)質(zhì)種苗，對紫薇苗木產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要的應用價值，并且對保存種質(zhì)資源具有重要意義。

近年來，專家學者在紫薇組織培養(yǎng)領域進行了大量的研究。姜旭紅等[3]以紫薇嫩莖、葉片為外植體，通過誘導愈傷組織建立了日本紫薇的再生體系。曹受金等[4]以無果紫薇嫩莖產(chǎn)生的愈傷組織為外植體，通過誘導分化叢生芽建立無果紫薇的再生體系，結(jié)果表明，3種激素NAA 0.05 mg/L，6-BA 0.5 mg/L 和KT 0.5 mg/L 對紫薇愈傷組織分化叢生芽效果顯著。段麗君、唐麗丹、陳怡佳等[5-11]以紫薇嫩莖、莖尖為外植體，通過誘導腋芽和頂芽途徑建立了紅火球紫薇、美國紅葉紫薇、黑葉紫薇和矮首領紫薇的組培再生體系。蔡能等[12-13]通過誘導紫薇嫩莖腋芽萌發(fā)先后進行了‘曉明1 號’紫薇和‘紫韻’紫薇的組織培養(yǎng)快繁研究，發(fā)現(xiàn)紫薇屬不同種或不同品種對礦質(zhì)元素的需求具有一定的差異，較高濃度的礦質(zhì)營養(yǎng)元素的DKW 基本培養(yǎng)基有利于‘曉明1 號’組培苗的生長，較低濃度礦質(zhì)元素的WPM 基本培養(yǎng)基適宜‘紫韻’紫薇的生長。宋平、王曉嬌等[14-19]以紫薇種子為外植體，再以無菌苗的莖段、葉誘導腋芽萌發(fā)或誘導愈傷組織，完成了‘小花紫’‘Supersonic’‘Bicolor’、‘南紫薇’、‘屋久島紫薇’和云南紫薇再生體系的建立。李國瑞、唐興國等[20-21]通過胚、子葉和下胚軸誘導愈傷組織途徑建立了紫薇再生體系。陳曉航[22]在進行黑鉆石紫薇的組培再生研究過程中，以莖段為外植體進行初代培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)添加一定濃度PPM 可以顯著降低外植體污染率,有利于誘導腋芽萌發(fā)。呂銘等[23]在進行紅葉紫薇組培研究過程中，以紫薇莖段為外植體，發(fā)現(xiàn)1/2 MS 培養(yǎng)基比MS，WPM 和1/2 WPM 更適合紅葉紫薇腋芽誘導。目前為止專家學者對不同品種紫薇各種途徑的組織培養(yǎng)已經(jīng)進行了大量的研究，紫薇作為異花授粉植物，以種子和幼胚為初始外植體的途徑進行組織培養(yǎng)，繁殖的后代易變異。

目前尚未見‘紫玉’紫薇組培快速繁殖的相關報道。本研究以‘紫玉’紫薇為試驗材料，對紫葉紫薇進行組培快繁研究，對增殖基本培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行改良，得到更適合紫玉紫薇這一紫薇良種的組培快繁技術。以帶腋芽莖段為外植體進行紫薇組織培養(yǎng)快速繁殖，通過篩選最佳消毒時間、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，以期建立‘紫玉’紫薇組培快繁體系，在較短時間里獲得大量母株材料，為‘紫玉’紫薇工廠化育苗和紫薇種質(zhì)資源保存提供初始材料和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為紫薇新優(yōu)品種‘紫玉’紫薇，來自湖南省林業(yè)科學院試驗林場紫薇示范基地。于晴天的早晨采樣，外植體選取無病害生長健壯的植株，剪取其春季萌發(fā)的無病蟲害、生長旺盛、腋芽未萌發(fā)的嫩枝，保濕帶回實驗室，去掉葉片和頂芽，保留葉柄，待用。

