Nrf2/HO-1通路參與右美托咪定抑制大鼠肺損傷后自噬的實驗研究

閆巍巍 章斌 朱志鵬 周紅梅

[摘要] 目的 探討Nrf2/HO-1自噬信號通路在右美托咪定抑制大鼠肺損傷的作用。 方法 SPF級健康成年雄性SD大鼠50只，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組（n=10）：正常對照組、模型組（腹腔注射LPS 5 mg/kg）、右美托咪定組（造模前30 min內(nèi)腹腔注射右美托咪定30 μg/kg）、Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇組（模型制備前10 d，隔天腹腔注射鴉膽子苦醇0.4 mg/kg），鴉膽子苦醇+右美托咪定組（劑量和給藥時間同前）。收集左肺支氣管肺泡灌洗液，ELISA 檢測中白細胞介素-1β（IL-1β），白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，取右肺組織進行 HE 染色并進行肺損傷評分，計算肺組織濕重/干重（W/D）的比值，Western blot 檢測肺組織中 Nrf2，HO-1，ATG-5，P62蛋白的表達。 結(jié)果 與正常對照組比較，模型組的W/D 比值，肺損傷評分， IL-1β、IL-6和TNF-α水平，Nrf2，ATG-5和P62蛋白明顯增加，HO-1蛋白明顯下降（P<0.05），與模型組比較，而右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組明顯逆轉(zhuǎn)（P<0.05），且鴉膽子苦醇+右美托咪定組逆轉(zhuǎn)更為明顯（P<0.05）。右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組明顯逆轉(zhuǎn)模型組大鼠肺組織損傷程度，肺間質(zhì)增厚明顯減少，且炎癥細胞浸潤程度明顯減輕，其中鴉膽子苦醇+右美托咪定組大鼠改變最為明顯。 結(jié)論 Nrf2/HO-1自噬信號通路參與了右美托咪定減輕大鼠肺損傷的過程。

[關(guān)鍵詞] Nrf2/HO-1通路;右美托咪定;大鼠肺損傷;自噬;鴉膽子苦醇;炎癥因子

[中圖分類號] R363? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）34-0031-04

[Abstract] Objective To explore the effect of Nrf2/HO-1 autophagy signaling pathway in the inhibition of lung injury in rats by dexmedetomidine（Dex）. Methods Fifty healthy adult male SD rats （SPF-grade） were selected and divided into five groups using the random number table method （n=10）. These groups were normal control group， model group （intraperitoneal injection of LPS 5 mg/kg）， Dex group （intraperitoneal injection of Dex 30 μg/kg in 30 min before modeling）， Nrf2 inhibitor brusatol group （intraperitoneal injection of brusatol 0.4 mg/kg every other day 10 d before model preparation）， brusatol+Dex group （dose and administration time as before）. Left bronchoalveolar lavage fluids were collected， in which interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） levels were detected by ELISA. Right lung tissues were obtained for HE staining and lung injury scoring， the ratios of wet weight/dry weight（W/D） of lung tissues were calculated， and the expression of Nrf2， HO-1， ATG-5， and P62 proteins in lung tissues were detected by Western blot. Results The W/D ratio， lung injury scores， IL-1β， IL-6 and TNF-α levels， Nrf2， ATG-5 and P62 proteins were significantly increased in the model group and HO-1 protein was significantly decreased than those in the normal control group（P<0.05）. However， those in Dex group， brusatol group and brusatol+Dex group were significantly reversed（P<0.05） than those in the model group， and the reversions in the brusatol+Dex group were more significantly（P<0.05）. The damage degree of lung tissue was significantly reversed and the pulmonary interstitial thickening was significantly reduced， and the degree of inflammatory cell infiltration was significantly reduced in rats of Dex group， brusatol group and brusatol+Dex group than those in the model group， with the most obvious changes in the brusatol+Dex group. Conclusion Nrf2/HO-1-autophagy signaling pathway is involved in the attenuation of lung injury by Dex in rats.

[Key words] Nrf2/HO-1 pathway; Dexmedetomidine; Lung injury in rats; Autophagy; Brusatol; Inflammatory factors

