不同碳源條件下金黃色蝶形擔(dān)孢酵母發(fā)酵合成多糖的動(dòng)力學(xué)及結(jié)構(gòu)差異

趙英杰 程 新

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045)

酵母胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是酵母菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞外的一類水溶性大分子糖類物質(zhì)[1]?，F(xiàn)有研究表明，酵母菌的EPS 具有較好的體外抗氧化[2]、抗腫瘤和抗病毒活性[3-4]以及較高的化學(xué)元素結(jié)合能力[5]，在食品、醫(yī)藥及化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

碳源是合成EPS 的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，其種類及含量不僅影響EPS 的產(chǎn)量[6-8]，而且在不同碳源條件下合成的EPS 在分子結(jié)構(gòu)[9]、活性[10]和理化性質(zhì)等方面也存在較大差異[11]。張佳佳[12]研究了3 種碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖)對海洋假單胞菌(Pseudomonas)FT-8 的EPS 結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響，所得EPS 產(chǎn)量分別為6.98、6.35 和5.93 g·L-1，掃描電鏡顯示其EPS 的固態(tài)形貌差異較大，分別呈現(xiàn)絲狀、片狀和絮狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)不同碳源所得EPS 的單糖組成也有一定的差異；Fukuda等[11]研究了碳源對發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum) TDS030603 合成EPS 的影響，EPS 單糖組成均為葡萄糖和半乳糖，但其摩爾比存在差異。

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所前期從云南大理傳統(tǒng)乳制品乳扇中篩選到一株高產(chǎn)EPS 的金黃色蝶形擔(dān)孢酵母(Papiliotrema aurea)DF-12，并對其碳源利用情況進(jìn)行了初步探究，結(jié)果表明在不同碳源條件下，EPS 產(chǎn)量的差異較大，其中葡萄糖和蔗糖產(chǎn)量較高，同時(shí)該菌株也能利用糖蜜合成EPS。在前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)首先從動(dòng)力學(xué)角度分析了金黃色蝶形擔(dān)孢酵母利用不同碳源對其生長、產(chǎn)物合成及底物消耗的差異性，然后用離子交換色譜和凝膠色譜分離純化EPS，并對其結(jié)構(gòu)特征的差異進(jìn)行分析比較，以期為金黃色蝶形擔(dān)孢酵母所產(chǎn)EPS 的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 從云南傳統(tǒng)乳扇中篩選的金黃色蝶形擔(dān)孢酵母(P.aurea)DF-12。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose，YEPD):葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、蒸餾水1 L；基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基:葡萄糖50 g、硫酸銨2 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母浸粉1 g、氯化鈣0.1 g、吐溫-80 1 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 值6.0；不同碳源產(chǎn)糖培養(yǎng)基:以相同質(zhì)量濃度的蔗糖及糖蜜替代基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基中的葡萄糖；不同碳源濃度培養(yǎng)基:分別以30、40、50、60 g 葡萄糖、蔗糖及糖蜜代替基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基中的碳源；以上培養(yǎng)基均在100 kPa、121℃高壓滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JW-3022HR 高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；721 可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250-C 培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；LT1002B 電子天平，常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；BSZ-100 自動(dòng)收集器，上海青浦瀘西儀器廠；FEI Quanta 250 型掃描電子顯微鏡、Spectrum Two FT-IR 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer；金普GC8890氣相色譜儀，山東金普分析儀器有限公司；HH 恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠；LT1002B 電子天平，常熟市天量儀器有限公司；LC-10A 高效液相色譜儀、RID-10A 示差檢測器，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1P.aureaDF-12 的分批發(fā)酵培養(yǎng)及測定方法

1.3.1.1 培養(yǎng)方法 將酵母菌挑取一環(huán)接種于YEPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期，作為種子液。將種子液按2%的接種量接種至相同濃度的不同碳源發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測定其菌體生物量(OD600)、發(fā)酵液pH 值、EPS 產(chǎn)量及殘?zhí)菨舛取?/p>

1.3.1.2 生物量的測定 取適量發(fā)酵液，將發(fā)酵液于8 000 r·min-1離心10 min，并用無菌水洗滌菌體2 次，復(fù)懸，于600 nm 波長處測定其吸光度值(OD600)。