1.2 試驗設計

1.2.1 外植體消毒處理

將紫薇嫩枝在自來水下流水沖洗2 h，在超凈工作臺中，將紫薇嫩枝剪成2～3 cm 的帶腋芽莖段，用75%酒精浸泡清洗30 s，無菌水沖洗2 次，再用0.1% HgCl2溶液進行常規(guī)消毒處理，消毒時間分別為4、5、6 min，再用無菌水沖洗4 次。將莖段兩端褐化部分去掉，接種于改良DKW+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1的培養(yǎng)基上，每個消毒時間處理接種20 瓶，每瓶接種1 個莖段。試驗重復3 次，初代培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計污染率和存活率。

1.2.2 繼代增殖基本培養(yǎng)基篩選

以WPM、1/2MS、MS、改良DKW 為基本培養(yǎng)基，均添加生長調(diào)節(jié)劑6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1，每處理接種15 瓶，每瓶接種4 個長勢一致、高約1.5 cm的芽，試驗重復3 次。增殖培養(yǎng)30 d，觀察叢生芽增殖生長情況并統(tǒng)計增殖系數(shù)以及芽苗生長狀況。增殖系數(shù)=（統(tǒng)計時有效芽數(shù)）/接種芽數(shù)（有效芽為高度大于1 cm 的芽）。

1.2.3 細胞分裂素種類對增殖的影響

增殖培養(yǎng)基以改良DKW+NAA 0.25 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1為基礎，分別添加1.0 mg·L-1的細胞分裂素6-BA、ZT 和KT，研究細胞分裂素種類對‘紫玉’紫薇增殖的影響，篩選出增殖培養(yǎng)最適的細胞分裂素。將初代培養(yǎng)中長出來的腋芽剪取約1.5 cm 單株芽苗接種于增殖培養(yǎng)基上。每個處理接種10瓶，每瓶接種4個芽苗，試驗重復3 次。30 d 后，觀察叢生芽增殖情況并統(tǒng)計增殖系數(shù)及芽苗生長狀況。

1.2.4 生長調(diào)節(jié)劑對增殖的影響

增殖培養(yǎng)基以改良DKW+蔗糖30 g·L-1+瓊脂5.0 g·L-1為基礎，分別添加0.5、1.0、2.0 mg·L-1細胞分裂素6-BA 和0.10、0.25、0.50 mg·L-1的生長素NAA，探究6-BA 質(zhì)量濃度和質(zhì)量NAA 濃度對‘紫玉’紫薇叢生芽增殖的影響。將初代培養(yǎng)中長出來的腋芽剪取約1.5 cm 的單株芽苗接種于增殖培養(yǎng)基上。每個處理接種10 瓶，每瓶接種4個芽苗，試驗重復3 次。30 d 后，觀察叢生芽增殖情況并統(tǒng)計增殖系數(shù)及芽苗生長狀況。

1.2.5 生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響

剪取繼代增殖的1.5 cm 以上的健壯苗進行生根誘導，以1/2 改良DKW+300 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，生長素IBA 設置3 個質(zhì)量濃度，分別為0.2、0.5、0.8 mg·L-1；生長素NAA 設置3 個質(zhì)量濃度，分別為0.1、0.2、0.3 mg·L-1。每個處理接種15 瓶，每瓶接種5個苗。試驗重復3次，30 d后觀察生根情況，統(tǒng)計生根率，根條數(shù)和根長。生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%。

1.2.6 煉苗與移栽

選擇生長健壯、根系良好的紫薇小苗，移入溫室，打開瓶蓋煉苗1 周，煉苗后取出組培苗，用自來水清洗小苗根部的培養(yǎng)基，多菌靈浸泡10 min，再移栽到已經(jīng)消毒的基質(zhì)中，基質(zhì)采用體積比為3∶1 的泥炭和珍珠巖，移栽30 d 后統(tǒng)計移栽成活率。移栽成活率=（成活苗數(shù)/移栽苗數(shù)）×100%。

