低溫脅迫下苦瓜葉片轉(zhuǎn)錄組差異基因分析及生理響應(yīng)特征

杜文麗 陳中釤 許端祥 徐同偉 高 山 溫慶放

(1福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建 福州 350111；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所，福建 福州 350013)

苦瓜(Momordica charantiaL.)又名涼瓜，起源于東印度，現(xiàn)主要種植于熱帶、亞熱帶和溫帶區(qū)域，加勒比海和南美地區(qū)也有栽培。近年來，人們逐步認(rèn)識(shí)到苦瓜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功能。我國(guó)南方地區(qū)生產(chǎn)的苦瓜除供本地和北運(yùn)外，還遠(yuǎn)銷東南亞地區(qū)，己成為南方部分地區(qū)出口創(chuàng)匯的主要蔬菜之一[1-2]。苦瓜屬喜溫蔬菜，在實(shí)際生產(chǎn)中，苦瓜苗期常常遭受早春寒流或秋季氣溫驟降的侵襲，10℃以下的冷害導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢甚至形成僵苗，嚴(yán)重制約苦瓜種植范圍的擴(kuò)大和上市時(shí)節(jié)的調(diào)節(jié)，生產(chǎn)上亟需選育耐低溫且綜合性狀好的新品種[3]。

與植物耐低溫相關(guān)的研究逐漸由細(xì)胞學(xué)、生理生化轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)，且植物耐低溫分子機(jī)制的研究已取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)已有100 余種轉(zhuǎn)基因耐低溫植物，共涉及50 多個(gè)物種[4-5]。目前，低溫脅迫涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，但對(duì)于植物將低溫脅迫信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，以及激活下游基因表達(dá)使機(jī)體出現(xiàn)耐低溫特性的機(jī)制仍不清楚。前人研究發(fā)現(xiàn)CBF1 通過結(jié)合CRT/DRE(c-repeat/dehydration responsive element)順式作用元件，調(diào)控耐低溫特性基因表達(dá)來參與植物中低溫脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)，這種通過轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的信號(hào)路在學(xué)術(shù)界已被廣泛驗(yàn)證[6-7]。有研究學(xué)者先后在擬南芥中獲得CBF2、CBF3 和CBF4 基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)擬南芥植株耐低溫脅迫的能力得到顯著提升，且導(dǎo)致許多與低溫脅迫相關(guān)的生理生化指標(biāo)發(fā)生變化，如脯氨酸和可溶性糖含量增加等[8]。周麗霞等[9]發(fā)現(xiàn)WRKY7、WRKY1 等基因?qū)τ妥氐哪偷蜏匦园l(fā)揮調(diào)控作用。李佳[10]研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯在4℃處理后 St2RMYB80 基因表達(dá)量下調(diào)，St4RMYB1 和St3RMYB2 基因表達(dá)量上調(diào)。

第二代測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNAseq)領(lǐng)域，通過比對(duì)植物生物和非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組基因reads 數(shù)獲得植物體大量基因信息，能夠在分子水平上了解基因表達(dá)量的變化，揭示特定的生物學(xué)過程和分子機(jī)制[11-13]。Chen 等[13]通過Illumina nextseq 2500 測(cè)序平臺(tái)對(duì)低溫脅迫下的甘蔗葉片進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2 583 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，3 302 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。黃超[11]利用Illumina Hiseq-2000 測(cè)序平臺(tái)對(duì)4℃低溫處理0.8 和32 h 的甜瓜葉片進(jìn)行測(cè)序，篩選出19個(gè)包括編碼WRKY、b HLH、NAC、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)可能與耐低溫具有潛在相關(guān)的候選基因。此外，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于大白菜、花椰菜、黃瓜等蔬菜作物研究中[14-17]。目前，關(guān)于苦瓜在低溫脅迫方面的研究還限于表型、生理生化指標(biāo)鑒定和遺傳規(guī)律等方面[18-19]，通過RNA-seq 揭示苦瓜的耐低溫機(jī)制方面研究鮮有報(bào)道，在一定程度上約束了苦瓜育種進(jìn)程。