1.3.1.3 EPS 產(chǎn)量的測定 將發(fā)酵液于10 000 r·min-1離心10 min，取適量上清液用三氯乙酸法除蛋白，10 000 r·min-1離心10 min，棄去蛋白沉淀后，小心吸取上清液加入3 倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，10 000 r·min-1離心10 min，所得沉淀用適量蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測定EPS 產(chǎn)量[13]。

1.3.1.4 殘?zhí)菨舛鹊臏y定 葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基，以二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定其殘?zhí)菨舛萚14]；以蔗糖和糖蜜為碳源的培養(yǎng)基，殘?zhí)菨舛扔每偺菨舛葴p去EPS 含量表示，總糖濃度用硫酸苯酚測定[13]。

1.3.2 不同碳源條件下所合成EPS 的體外抗氧化活性測定 參照文獻(xiàn)測定EPS 的DPPH 自由基清除率[15-16]、羥基自由基清除率[17]、超氧陰離子自由基清除率[17]及還原力[18]。均以維生素C(Vitamin C，Vc)作陽性對照。

1.3.3 不同碳源條件下所合成EPS 的分離純化

1.3.3.1 粗EPS 的制備 挑取一環(huán)酵母菌接種于YEPD 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期，作為種子液。將種子液按2%的接種量接種至相同濃度的不同碳源發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)168 h。將發(fā)酵液于10 000 r·min-1離心10 min，取適量上清液用三氯乙酸法除蛋白，10 000 r·min-1離心10 min，棄去蛋白沉淀后，小心吸取上清液加入3 倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，10 000 r·min-1離心10 min，將所得沉淀冷凍干燥即為粗EPS[19]。

1.3.3.2 DEAE 纖維素DE-52 離子交換柱層析 取10 mL 10 mg·mL-1粗EPS 溶液，用0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，加樣于層析柱(2.6 cm×50 cm)中，分別用去離子水(1 ～20 管)、0.1 mol·L-1NaCl(21 ～40 管)、0.3 mol·L-1NaCl(41 ～60 管)和0.5 mol·L-1NaCl(61～80 管)溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL·min-1，分別收集洗脫液(10 mL/管)，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以各管在490 nm 波長處的吸光度值為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到洗脫曲線[20]。收集不同洗脫梯度下相應(yīng)的組分，合并相同組分，濃縮后用去離子水透析3 d 以去除小分子雜質(zhì)，將透析液濃縮后，再真空冷凍干燥，得到EPS 經(jīng)DEAE 纖維素DE-52 分離的組分。

1.3.3.3 Sephadex G-100 凝膠柱層析 準(zhǔn)確稱取經(jīng)DEAE 纖維素DE-52 分離后的各多糖組分1 mg，溶于2 mL 去離子水中，用膠頭滴管吸取樣品，沿色譜柱柱壁圓周緩緩加入已平衡的Sephdex G-100 層析柱(2.6 cm× 50 cm) 中，用去離子水洗脫，流速為0.2 mL·min-1，分部收集洗脫液(2 mL/管)用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，以各管在490 nm 波長處的吸光度值為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到洗脫曲線[21]。同時(shí)合并各吸收峰的洗脫液，減壓濃縮，用去離子水透析3 d 以去除小分子雜質(zhì)，將透析液真空冷凍干燥，得到純化后的EPS。

1.3.4 不同碳源條件下所合成EPS 的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法測定。精密稱取1.3.3.3 純化后的胞外多糖配制成5 mg·mL-1溶液，12 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 mL進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣量20 μL。以不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖(1 152、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800)作為標(biāo)準(zhǔn)品，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定EPS 的純度及相對分子質(zhì)量。流動(dòng)相為0.05 mol·L-1NaCl，流速0.6 mL·min-1，柱溫40℃。

1.3.4.2 掃描電鏡觀察 取少量純化的EPS 組分凍干物，固定于掃描電鏡銅臺(tái)上，噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.4.3 紅外光譜分析 取適量純化得到的EPS 加入KBr 壓片制樣，在4 000 ～400 cm-1區(qū)間內(nèi)用傅里葉變換紅外光譜儀掃描紅外線被吸收的情況[22]。