1.3 培養(yǎng)條件

以上培養(yǎng)基均添加瓊脂5.0 g·L-1，初代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基添加蔗糖30 g·L-1，生根培養(yǎng)基添加蔗糖15 g·L-1，pH 值均調(diào)為5.8～6.0；121℃高溫高壓條件下滅菌20 min；在培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度為1 500～2 000 lx，每日光照時間為12 h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計外植體污染率、外植體成活率、叢芽增殖系數(shù)、生長狀況、生根率、誘導的根長度和根條數(shù)等。使用SPSS22.0 和Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體消毒的影響

由表1可知不同的消毒時間對外植體污染率和存活率有很大的影響，當用0.1%升汞溶液消毒4 min 時外植體污染率最高為41.89%，外植體存活率最低為58.11%；隨著0.1%升汞消毒時間的增加，污染率降低，存活率升高，當用0.1%升汞溶液消毒6 min 時外植體污染率最低為10.67%，存活率最高為89.33%，此時腋芽萌發(fā)狀態(tài)見圖1。因此選擇最佳消毒處理為A3 處理，酒精清洗30 s+0.1%升汞溶液消毒6 min。

表1 不同消毒時間對外植體污染率的影響?Table 1 The effects of different disinfection time on contamination rate of explants

2.2 繼代基本培養(yǎng)基的選擇

選取生長健壯、長勢基本一致的紫薇芽苗接種到不同基本培養(yǎng)基中，30 d 后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。由表2和圖2可知，基本培養(yǎng)基對‘紫玉’紫薇增殖系數(shù)呈顯著影響，當基本培養(yǎng)基為WPM和1/2 MS時，增殖系數(shù)均低，增殖芽苗較少且植株生長較差（圖2A—B），增殖系數(shù)最低為WPM 培養(yǎng)基培養(yǎng)時（圖2A）；當基本培養(yǎng)基為改良DKW 和MS 時，長勢均較好，但MS 為基本培養(yǎng)基時增殖芽細弱，且小芽多，有效芽苗較少；當基本培養(yǎng)基為改良DKW 時增殖系數(shù)最高為4.83，并且生長旺盛，增殖芽健壯，因此選擇改良DKW 作為‘紫玉’紫薇繼代增殖的基本培養(yǎng)基。

圖1 紫薇腋芽萌發(fā)Fig.1 Axillary bud germination of Lagerstroemia indica

表2 不同基本培養(yǎng)基對繼代增殖的影響Table 2 The effects of different basic mediums on subculture proliferation

2.3 不同種類細胞分裂素對增殖的影響

由不同種類細胞分裂素對增殖的影響試驗可知，細胞分裂素種類對‘紫玉’紫薇的增殖有著極顯著的影響。數(shù)據(jù)分析可知，B4 處理與B5、B6 處理間的增殖系數(shù)存在顯著性差異，B4 處理添加細胞分裂素為6-BA 時，增殖系數(shù)最高為4.83，且植株長勢旺盛，芽健壯；B5 處理和B6 處理的增殖系數(shù)差異不明顯，增殖系數(shù)均較低，B6 處理最低為1.22，且葉枯落，長勢差（表3，圖3）。因此，‘紫玉’紫薇繼代增殖應選擇的最適細胞分裂素為6-BA。

2.4 生長調(diào)節(jié)劑濃度對繼代增殖的影響

試驗結(jié)果表明，細胞分裂素6-BA 濃度和生長素NAA 質(zhì)量濃度對‘紫玉’紫薇繼代增殖產(chǎn)生很大的影響（表4）。由表4可知，細胞分裂素質(zhì)量濃度和生長素質(zhì)量濃度均對紫薇組培苗增殖系數(shù)由顯著影響，當NAA 質(zhì)量濃度一定時，試管苗增殖系數(shù)隨著6-BA質(zhì)量濃度升高先增高后降低；當6-BA質(zhì)量濃度相同時，NAA 質(zhì)量濃度增加，增殖系數(shù)降低；當6-BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1，NAA 質(zhì)量濃度為0.25 mg·L-1時，增殖系數(shù)最高為4.87，增殖芽健壯，長勢好，多次繼代組培苗生長良好（圖4）；當6-BA 質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時增殖系數(shù)較大，但增殖芽較細弱，小芽多，多次繼代植株長勢變?nèi)?。因此適合‘紫玉’紫薇繼代增殖的細胞分裂素和生長素配比為BA1.0 mg·L-1、NAA0.25 mg·L-1。

