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      基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的葡萄籽油抗癌和抗腫瘤功能成分及機(jī)制研究

      2021-01-28 07:19:22張麗明馬雅鴿趙聲蘭陳朝銀梁仲雄
      糧油食品科技 2021年1期
      關(guān)鍵詞:葡萄籽兒茶素抗癌

      張麗明,馬雅鴿,張 希,趙聲蘭?,陳朝銀,梁仲雄

      (1. 云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500;2. 云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院,云南 昆明650106;3. 云南成滿生物科技有限公司,云南 大理 671600)

      癌癥是嚴(yán)重危害人類身體健康的常見疾病。據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)GLOBOCAN 2018估計(jì),世界癌癥新發(fā)病例約有 1 808萬例,而死亡病例約 956萬例,其中中國分別約占 23.7%和30%。在地域發(fā)病情況方面,亞洲的癌癥死亡數(shù)占全球 57.3%,且預(yù)后差、死亡率高的癌癥類型在這些地區(qū)發(fā)生率較高[1]。癌癥的發(fā)病形勢(shì)日益嚴(yán)峻,使得腫瘤預(yù)防和治療的社會(huì)壓力和醫(yī)療壓力與日俱增?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)癌癥的治療主要以手術(shù)、化療、放療及靶向藥物為主,由于其較大的副作用及腫瘤自身的消耗性,患者正氣虛弱、氣血虧損,治療效果不盡人意,甚至出現(xiàn)“一邊治療,一邊轉(zhuǎn)移”的現(xiàn)象[2]。近幾年來,中藥由于其藥源廣泛,副作用小等特點(diǎn)備受關(guān)注,成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[3]。

      葡萄籽是葡萄科葡萄屬植物葡萄(Vitis viniferaL.)的種子。葡萄籽油是葡萄籽活性部位之一,含有豐富的亞油酸[4]、維生素E[5-6]、植物甾醇[7-8]、多酚[9-10]、角鯊烯[11]和類胡蘿卜素[12]等活性成分,具有延緩衰老、抑制肥胖、抗癌、抗腫瘤、抗炎、降血脂等生物功能[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要通過文獻(xiàn)挖掘等方法構(gòu)建生物信息網(wǎng)絡(luò),通過分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行藥物作用多靶點(diǎn)預(yù)測(cè),其研究思路與中醫(yī)藥整體觀念相一致,可應(yīng)用于解決中藥及復(fù)方研究中多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用特點(diǎn)帶來的難題[14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的活性成分及作用靶點(diǎn),揭示其作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 葡萄籽油活性成分及靶點(diǎn)的收集

      通過查閱文獻(xiàn)收集葡萄籽油的活性成分及利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)獲得其口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-likeness,DL)和小腸上皮細(xì)胞滲透率(Caco-2 permeability)值及各活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),匯集靶點(diǎn),并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將藥物靶點(diǎn)的蛋白名稱轉(zhuǎn)換成GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)的基因名稱。

      1.2 癌癥/腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的搜集

      從在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM,https://www.omim.org/)和人類基因數(shù)據(jù)庫(Gene-Cards,https://www.genecards.org/)中收集與關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”相關(guān)的靶點(diǎn),整理獲得癌癥和腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)。

      1.3 活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

      使用Venn在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將活性成分靶點(diǎn)-癌癥和腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)取交集,獲得葡萄籽油的潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape3.7.2軟件[15],建立藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。圖中節(jié)點(diǎn)(node)代表葡萄籽油、活性成分、靶點(diǎn)、疾病,邊(edge)分別代表活性成分和靶點(diǎn)或靶點(diǎn)和疾病的交互作用。

      1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))的構(gòu)建

      將篩選得到的潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)導(dǎo)入String[16](https://string-db.org, ver 11.0)在線平臺(tái)數(shù)據(jù)庫,以研究靶蛋白相互作用,設(shè)置物種為“人類”,構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò))。在PPI圖中,每一個(gè)實(shí)心圓圈代表一個(gè)基因,圓圈的中間顯示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),而圓圈由不同顏色的線條連接。每一線條代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的生物學(xué)過程,包括基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移等。

      1.5 GO 功能和KEGG通路富集分析

      采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),對(duì)葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析,以了解靶點(diǎn)的生物學(xué)過程,KEGG通路分析研究藥物靶點(diǎn)主要信號(hào)通路,DAVID平臺(tái)列表與背景均設(shè)置為“Homo sapiens”(人類),GO富集分析選擇生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組成(cellular component)3個(gè)模塊,通路分析選擇KEGG。

      2 結(jié)果

      2.1 葡萄籽油活性成分及靶點(diǎn)的篩選

      通過已有文獻(xiàn)報(bào)道[17-20],篩選得到葡萄籽油主要活性成分15種,為脂肪酸及其油脂伴隨物。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)檢索到葡萄籽油主要活性成分除角鯊烯外均有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),總計(jì) 366個(gè),刪除重復(fù)項(xiàng),共獲得 236個(gè)活性成分靶點(diǎn)。葡萄籽油主要活性成分信息見表1。