1.3.4.4 氣相色譜分析 稱取5 mg 純化的EPS 置于安瓿瓶中，加入2 mL 2 mol·L-1三氟乙酸，封口后于120℃水解2 h，然后將水解物減壓蒸干，反復(fù)加入甲醇減壓蒸干以除去殘留的三氟乙酸。采用糖腈乙酰酯化法，先向減壓蒸干的樣品中加入0.6 mL 吡啶以溶出樣品，然后再加入8 mg 肌醇六乙酰酯和10 mg 鹽酸羥胺，90℃水浴30 min 后冷卻至室溫，再加入1 mL 乙酸酐繼續(xù)水浴30 min，待冷卻至室溫后，用0.45 μm 濾膜過濾后采用氣相色譜儀分析。單糖標(biāo)準(zhǔn)品同上述操作[23-24]。

1.4 動(dòng)力學(xué)模型[25]

1.4.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型的建立 利用Logistic 方程建立P.aureaDF-12 的菌體生長動(dòng)力學(xué)模型，Logistic 方程為:

式中，X 為細(xì)胞質(zhì)量濃度，g·L-1；μ為比生長速率，h-1；t表示時(shí)間，h；下標(biāo)max 表示最大值。對式(1)積分，并代入X=X0(下標(biāo)0 表示t=0 時(shí)刻的值)，可得到生物量與時(shí)間函數(shù):

將X(t)對時(shí)間t進(jìn)行非線性擬合，獲得最大比生長速率(μmax)、X0以及Xmax。相關(guān)系數(shù)(R2)可評價(jià)模型擬合程度。

1.4.2 產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型的建立

EPS 合成采用Luedeking-piret 模型:

式中，P為產(chǎn)物濃度，g·L-1；α，β是經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，和αX分別表示生長關(guān)聯(lián)與非生長關(guān)聯(lián)的EPS 合成速率。將式(2)帶入式(3)，得:

將P(t)對t進(jìn)行非線性擬合，可獲得α、β及初始P0，R2可評價(jià)模型擬合程度。多糖比生產(chǎn)速率可由式(3)計(jì)算獲得。即

1.4.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型的建立 底物消耗采用Herbert-pirt 方程模型:

式中，ke為細(xì)胞維持系數(shù)；YX為菌體對基質(zhì)的得率系數(shù)；S為基質(zhì)濃度，g·L-1；YP為產(chǎn)物對基質(zhì)的得率系數(shù)。將式(3)代入式(5)，得:

式中，m，n為常數(shù)，和nX分別表示生長關(guān)聯(lián)和非生長關(guān)聯(lián)底物消耗速率。將式(2)代入式(6)，積分得:

將S(t)對t進(jìn)行非線性擬合，可獲得模型參數(shù)m、n、初始值S0。R2可評價(jià)模型擬合程度。底物比消耗速率可由式(6)計(jì)算獲得。即=-mμ -n。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用OriginPro 9.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對P.aurea DF-12 合成EPS 的影響

2.1.1 不同碳源對P.aureaDF-12 生理代謝的影響

由圖1 可知，當(dāng)以葡萄糖或蔗糖作為碳源時(shí)，酵母菌的發(fā)酵代謝較為一致，且發(fā)酵的EPS 的產(chǎn)量較高，均大于4 000 mg·mL-1。而以糖蜜作為碳源時(shí)，雖然微生物的生長速度較為迅速，但EPS 產(chǎn)量較低，且發(fā)酵特征與葡萄糖、蔗糖相差較大，發(fā)酵液pH 值在后期呈明顯的上升趨勢，且殘?zhí)菨舛认陆档酶鼮檠杆?，這與Grigorova等[26]的研究結(jié)果一致。

圖1 不同碳源條件下P.aurea DF-12 生理代謝特征比較Fig.1 Comparison of physiological and metabolic characteristics of P.aurea DF-12 under different carbon sources

2.1.2 不同碳源條件下的菌體生長、多糖合成及底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合 分別采用Logistic、Luedeking-Piret 以及Herbert-pirt 方程建立P.aureaDF-12 合成EPS 過程中生物量的變化、產(chǎn)物合成和基質(zhì)消耗，各模型的參數(shù)值見表1，各試驗(yàn)組的模型擬合R2均大于0.9，3 種模型均可以很好地?cái)M合試驗(yàn)值(圖2)，可以用來描述P.aureaDF-12 動(dòng)力學(xué)特征。