表4 6-BA 質(zhì)量濃度和NAA 質(zhì)量濃度對繼代增殖的影響Table 4 The effects of 6-BA and NAA concentrations on subculture proliferation

2.5 生根培養(yǎng)以及組培苗移栽

圖4 多次繼代增殖的‘紫玉’紫薇叢苗Fig.4 Clusterbuds of Lagerstroemiaindica ‘Ziyu’

誘導生根試驗結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的細胞分裂素NAA 和IBA 均對誘導‘紫玉’紫薇生根有很大的影響（表5）。由表5可知，不同質(zhì)量濃度的NAA 和IBA 各處理，試管苗生根率差異顯著，D3 處理生根率最高達到86.50%，此時生長素NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；不同質(zhì)量濃度的NAA 和IBA 各處理間，誘導生根的根長度差異顯著，D2 處理根長度最長為2.95 cm，此時生長素NAA 質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1；不同質(zhì)量濃度的NAA 和IBA 各處理，誘導的根條數(shù)變化幅度為2.5～2.7 條，各處理間無顯著差異。生長素質(zhì)量濃度為NAA0.5 mg·L-1的D2 處理，組培苗生根率最高，誘導的根長度最長，并且組培苗生長良好，因此，適合‘紫玉’紫薇生根培養(yǎng)添加的生長素質(zhì)量濃度為NAA0.5 mg·L-1（圖5）。

將生根培養(yǎng)得到的生根組培苗（圖5）經(jīng)過7 d煉苗后，移栽到泥炭和珍珠巖體積比為3∶1 的消毒基質(zhì)中的生根瓶苗存活率高，移栽存活率能達90%以上。

表5 NAA 濃度和IBA 濃度對誘導生根的影響Table 5 The effects of NAA and IBA concentrations on induced rooting

圖5 ‘紫玉’紫薇生根苗Fig.5 Rooting seedlings of Lagerstroemia indica ‘Ziyu’

3 結(jié)論與討論

通過研究‘紫玉’紫薇外植體滅菌時間的優(yōu)化、誘導腋芽萌發(fā)、增殖培養(yǎng)基的改良、生根培養(yǎng)基的篩選和移栽生根苗，完成了‘紫玉’紫薇離體再生和組培快繁。

3.1 基本培養(yǎng)基的改良

在紫薇繼代增殖過程中不同品種紫薇對基本培養(yǎng)基的需求不相同，如無果紫薇采用MS 為增殖基本培養(yǎng)基[4]，黑葉紫薇和‘紫韻’紫薇采用WPM 為增殖基本培養(yǎng)基[9,13]，美國紅葉紫薇采用ZW（改良的WPM）為增殖基本培養(yǎng)基[7]，‘曉明一號’紫薇采用改良DKW為增殖基本培養(yǎng)基[12]，這表明不同品種紫薇對基本培養(yǎng)基元素的需求有較大差異。針對‘紫玉’紫薇的增殖基本培養(yǎng)基的篩選發(fā)現(xiàn)，在WPM 培養(yǎng)基和1/2 MS 培養(yǎng)基上長勢較差，在MS 和改良DKW 培養(yǎng)基上長勢較好，但是MS 培養(yǎng)基上增殖芽較細弱，在改良DKW 培養(yǎng)基上長勢旺盛，植株健壯，這說明，‘紫玉’紫薇不適合較低濃度礦質(zhì)元素培養(yǎng)基，較高濃度礦質(zhì)元素的改良DKW 培養(yǎng)基適合‘紫玉’紫薇增殖培養(yǎng)。