      2.2 葡萄籽油活性成分抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)收集

      在兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“cancer”和“tumor”進(jìn)行疾病靶點(diǎn)搜索,GeneCards數(shù)據(jù)庫以 score≥30進(jìn)行篩選,得到 667個(gè),OMIM數(shù)據(jù)庫得到24個(gè),合并獲得686個(gè)癌癥和腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)。利用Venn在線軟件將葡萄籽油活性成分對(duì)應(yīng)的209個(gè)藥物靶點(diǎn)(刪除未找到基因名稱的靶點(diǎn))與癌癥及腫瘤相關(guān)的686個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集,通過Venn圖(如圖1)的形式得到93個(gè)葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)(見表2)。

      圖1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)關(guān)系圖Fig.1 The relationship between drug targets and disease targets

      表2 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)信息Table 2 Information on potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

      續(xù)表2

      2.3 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

      利用 Cytoscape 3.7.2軟件建立藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖 2),共有108個(gè)節(jié)點(diǎn)、390條邊,其中紅色節(jié)點(diǎn)代表葡萄籽油,13個(gè)紫色節(jié)點(diǎn)代表葡萄籽油的活性成分,93個(gè)藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表癌癥和腫瘤靶點(diǎn),黃色節(jié)點(diǎn)代表癌癥和腫瘤,390條邊代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。該網(wǎng)絡(luò)中化合物的平均度值為22.77,由高到低依次為 Trans-resveratrol(反式白藜蘆醇)(degree=158)、ursolic acid(熊果酸)(degree=68)、(-)-epicatechin(表兒茶素)(degree=24)、palmitic acid(棕櫚酸)(degree=14)、(+)-catechin(兒茶素)(degree=6)、Stigmasterol(豆甾醇)(degree=6)、Vitamin E(維生素 E)(degree=4)、stearic acid(硬脂酸)(degree=4)、oleic acid(油酸)(degree=4)、brassicasterol(菜籽甾醇)(degree=2)、Erucic acid(芥酸)(degree=2)、Linolenic acid(亞麻酸)(degree=2)、Linoleic acid(亞油酸)(degree=2),其中反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等可能是主要抗癌和抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖可知,Trans-resveratrol(反式白藜蘆醇)作用于PTGS2、BCL2、IL10、TNF、PTEN、PLAU、CAT、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CCL2、IL1A、RELA 等 79個(gè)靶點(diǎn),ursolic acid(熊果酸)作用于PTGS2、BCL2、TNF、PLAU、JUN、IL6、CASP3、CREB1、RELA、STAT3等34個(gè)靶點(diǎn),(-)-epicatechin(表兒茶素)作用于 PTGS2、TNF、PLAU、ESR1、AKT1、JUN、IL6、CASP3、CREB1、CCL2、IL2、IL1A這12個(gè)靶點(diǎn),palmitic acid(棕櫚酸)作用于 PTGS2、CTSD、BCL2、IL10、TNF、COL1A1、PTEN這7個(gè)靶點(diǎn);靶點(diǎn)PTGS2與Linoleic acid(亞油酸)、oleic acid(油酸)、palmitic acid(棕櫚酸)、stearic acid(硬脂酸)、Linolenic acid(亞麻酸)、Erucic acid(芥酸)、Stigmasterol(豆甾醇)、Vitamin E(維生素E)、(+)-catechin(兒茶素)、(-)-epicatechin(表兒茶素)、Trans-resveratrol(反式白藜蘆醇)、ursolic acid(熊果酸)這 12個(gè)化合物相互作用,TNF、PLAU等多個(gè)靶點(diǎn)均與(-)-epicatechin(表兒茶素)、Trans-resveratrol(反式白藜蘆醇)、ursolic acid(熊果酸)作用,體現(xiàn)了葡萄籽油多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同抗癌和抗腫瘤的作用。

      圖2 葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Active ingredients of grape seed oil-anti-cancer and anti-tumor target network

      2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

      應(yīng)用String在線平臺(tái)對(duì)葡萄籽油的93個(gè)潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,設(shè)置物種為“人類”,將蛋白相互作用評(píng)分置信度設(shè)置為0.900,隱藏離散的靶點(diǎn),獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3)。該網(wǎng)絡(luò)中包含93個(gè)節(jié)點(diǎn),482條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為 10.4。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值大小,關(guān)鍵靶點(diǎn)依次有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3(STAT3)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原激活的蛋白激酶 3(MAPK3)、腫瘤抑制蛋白 p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原激活的蛋白激酶8(MAPK8)、原癌基因 c-Fos(FOS)、白介素 6(IL6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A(VEGFA)、Myc原癌基因蛋白(MYC)、雌激素受體(ESR1)、半胱天冬酶 8(CASP8)、半胱天冬酶 3(CASP3)等,這些靶蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位,與其他多個(gè)靶點(diǎn)相連,可能與葡萄籽油發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用關(guān)系密切。