急性肺損傷是臨床上常見的危重癥，常由感染性休克或全身炎癥反應(yīng)引起，可進展為急性呼吸窘迫綜合征，是導(dǎo)致重癥患者病死的首要因素[1-2]。目前關(guān)于急性肺損傷的發(fā)病機制雖已進行不少研究，但確切的機制尚未闡明，目前國內(nèi)外學者一致認同炎癥級聯(lián)反應(yīng)在其中發(fā)揮不可或缺的作用[3]。核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系 2p45 相關(guān)因子2（Nrf2）是一種重要的機體內(nèi)保護性轉(zhuǎn)錄因子[4]，活化后可由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)至核內(nèi)，誘導(dǎo)下游抗氧化及抗炎分子如血紅素加氧酶-1（HO-1）上調(diào)[5]，近年來隨著對Nrf2/HO-1通路的深入了解，Nrf2/HO-1通路還參與自噬調(diào)節(jié)，通過影響機體自噬過程參與生理學過程，而自噬在急性肺損傷中亦扮演作用，但Nrf2/HO-1通路調(diào)控自噬過程參與急性肺損傷的研究尚未見諸于報道[6-7]。呼吸機支持治療在急性肺損傷中發(fā)揮重要作用，其中右美托咪定作為常見的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物，由于其具有不抑制呼吸和維持血流學穩(wěn)定等特點在臨床應(yīng)用中頗受關(guān)注[8]。最近的研究表明，右美托咪定還具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[9]。本研究擬探討Nrf2/HO-1信號通路調(diào)控自噬過程在右美托咪定減輕急性肺損傷中的作用，為明確其機制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1實驗對象

50只SPF 級雄性 SD 大鼠，體重為（200±20）g，由本院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字 H20090248），Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇購自上海源葉生物科技有限公司，白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β），IL-6和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自 R&D公司，LPS購自Sigma公司，一抗：Nrf2，HO-1，ATG-5，P62和β-actin 抗體購自美國 Cell Signaling 公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗、BCA 蛋白定量試劑盒、ECL 化學發(fā)光顯色系統(tǒng)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。電泳及凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad 公司。

1.3 方法

采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為5組（n=10）：正常對照組、膿毒癥急性肺損傷組（模型組）、右美托咪定組、Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組。模型組參照文獻[10]中的方法，腹腔注射LPS制備大鼠急性肺損傷模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，仰臥位固定，用拔出管芯的靜脈留置針（22G）經(jīng)聲門向小鼠氣管內(nèi)注入LPS 5 mg/kg（溶于100 μL無菌生理鹽水中），注射完成后，用1 mL注射器注入0.5 mL空氣并輕輕旋轉(zhuǎn)小鼠使LPS在肺內(nèi)均勻分布。右美托咪定組、鴉膽子苦醇+右美托咪定組于造模前30 min內(nèi)腹腔注射右美托咪定30 μg/kg。Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇組、鴉膽子苦醇+右美托咪定組于模型制備前10 d，隔天腹腔注射鴉膽子苦醇0.4 mg/kg。本研究經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。所有操作均符合倫理要求。

1.4 觀察指標

1.4.1標本采集? 建模 6 h 后處死大鼠，灌洗并收集左肺支氣管肺泡灌洗液，2500 rpm 4 ℃離心10 min，取上清待測。同取右肺組織，一份于-80℃保存，另一份于福爾馬林固定。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎癥因子水平 根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測肺泡灌洗液上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.4.3計算肺濕重/干重（W/D）比? 選取新鮮右肺組織，分別稱量濕重和干重，計算 W/D比。

1.4.4肺組織HE染色? 取右肺中葉組織用 4%多聚甲醛固定 48 h。固定完全后制作 HE 染色切片，按照 Murakami 法[11]評測肺損傷的程度。

1.4.5 Western blot檢測蛋白表達? 提取肺組織蛋白，定量，各組取50 μg蛋白樣本加入上樣緩沖液后開水煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，采用半干法轉(zhuǎn)膜，PVDF膜放入封閉液中常溫封閉1 h，孵育一抗Nrf2，HO-1，ATG-5，P62，4℃孵育過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h后，TBST洗膜，發(fā)光、顯影后拍照并分析圖像，β-actin 作為內(nèi)參，計算相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析所得數(shù)據(jù)。服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析多組間差異，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠 W/D 比值及肺損傷評分比較

與正常對照組比較，模型組 W/D 比值、肺損傷評分明顯增加（P<0.05），與模型組比較，右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組W/D比值、肺損傷評分明顯降低（P<0.05），且鴉膽子苦醇+右美托咪定組下降更為明顯（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較

與正常對照組比較，模型組 IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯增加（P<0.05），與模型組比較，右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組明顯降低（P<0.05），且鴉膽子苦醇+右美托咪定組下降更為明顯（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠HE染色結(jié)果

與正常對照組比較，模型組肺泡組織結(jié)構(gòu)遭受明顯破壞，肺泡間隔亦明顯增厚，肺泡及肺間質(zhì)滲出紅色物質(zhì)，大量炎癥細胞浸潤，肺組織受到嚴重損傷。與模型組比較，右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組大鼠肺組織損傷程度明顯減輕，肺間質(zhì)增厚明顯減少，且炎癥細胞浸潤程度明顯減輕，其中鴉膽子苦醇+右美托咪定組大鼠改變最為明顯。見封三圖3。