本研究以福州市蔬菜科學(xué)研究所選育的較耐低溫苦瓜自交系43 為研究對(duì)象，依托百邁客Illumina HiSeq2500 平臺(tái)對(duì)26℃(對(duì)照)和模擬福建早春夜溫8℃氣候[20]處理12 h 的兩個(gè)樣品葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，再通過生理指標(biāo)分析和分子手段對(duì)苦瓜響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制進(jìn)行探討，同時(shí)進(jìn)一步挖掘苦瓜耐低溫相關(guān)的候選基因，以期為苦瓜耐低溫基因工程提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為耐低溫苦瓜自交系43，由福州市蔬菜科學(xué)研究所苦瓜課題組選育。選取飽滿健壯的苦瓜種子采用溫湯浸種法催芽，待種子露白后轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)缽中(椰糠＋草木灰)中，隨后放置于26℃培養(yǎng)箱(立德泰勒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào):LT-ACC)中培養(yǎng)，光強(qiáng)8 000 lx，相對(duì)濕度70%)。約2 周后苦瓜苗生長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)至8℃，選取生長(zhǎng)良好、發(fā)育狀態(tài)一致的苦瓜苗進(jìn)行低溫處理，處理前澆透水。觀察每個(gè)時(shí)期的植株形態(tài)，其他培養(yǎng)條件同上[20]。處理0(對(duì)照)、4、8、12 h 后剪取幼苗真葉測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。剪取處理后剪取12 h 幼苗真葉用錫箔紙包好，以0 h 為對(duì)照，立即放置于液氮中速凍后送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行RNA-seq。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定方法

硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TAB)法用于測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。酸性茚三酮法用于測(cè)定游離脯氨酸(proline，Pro)含量。電解質(zhì)滲出率(rate of electrolyte efflux，REC)的測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]。

1.3 RNA-seq 方法

總RNA 按照提取后經(jīng)消化處理后及時(shí)對(duì)RNA 樣品的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)，保證使用高質(zhì)量的RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。依托Illumina HiSeq2500 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)試工作，PE150 為測(cè)序讀設(shè)置值。利用FASTX 軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，即去除Raw Data 中的接頭和低質(zhì)量序列后得到Clean Data，再使用Trinity 軟件進(jìn)行組裝最終獲得Unigene序列。利用BLAST 程序(設(shè)置E-value= 10-5)使用NR、COG、KOG 及KEGG 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigene 進(jìn)行注釋及和分類?；虮磉_(dá)衡量指標(biāo)采用FPKM 法[22]，使用DESeq[23]對(duì)樣品間差異表達(dá)進(jìn)行分析，以樣品間表達(dá)量符合錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率數(shù)≥2 且≤0.5 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得差異表達(dá)基因。最后對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 功能注釋、COG 功能注釋和富集分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

參照植物RNA 提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit，天根生化科技有限公司)獲得苦瓜葉片的總RNA，然后參照[Prime ScriptTM RT reagent Kit，寶生物工程(大連)有限公司]試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)與低溫逆境相關(guān)的苦瓜差異表達(dá)基因引物，以McCYP(GeneBank 登錄號(hào):HQ171897)作為內(nèi)參基因，候選基因的引物序列見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-tirne PCR，qRTPCR)采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System(美國(guó))進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每次試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。反應(yīng)體系參照[Super Real Pre Mix Plus (SYBR Green)，天根生化科技有限公司)]試劑盒說明書進(jìn)行，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算[24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用Excel2016.1.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下苦瓜的表型與生理生化指標(biāo)變化

苦瓜經(jīng)低溫脅迫4 h 后，苦瓜的真葉就開始出現(xiàn)萎蔫失水的現(xiàn)象，這是植物受到低溫脅迫的典型反應(yīng)；低溫脅迫8 h 后，葉柄軟化、向下彎曲，未成熟莖出現(xiàn)更嚴(yán)重的萎蔫現(xiàn)象(圖1-A)。但在低溫脅迫12 h 后，又出現(xiàn)明顯的恢復(fù)現(xiàn)象，表明苦瓜43 號(hào)自交系具有良好的低溫耐受能力，適于作為本研究的材料。

圖1 低溫脅迫前后苦瓜表型變化和生理生化變化Fig.1 Phenotypic and physiological changes in cold-stressed bitter gourd

由圖1-B 可知，在經(jīng)過低溫脅迫后MDA 含量先升高后降低，在低溫脅迫8 和12 h 后，比0 h 分別增加了96.80%和60.34%，峰值約為對(duì)照的2 倍，說明此時(shí)苦瓜的細(xì)胞膜受到損傷導(dǎo)致MDA 含量增加，但在低溫脅迫12 h 后損傷有所恢復(fù)。由圖1-C 可知，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，Pro 含量整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在低溫脅迫4、8 和12 h 時(shí)，Pro 含量相比于對(duì)照分別提高了114.47%、125.20%和87.07%，這與MDA 含量的變化情況相一致。由圖1-D 可知，REC 隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)增加并保持在較高水平，在低溫脅迫4、8 和12 h 時(shí)，比對(duì)照分別增加了7.55、9.38 和12.47個(gè)百分點(diǎn)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)整體評(píng)估及差異表達(dá)基因的獲得