3.2 增殖培養(yǎng)生長調(diào)節(jié)劑的改良

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物組織培養(yǎng)過程的增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等起到了十分復雜并且重要的調(diào)節(jié)作用。不同的細胞分裂素對不同的植物會產(chǎn)生不同的影響，紫薇的組培增殖培養(yǎng)一般是采用6-BA為細胞分裂素[7-12]，也有采用兩種細胞分裂素搭配使用，曹受金等[4]和王闖等[19]在進行無果紫薇和矮生紫薇的增殖培養(yǎng)時，采用6-BA 和KT 兩種激素搭配使用，增殖效果較好，在篩選適合‘紫玉’紫薇增殖培養(yǎng)的細胞分裂素種類試驗中發(fā)現(xiàn)，細胞分裂素6-BA 增殖效果最好，增殖系數(shù)最高，‘紫玉’紫薇因不適應細胞分裂素KT 和ZT 的培養(yǎng)基，生長緩慢，葉色枯黃，因此KT 和ZT 不適用于‘紫玉’紫薇增殖培養(yǎng)，應選擇6-BA 作為‘紫玉’的增殖培養(yǎng)的細胞分裂素。在‘紫玉’紫薇組培苗增殖過程中，適宜質(zhì)量濃度的細胞分裂素6-BA 和生長素NAA 配合使‘紫玉’紫薇組培苗增殖生長，當6-BA 質(zhì)量濃度為2.0 mg·L-1時，‘紫玉’紫薇分化芽數(shù)量增加但有效芽數(shù)量減少，增殖系數(shù)降低，這與陳怡佳和蔡能等人的研究不符[7,12]，這可能是因為不同基因型對細胞分裂素濃度的適應性的差異，因此選擇適宜的6-BA 質(zhì)量濃度對紫薇增殖十分重要，最適合‘紫玉’紫薇增殖培養(yǎng)的生長素和細胞分裂素質(zhì)量濃度配比為6-BA 1.0 mg·L-1和NAA 0.25 mg·L-1，此時增殖系數(shù)為4.83，增殖芽健壯，生長旺盛，并且多次繼代叢芽生長良好。

3.3 生長素誘導生根

培養(yǎng)基中添加不同種類生長素和不同質(zhì)量濃度生長素均對誘導生根有很大的影響[24-26]。在‘紫玉’紫薇組培苗生根培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)生長素種類和質(zhì)量濃度均對誘導生根有一定的影響，并且不同品種紫薇誘導生根最適生長素種類以及質(zhì)量濃度有一定的差異，王闖[19]在矮生紫薇的生根研究中發(fā)現(xiàn)NAA 為0.5 mg·L-1時生根率最高 為90%，蔡能等[12-13]采用NAA0.1 mg·L-1和NAA0.2 mg·L-1分別對‘曉明一號’和‘紫韻’紫薇誘導生根，生根率均能達到100%。王曉嬌、王軻、范淑芳和陳曉航等采用1/2 MS+IBA0.5 mg·L-1分別對‘Pecos’紫薇、云南紫薇、黑葉紫薇、黑鉆紫薇進行生根培養(yǎng)，生根率分別為80%、94.6%、98%、100%[9,15-17,22]。曹受金等[4]采用1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA 誘導無果紫薇生根，生根率為87.5%，呂銘等[23]采用1/2 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1KT 來進行紅葉紫薇的生根誘導，生根率達到100%，這可能與不同品種紫薇不同基因型對生根過程的生長素種類和濃度需求和適應差異有關。作者在‘紫玉’紫薇生根培養(yǎng)過程，發(fā)現(xiàn)生長素NAA 比IBA 能更好的誘導生根，并且NAA誘導的根更加健壯，這與蔡能等[12-13]的研究相符合。因此適合‘紫玉’紫薇生根培養(yǎng)的生長素質(zhì)量濃度為NAA 0.5 mg·L-1，此時生根率為85.19%，根長度為2.95 cm，根條數(shù)為2.7 條。

本研究以‘紫玉’紫薇嫩莖為外植體，通過誘導嫩莖腋芽萌發(fā)，腋芽增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，完成了‘紫玉’紫薇組培快繁研究，為‘紫玉’紫薇工廠化育苗提供了理論基礎。