2.4 各組大鼠WB檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組Nrf2，ATG-5和P62蛋白明顯升高，HO-1明顯下降，而右美托咪定組、鴉膽子苦醇組和鴉膽子苦醇+右美托咪定組Nrf2，ATG-5和P62蛋白明顯降低，HO-1明顯升高（P<0.05），且鴉膽子苦醇+右美托咪定組變化更為明顯（P<0.05）。見圖1。

3 討論

急性肺損傷是膿毒癥發(fā)生后最常見和最早出現(xiàn)的臟器損害，是由全身嚴重感染導(dǎo)致的炎癥級聯(lián)反應(yīng)所致，大量炎癥因子侵襲肺組織，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，增加了患者病死率[12-13]。因此，積極控制炎癥反應(yīng)和對癥治療在急性肺損傷治療過程中顯得極為關(guān)鍵。

本研究制備的急性肺損傷大鼠模型肺損傷評分，W/D 比值，IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯升高，同時具有明顯的病理特征變化，肺泡組織結(jié)構(gòu)遭受明顯破壞，肺泡間隔亦明顯增厚，肺泡及肺間質(zhì)滲出紅色物質(zhì)，大量炎癥細胞浸潤，肺組織受到嚴重損傷，提示大鼠內(nèi)毒急性肺損傷模型成功制備。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動藥，具有包括抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗致癌性在內(nèi)的多種藥理學活性，隨著對其臨床應(yīng)用的深入研究，右美托咪定的器官保護尤其在肺損傷保護的作用愈發(fā)受到關(guān)注，既往研究顯示，右美托咪定能夠減輕 LPS 致大鼠急性肺損傷[14-15]。本研究顯示，與模型組比較，右美托咪定組肺/體比值、肺損傷評分及IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯降低，結(jié)合HE染色結(jié)果同時也說明右美托咪定對膿毒癥大鼠急性肺損傷具有保護作用，本研究與以往研究類似，為了進一步確定其保護機制，本研究選取Nrf2/HO-1通路作為切入點。Nrf2 是屬于 CNC家族，有6個不同的功能區(qū)，Nrf2 啟動抗氧化應(yīng)激作用的重要進程，Nrf2 通路下游的抗氧化物質(zhì)就是HO-1，它在機體抗氧化應(yīng)激、清除自由基中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-17]。近年來，有研究表明，Nrf2/HO-1通路參與調(diào)控自噬過程，而自噬在急性肺損傷過程中發(fā)揮重要作用[18]，故本研究首次研究Nrf2/HO-1自噬通路是否參與右美托咪定在減輕急性肺損傷中的作用，在本研究中，模型大鼠肺組織Nrf2，ATG-5和P62蛋白高表達，而HO-1表達下調(diào)，表明肺損傷后自噬激活，但P62增高則提示自噬流不通暢，無法發(fā)揮正常生理功能[19-20]。給予Nrf2抑制劑鴉膽子苦醇后，ATG-5和P62蛋白表達相對于模型組來說明顯減弱，提示給予Nrf2抑制劑后自噬程度減弱，自噬體的降解速度加快，使受損的自噬流恢復(fù)通暢，同時肺損傷評分降低，肺損傷組織病理改變程度減輕，炎癥因子水平均顯著下降，提示肺損傷癥狀明顯減輕，更加證實Nrf2/HO-1-自噬通路在肺損傷中發(fā)揮重要作用，為了進一步證實Nrf2/HO-1通路調(diào)節(jié)的自噬過程是否參與右美托咪定的作用過程，故本研究實驗設(shè)計上在Nrf2抑制劑基礎(chǔ)上聯(lián)用右美托咪定，觀察其自噬蛋白表達和肺損傷變化情況，結(jié)果顯示，聯(lián)用右美托咪定后自噬蛋白的減弱趨勢顯著增強，與此同時肺損傷程度減輕程度更為明顯，表明Nrf2抑制劑和右美托咪定對于通過Nrf2/HO-1通路調(diào)節(jié)自噬過程具有協(xié)同作用，能夠更顯著改善病情，進一步證實了Nrf2/HO-1自噬通路參與右美托咪定減輕肺損傷過程。

綜上所述，右美托咪定可能通過抑制Nrf2/HO-1自噬通路減輕 LPS 誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷。在后續(xù)的研究工作中將會對右美托咪定調(diào)控急性肺損傷過程中自噬的作用靶點進行更加深入的研究，同時為膿毒癥所致急性肺損傷的治療方向提供更充實的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-05-17）