由表1 可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，P.aureaDF-12的最大比生長速率μmax約為0.15 h-1，而以蔗糖和糖蜜為碳源時(shí)，μmax均約為0.11 h-1。在產(chǎn)物合成方面，以蔗糖為碳源能獲得最大多糖比生產(chǎn)速率(11.95 h-1)，而以糖蜜為碳源時(shí)的最大多糖比生產(chǎn)速率僅為2.37 h-1；另外3 種碳源模型中，代表與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物形成參數(shù)α和代表與菌體生長非相關(guān)的產(chǎn)物形成參數(shù)β均不為0，說明P.aureaDF-12 的EPS 合成為部分生長偶聯(lián)型。從底物消耗角度來看，以糖蜜為碳源時(shí)，其最大底物比消耗速率較大，達(dá)328.73 h-1，而以蔗糖為碳源時(shí)最低，為149.36 h-1。

2.1.3 不同碳源濃度對P.aureaDF-12 生理代謝的影響 由圖3 可知，碳源濃度對生物量及pH 值均無較大影響，但葡萄糖和蔗糖濃度對EPS 產(chǎn)量有一定的影響，前期EPS 均較快積累，當(dāng)葡萄糖濃度為30 g·L-1時(shí)，發(fā)酵72 h 后EPS 產(chǎn)量基本保持不變，最終產(chǎn)量僅為3 000 mg·L-1，當(dāng)蔗糖濃度為30 g·L-1時(shí)，EPS 產(chǎn)量增長也于發(fā)酵72 h 后變緩慢，這可能與培養(yǎng)基中碳源被消耗殆盡有關(guān)；當(dāng)碳源濃度為40 ～60 g·L-1時(shí)，EPS產(chǎn)量在發(fā)酵72 h 后仍呈較快增長趨勢，且隨著碳源初始濃度的升高，生物量有一定的增加，但EPS 產(chǎn)量并無較大提升，另外，碳源濃度較高的培養(yǎng)基中，所剩殘?zhí)禽^多。此外，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，糖蜜濃度對P.aureaDF-12 的生物量、pH 值及EPS 產(chǎn)量均無較大影響。

由于以糖蜜為碳源時(shí)獲得的EPS 產(chǎn)量較低，因此選用葡萄糖和蔗糖為酵母菌發(fā)酵碳源，對其發(fā)酵所得EPS 的性質(zhì)做進(jìn)一步分析。

2.1.4P.aureaDF-12 在不同碳源條件下所合成EPS的體外抗氧化活性 以Vc 作為陽性對照，測定在以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)所產(chǎn)EPS(分別簡稱為G-EPS和S-EPS，下同)對DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率及其還原力，結(jié)果如圖4 所示。隨著EPS 濃度的升高，G-EPS 和S-EPS 對3種自由基清除率及其還原力均逐漸增高，但G-EPS 的還原力及其對DPPH 自由基清除率較S-EPS 高，可見碳源種類不同對合成EPS 的抗氧化活性有一定影響。

表1 不同碳源對EPS 分批發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effects of different carbon sources on kinetic parameters of batch fermentation of EPS

圖2 P.aurea DF-12 分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)值和模型值的比較Fig.2 Comparison of experimental values and model values of batch fermentation kinetics of P.aurea DF-12

圖3 不同碳源濃度條件下P.aurea DF-12 生理代謝特征比較Fig.3 Comparison of physiological Metabolism characteristics of P.aurea DF-12 under different carbon Source concentrations

圖4 不同碳源條件下的EPS 對DPPH 自由基清除率、羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率及還原力Fig.4 Scavenging rate of DPPH radical，scavenging rate of hydroxyl radical，scavenging rate and reducing ability of superoxide anionic radical by EPS under different carbon sources

2.2 EPS 分離純化及其結(jié)構(gòu)和單糖組成分析

2.2.1 EPS 經(jīng)DEAE 纖維素DE-52 離子交換柱層析純化結(jié)果 發(fā)酵所得G-EPS 和S-EPS 經(jīng)DEAE 纖維素DE-52 離子交換柱層析分離后，以各管在490 nm波長處的吸光度值和NaCl 濃度為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到洗脫曲線如圖5 所示。結(jié)果表明，經(jīng)NaCl 溶液梯度洗脫后，G-EPS 分離得到3 種組分:G1、G2、G3(63 含量較少，未做進(jìn)一步研究)(圖5-A)，S-EPS 分離得到2 種組分:S1 和S2(圖5-B)。G1和S1 均為去離子水洗出，屬中性多糖；G2 和S2 為0.1 mol·L-1NaCl 溶液洗出，為酸性多糖。

圖5 P.aurea DF-12 的胞外多糖纖維素柱層析的洗脫曲線Fig.5 Eluvial curve of exopolysaccharide cellulose column chromatography for P.aurea DF-12