      圖3 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

      2.5 GO 功能富集分析

      將葡萄籽油 93個(gè)潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析(見圖4),獲得607條生物學(xué)過程條目,其中P< 0.05的生物學(xué)過程有477條,富集的前20個(gè)生物學(xué)功能依次為蛋白質(zhì)結(jié)合(84個(gè)靶點(diǎn))、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合(28個(gè)靶點(diǎn))、酶結(jié)合(23個(gè)靶點(diǎn))、蛋白質(zhì)異二聚活性和蛋白質(zhì)均二聚活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(19個(gè)靶點(diǎn))、蛋白激酶結(jié)合(15個(gè)靶點(diǎn))、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合(14個(gè)靶點(diǎn))、序列特異性DNA結(jié)合(14個(gè)靶點(diǎn))、細(xì)胞因子活性(12個(gè)靶點(diǎn))、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合(11個(gè)靶點(diǎn))、轉(zhuǎn)錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合(10個(gè)靶點(diǎn))、生長(zhǎng)因子活性和蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合及激酶活性(9個(gè)靶點(diǎn))、蛋白酶結(jié)合(8個(gè)靶點(diǎn))、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(6個(gè)靶點(diǎn))、蛋白磷酸酶2A結(jié)合和腫瘤壞死因子受體結(jié)合(5個(gè)靶點(diǎn))、BH3域結(jié)合(4個(gè)靶點(diǎn)),表明葡萄籽油可通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用。

      2.6 KEGG 信號(hào)通路分析

      對(duì)葡萄籽油 93個(gè)潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路注釋分析,獲得119條信號(hào)通路條目,其中P< 0.05的通路有113條,包括大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等通路,涉及 NOD樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等經(jīng)典信號(hào)通路,排名靠前的條目有癌癥通路、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、癌癥中的蛋白聚糖通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥中的MicroRNA通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路、非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、炎性腸病(IBD)、Toll樣受體信號(hào)通路、慢性粒細(xì)胞白血病、甲狀腺激素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。由此推測(cè),葡萄籽油可能通過調(diào)節(jié)以上信號(hào)通路來發(fā)揮抗癌和抗腫瘤作用,富集的前 20條通路分析結(jié)果見表 3。

      圖4 葡萄籽油潛在抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)GO富集結(jié)果柱形圖Fig.4 Bar graph of GO enrichment results of potential anti-cancer and anti-tumor targets of grape seed oil

      3 討論

      葡萄籽油是一種性能良好、營養(yǎng)價(jià)值極高、對(duì)人體無毒無害無副作用且完全符合食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的功能型食用油脂,因其豐富的不飽和脂肪酸組成、無煙特性且加熱不易產(chǎn)生有害物質(zhì)等特點(diǎn)而成為近年來備受歡迎的高端食用油[13]。目前關(guān)于葡萄籽油抗癌研究較少,有研究結(jié)果顯示,葡萄籽油對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用[21]。另有報(bào)道,葡萄籽油已被嘗試作為納米制劑的載體用于癌癥的治療[22]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13,18],葡萄籽油含有亞油酸、多酚類物質(zhì)、維生素 E、植物甾醇、角鯊烯等成分,這些成分均有抗癌和抗腫瘤的生物學(xué)功能,可見葡萄籽油在治療癌癥和腫瘤方面潛力極大。本研究結(jié)果顯示,反式白藜蘆醇、熊果酸、表兒茶素、棕櫚酸等化合物在葡萄籽油活性成分-抗癌和抗腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中與其他多個(gè)疾病靶點(diǎn)相連,可能是主要抗癌和抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)。反式白藜蘆醇、表兒茶素均為多酚類物質(zhì),此外,豆甾醇、維生素 E、菜籽甾醇、亞油酸雖不是關(guān)鍵靶點(diǎn),但與疾病靶點(diǎn)也有一定關(guān)聯(lián),說明本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。另外,角鯊烯也具有抗腫瘤作用[13]及有效預(yù)防和抑制化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸癌、胰腺癌、皮膚癌等多種癌癥的發(fā)生[18],可能是由于其在植物油脂中存在量較少、研究較少,所以未能在數(shù)據(jù)庫中找到其作用靶點(diǎn)。

      PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),葡萄籽油抗癌和抗腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)依次為 STAT3、MAPK1、MAPK3、TP53、JUN、AKT1、RELA、TNF、MAPK8、FOS、IL6、VEGFA、MYC、ESR1、CASP8、CASP3等,這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與調(diào)控酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、BH3域結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、序列特異性 DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活子活性及RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合、蛋白磷酸酶 2A結(jié)合、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性 DNA結(jié)合、激酶活性等生物學(xué)功能,參與大腸癌、胰腺癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等通路的調(diào)控,NOD樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)控。

      綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,預(yù)測(cè)了葡萄籽油抗癌和抗腫瘤作用的功能成分及作用靶點(diǎn)、生物學(xué)過程與富集通路,從分子的角度探討其抗癌和抗腫瘤作用機(jī)制,體現(xiàn)了葡萄籽油通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的方式來治療癌癥和腫瘤。

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