為深入探索苦瓜在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答，剪取8℃低溫條件下處理0 和12 h 的苦瓜葉片，采用Illumiana HiSeq2500 平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得1.77 Gb Clean Data，Q30 值均大于91.00%(表2)，GC含量均在48%的水平。Clean Data 經(jīng)過濾、拼接和組裝后獲得的Unigene 數(shù)量為89 757 條，N50 長(zhǎng)度為1 239 bp，平均長(zhǎng)度達(dá)到700.75 bp (表3)。Unigene序列數(shù)量最多的分布在200 ～300 bp 之間，在500 ～1 000 bp 之間次之(42.64%)，Unigene 長(zhǎng)度達(dá)到1 000 bp 以上的占18.2%以上，共計(jì)16 329 條。以上結(jié)果表明RNA-seq 結(jié)果符合下一步生物信息學(xué)分析的要求。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistic of evaluating the sequencing data

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistic of evaluating the sequencing data

將得到的Unigene 序列比對(duì)結(jié)果經(jīng)NR、KEGG等多個(gè)數(shù)據(jù)平臺(tái)得到對(duì)應(yīng)的注釋信息(表4)。在預(yù)設(shè)的E 值范圍最終有48 662 個(gè)注釋信息的Unigene，占全部Unigenes 的54.2%。比對(duì)得到的Unigene 長(zhǎng)度大于1 000 nt 的達(dá)到14 964 個(gè)，占所有得到注釋Unigene 的30.5%。但仍有41 095 個(gè)Unigenes 在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有得到注釋。通過對(duì)差異表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在低溫脅迫處理后共獲得1 285 個(gè)差異表達(dá)基因，其中916 個(gè)基因上調(diào)、369個(gè)基因下調(diào)。

表4 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistic of evaluating the sequencing data

2.3 差異表達(dá)基因GO 分類

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 聚類分析聚類，結(jié)果有1 495 條Unigenes 映射到GO 不同功能節(jié)點(diǎn)上，顯著富集主要包括在細(xì)胞組分、分子功能、生物過程中的50個(gè)亞類(圖2)。其中最大的主類群是參與生物學(xué)過程的差異表達(dá)基因，共有749 個(gè)；歸入細(xì)胞組分和分子功能類的分別為347 和399 個(gè)；細(xì)胞部分、細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)在細(xì)胞組分中是排名前三的亞類，分別為123、62 和46 個(gè)差異表達(dá)基因。在分子功能主類群，大多數(shù)的差異表達(dá)基因歸屬于催化活性(177 個(gè))和結(jié)合活性(149個(gè))。在生物學(xué)過程類群，由191 條Unigene 組成的代謝進(jìn)程是數(shù)量最多的亞類，其次是細(xì)胞過程(174 個(gè))和單一生物過程(134 個(gè))。生物過程分組中共富集到14 個(gè)GO 條目，差異基因所占比例較大的有代謝過程、細(xì)胞過程、單個(gè)有機(jī)體過程、應(yīng)激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)。在細(xì)胞組分分組中共富集到8 個(gè)GO 條目，差異表達(dá)基因所占比例較高的有細(xì)胞部分細(xì)胞、膜、細(xì)胞器、膜結(jié)構(gòu)。在分子功能分組中共富集11 個(gè)GO 條目，催化活性、結(jié)合活性占較大比例。這些大量積累的基因表明，苦瓜在遭受低溫脅迫過程中進(jìn)行著復(fù)雜的新陳代謝和酶促反應(yīng)。

2.4 差異表達(dá)基因的COG 分類

圖2 苦瓜轉(zhuǎn)錄組GO 功能分類Fig.2 Gene ontology classification of Momordica charantia L.transcriptome

將轉(zhuǎn)錄組獲得的差異表達(dá)基因與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)其所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類，進(jìn)一步預(yù)測(cè)基因功能并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)(表5)。共得到了239 個(gè)COG 功能注釋的信息，按其功能劃分為24 類，其中有3 類功能類型在本研究中無Unigene 比對(duì)。其中，僅一般功能預(yù)測(cè)(16.74%)和轉(zhuǎn)錄(10.04%)類所占的比例最大，隨后依次是次生代謝物合成，運(yùn)輸和代謝(9.62%)及重復(fù)，重組和修飾(8.79%)。