2.2.2 EPS 經(jīng)Sephadex G-100 凝膠柱層析純化結(jié)果 2 種碳源合成的EPS 經(jīng)DEAE 纖維素DE-52 離子交換層析柱梯度洗脫得到的G1、G2、S1 和S2，4 種組分經(jīng)Sephadex G-100 凝膠柱洗脫曲線見圖6，可以看出4 種組分均呈現(xiàn)單一對稱峰，表明4 種多糖為分子量相對均一的組分，但出峰時(shí)間稍有不同。

圖6 4 種EPS 組分SephadexG-100 柱層析的洗脫曲線Fig.6 SephadexG-100 gel filtration chromatograms of four EPS components

2.2.3 分子量測定 通過高效凝膠滲透色譜測定EPS 組分G1、G2、S1 和S2 分子量和純度，4 種組分均為單一對稱峰，說明其純度較高。lgMw-RT 校正曲線方程為:y=-0.246 7x＋14.099，R2=0.993 1；根據(jù)其出峰時(shí)間對比葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出G1、G2、S1和S2 的重均分子量分別為1.80×106、2.06×106、2.03×106、1.83×106。

2.2.4 掃描電鏡 在掃描電鏡下放大200 倍和800倍觀察以葡萄糖和蔗糖為碳源所合成的EPS 組分G1、G2、S1 和S2 的表面形態(tài)(圖7)，G1 表面呈碎屑狀，G2 為較小的絮狀，S1 則為較大的片狀，S2 為較大的絮狀。

圖7 掃描電鏡觀察Fig.7 Scanning electron microscope observation

2.2.5 紅外光譜分析 研究表明，糖類C-OH 的OH伸縮振動(dòng)吸收峰位于3 570 ～3 050 cm-1區(qū)域內(nèi)，在糖類化合物中，由于存在多個(gè)羥基，通常出現(xiàn)多個(gè)振動(dòng)吸收峰，形成寬的吸收帶。2 925～2 935 cm-1區(qū)域內(nèi)為烯烴CH2伸縮振動(dòng)，1 730～1 630 cm-1是C=O 的伸縮振動(dòng)，1 060～1 030 cm-1為S=O 的伸縮振動(dòng)[27]。由圖8可知，4 種組分均存在O-H、CH2、C=O 及S=O 伸縮振動(dòng)，僅G1 存在1 365 cm-1處的振動(dòng)，該處為NO2的伸縮振動(dòng)。

圖8 G1、G2、S1 和S2 紅外光譜圖Fig.8 Fourier transforn infrared spectrum of G1、G2、S1 and S2

2.2.6 單糖組成分析 單糖標(biāo)品和EPS 組分G1、G2、S1 和S2 完全水解后經(jīng)糖腈乙酰酯衍生化法的氣相色譜圖結(jié)果如圖9 所示，根據(jù)保留時(shí)間對比可知，4種多糖組分的水解產(chǎn)物對應(yīng)的單糖從左到右分別是L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、肌醇六乙酰酯。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出各組分的摩爾比，結(jié)果如表2 所示，4 種EPS 組分的均含有巖藻糖、鼠李糖、甘露糖及葡萄糖，中性多糖組分G1 和S1 均含有較多的甘露糖和葡萄糖，而同為酸性多糖的G2 和S2 中，巖藻糖和鼠李糖占較大比例。

圖9 單糖標(biāo)品、G1、G2、S1 和S2 的氣相色譜結(jié)果圖Fig.9 Gas chromatograms of monosaccharides composition，G1，G2，S1 and S2

表2 G1、G2、S1 和S2 的單糖組成摩爾比Table 2 The molar ratio of monosaccharide to S2，G2，S1 and S2

3 討論

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究微生物代謝與環(huán)境之間相互作用隨時(shí)間變化規(guī)律的一門學(xué)科。通過不同的工藝條件和發(fā)酵參數(shù)建立菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗模型，能深入了解菌體的生理代謝特性，為發(fā)酵生產(chǎn)工藝的調(diào)節(jié)控制提供理論依據(jù)。通過研究不同碳源對P.aureaDF-12 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖是P.aureaDF-12 較容易利用的碳源，蔗糖可能是P.aureaDF-12 合成EPS 最優(yōu)的碳源，糖蜜的多糖比生產(chǎn)速率遠(yuǎn)低于碳源為葡萄糖和蔗糖時(shí)的比生產(chǎn)速率，表明以糖蜜為碳源可能不利于EPS 的合成，因此，為了獲取更高的產(chǎn)物合成效率，選擇葡萄糖或蔗糖作為碳源。本研究發(fā)現(xiàn)，初始碳源濃度對酵母菌體生長及產(chǎn)物合成均有一定的影響，葡萄糖或蔗糖初始濃度較低時(shí)不利于EPS 的合成。