2.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因代謝途徑分析

將差異基因比對(duì)到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因注釋結(jié)果以進(jìn)一步探索基因功能(表6)。結(jié)果顯示共有237 個(gè)差異基因歸入94 種代謝路徑。其中參與核糖體代謝途徑的差異表達(dá)基因有19 個(gè)；其次有18 個(gè)差異表達(dá)Unigene 與苯丙素生物合成相關(guān)；與苯丙氨酸代謝路徑相關(guān)的差異表達(dá)基因占第三位；此外，參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)以及淀粉和糖類代謝途徑的差異表達(dá)基因均為11 個(gè)。與脯氨酸合成相關(guān)的精氨酸和脯氨酸代謝通路與低溫脅迫相關(guān)的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)通路放入差異表達(dá)基因分別獲得1 個(gè)和2 個(gè)。代謝途徑包含碳水化合物、信號(hào)傳導(dǎo)、光合等涉及生命活動(dòng)的各個(gè)階段，表明這些代謝途徑在苦瓜遭受低溫脅迫時(shí)可能發(fā)揮著重要作用。

2.6 苦瓜耐低溫相關(guān)差異表達(dá)候選基因

為了挖掘參與耐低溫脅迫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因，在差異表達(dá)基因中篩選到了包括WRKY、ERF/AP2(乙烯應(yīng)答)、ZAT轉(zhuǎn)錄因子等可能參與苦瓜耐低溫脅迫的10 個(gè)重要基因(表7)。10 個(gè)候選基因的序列和相似性分析見附表1。

2.7 qRT-PCR 分析

為了驗(yàn)證RNA-seq 數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性并進(jìn)一步分析苦瓜候選基因的耐低溫機(jī)制，對(duì)挑選出的10 個(gè)候選基因利用qRT-PCR 觀測(cè)低溫脅迫下動(dòng)態(tài)變化情況，結(jié)果如圖3 所示。WRKY33 的表達(dá)量在脅迫4 h 后急劇上升，8 h 時(shí)稍下調(diào)隨后又有所上升，但都始終高于對(duì)照(0 h)；MYB108 的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步上升趨勢(shì)；ERF017 的表達(dá)量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)；ERF021 和ERF053 的表達(dá)量在受到低溫脅迫4 h 時(shí)急劇上升，且均在低溫脅迫處理8 h 時(shí)達(dá)到峰值，在低溫脅迫處理12 h 時(shí)稍有下降但仍高于對(duì)照；NAC25 的表達(dá)量在受到低溫脅迫后下降，低溫脅迫處理8 h 表達(dá)量上升后又下調(diào)；Ga2＋ATPase和Ga2＋ATPase2 的表達(dá)量隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；ZAT11 和ZAT12的表達(dá)量在受到低溫脅迫后先上調(diào)后下降，且峰值均出現(xiàn)在低溫脅迫8 h，低溫脅迫12 h 時(shí)仍高于對(duì)照。所有基因的表達(dá)變化與RNA-seq 所得的變化情況一致，說明轉(zhuǎn)錄組結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。這些基因表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)也預(yù)示著它們?cè)诳喙夏偷蜏孛{迫中可能發(fā)揮著重要作用。

表5 差異表達(dá)基因的COG 注釋分類情況Table 5 Classification of COG annotation about DEGs

3 討論

苦瓜經(jīng)低溫脅迫后出現(xiàn)萎蔫失水的現(xiàn)象，隨后又明顯恢復(fù)，表明該苦瓜材料具有良好的低溫耐受能力。MDA 是評(píng)價(jià)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷程度的重要指標(biāo)，本研究中苦瓜受到一定程度的冷害后MDA 含量先升高后降低，說明植物損傷后逐漸得到恢復(fù)，這與在低溫脅迫下甜瓜不同品種間的耐低溫性與MDA 含量成顯著負(fù)相關(guān)的研究結(jié)果一致[10]。Pro 是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過提高細(xì)胞持水能力從而提高植物的耐低溫特性[1，25]。本研究中Pro 含量先上升后下降，說明在低溫脅迫前期，苦瓜體內(nèi)能夠快速促進(jìn)Pro含量的提升使植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)免受損傷。MDA 和Pro的變化情況與苦瓜的表型變化一致，說明苦瓜在低溫脅迫時(shí)可能刺激相關(guān)通路基因的表達(dá)以保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)不受損害。電解質(zhì)參透率能反映植物在逆境條件下細(xì)胞膜透性程度[1]。本研究中苦瓜葉片的電解質(zhì)參透率在低溫脅迫的過程中始終維持較高水平，表明低溫造成的膜損傷并沒有在12 h 內(nèi)得到完全修復(fù)。

表6 苦瓜部分差異表達(dá)Unigene 的代謝通路Table 6 Some metabolic pathways involving DEG of Momordica charantia L

表7 差異表達(dá)中耐低溫脅迫候選基因Table 7 Low temperature candidate gene of the DGEs

圖3 低溫脅迫下苦瓜候選基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of candidate gene under cold stress in Momordica charantia L.