細(xì)胞內(nèi)的自由基主要有羥基自由基、超氧陰離子自由基、羧基自由基、酯氧自由基等。細(xì)胞內(nèi)的自由基過量堆積，會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，過量的自由基會(huì)攻擊生物大分子，加快機(jī)體衰老。目前已有多種化學(xué)分析法可以用來評價(jià)產(chǎn)物的體外抗氧化活性，如ABTS 自由基清除、DPPH 自由基清除、超氧陰離子自由基清除、羥基自由基清除、脂質(zhì)過氧化和還原力測定等試驗(yàn)[28]。已有研究表明，多種酵母EPS 均具有一定清除自由基的能力[29-30]。本研究結(jié)果表明碳源的不同對合成EPS 的抗氧化活性有一定影響，可能是與不同碳源條件下合成EPS 的結(jié)構(gòu)不同相關(guān)。

現(xiàn)有研究報(bào)告大多是對單一碳源條件下酵母EPS的結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行研究，針對碳源對EPS 結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道甚少。本研究中，以葡萄糖和蔗糖為碳源合成的EPS 經(jīng)分離純化后得到4 種EPS 組分，4 種組分純度均較高，其分子量無較大差異，組分G1 與S2、G2 與S1分子量大致相同；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖和蔗糖為碳源合成的EPS 表面結(jié)構(gòu)可能存在一定的差異。通過紅外光譜鑒別多糖中存在的化學(xué)鍵和官能團(tuán)，發(fā)現(xiàn)4 種組分均存在O-H、CH2、C=O 及S=O 伸縮振動(dòng)，僅G1 存在NO2振動(dòng)。碳源的差異對微生物合成的EPS 單糖組成會(huì)產(chǎn)生一定的影響。劉翠平等[31]研究碳源對干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)LC2W 合成EPS 組成的影響，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源合成EPS 的單糖組成為鼠李糖、 葡萄糖和半乳糖，而以乳糖為碳源合成的EPS 單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖。Smiderle 等[32]研究了不同碳源對肺形側(cè)耳(Pleurotus pulmonarius)合成EPS 的影響，結(jié)果表明，碳源對EPS單糖組成無較大影響，所有碳源合成的胞外多糖均含有甘露糖、半乳糖和葡萄糖，但對EPS 產(chǎn)量及單糖摩爾比有一定影響，其中以半乳糖為碳源獲得的EPS 產(chǎn)量最高，達(dá)0.42 g·L-1；Freitas 等[33]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和木糖合成的EPS 與甘油所產(chǎn)生的EPS 具有相同的糖組分(巖藻糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸)，但其單糖摩爾比有所不同。本研究的P.aureaDF-12 在不同碳源條件下，合成的EPS 單糖組成一致，但各單糖摩爾比存在一定差異，這與前人研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究探討了分別以葡萄糖、蔗糖及糖蜜為碳源條件下，P.aureaDF-12 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的差異，結(jié)果表明葡萄糖和蔗糖均可獲得較好的生長與EPS 合成效率，其中蔗糖是P.aureaDF-12 合成EPS 最優(yōu)的碳源。體外抗氧化活性試驗(yàn)表明，以葡萄糖為碳源合成的EPS(G-EPS)對DPPH 自由基清除率及其還原力較以蔗糖為碳源合成EPS(S-EPS)稍高，可見碳源的選擇對合成的EPS 的抗氧化活性有一定影響。G-EPS 和S-EPS 經(jīng)離子交換柱層析及葡聚糖凝膠柱層析分離純化后得到4 種EPS 組分G1、G2、S1 和S2，除掃描電鏡有一定差異外，高效液相色譜儀、紅外光譜及氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)4 種組分的分子量、化學(xué)鍵、官能團(tuán)和單糖組成均無較大差異。本研究結(jié)果為EPS 發(fā)酵生產(chǎn)工藝中碳源的選擇及優(yōu)化提供了一定的理論依據(jù)。