通過對(duì)低溫脅迫條件下苦瓜葉片進(jìn)行RNA-seq分析，共獲得1 285 個(gè)差異表達(dá)基因，受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)目明顯多于低溫抑制的基因數(shù)目。差異表達(dá)基因GO 富集到的大量基因存在于代謝、催化活性和應(yīng)激反應(yīng)亞類中，表明苦瓜在低溫脅迫過程中進(jìn)行著復(fù)雜的新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)。差異表達(dá)基因歸類到物質(zhì)代謝、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用相關(guān)蛋白及植物晝夜節(jié)律等通路，表明苦瓜可能通過改變信號(hào)傳導(dǎo)、環(huán)境應(yīng)激及次級(jí)代謝物合成來參與低溫脅迫的響應(yīng)，這與黃瓜、番茄、葡萄通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究低溫響應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因的主要通路結(jié)果類似[7，26-27]。研究表明WRKY、MYB、AP2/ERF、ZAT和NAC這幾類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物低溫脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[28-30]。對(duì)篩選出表達(dá)量變化較為明顯的幾類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證并對(duì)這些基因在苦瓜低溫脅迫過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤，發(fā)現(xiàn)WRKY33 基因表達(dá)量先上調(diào)后下降隨后又上升，MYB108 表達(dá)量持續(xù)上升、ZAT11 和ZAT12 上調(diào)表達(dá)后下調(diào)，與前人研究結(jié)果也相一致[31]。ERF021 和ERF053 上調(diào)表達(dá)，之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，ERF017 表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先略下調(diào)后上調(diào)，這與Du 等[32]證實(shí)在冷脅迫后期大量ERF上調(diào)表達(dá)的研究結(jié)果一致。NAC25 表達(dá)量在低溫脅迫后劇烈下降，預(yù)示其可能負(fù)調(diào)控植物低溫應(yīng)答。Ca2＋作為第二信使在植物感應(yīng)外界逆境和信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要的作用，Ca2＋ATPase的功能研究證明該家族基因響應(yīng)各種逆境脅迫[33-34]，本研究Ca2＋ATPase基因表達(dá)受低溫誘導(dǎo)明顯，說明其可能在苦瓜應(yīng)對(duì)低溫逆境時(shí)發(fā)揮重要作用。qRT-PCR 和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)一致，具體的定量值有差異可能是機(jī)器或者不同批次處理植株中取樣引起的誤差，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果真實(shí)可信，基因表達(dá)和生理變化能夠相互印證。此外，發(fā)現(xiàn)脯氨酸合成、氧化磷酸化過程通路中3 個(gè)差異基因表達(dá)被激活，這與生理生化測(cè)試結(jié)果一致，可作為苦瓜耐低溫基因挖掘的補(bǔ)充資源。

由本研究結(jié)果推測(cè)在苦瓜耐低溫脅迫中Ca2＋作為信號(hào)分子激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，被激活的轉(zhuǎn)錄因子再調(diào)控下游功能基因的表達(dá)及修飾，減弱了低溫脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜產(chǎn)生的破壞，促使植物體內(nèi)失衡的活性氧和激素水平快速恢復(fù)，從而提高了植物的耐低溫性。本研究篩選出的候選基因可能參與苦瓜機(jī)體耐低溫脅迫過程，為下一步開展苦瓜耐低溫相關(guān)分子機(jī)制研究提供了一定的理論支持。

4 結(jié)論

本研究以耐低溫品種自交系43 號(hào)為材料對(duì)低溫冷脅迫下苦瓜進(jìn)行形態(tài)和相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定及分析，并對(duì)26、8℃處理下的苦瓜葉片進(jìn)行RNA-seq 獲得了豐富的轉(zhuǎn)錄本信息，對(duì)差異表達(dá)基因的基因功能進(jìn)行注釋，了解苦瓜葉片在低溫脅迫下生理變化過程，篩選出包括WRKY、NAC、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族候選基因，可能參與苦瓜機(jī)體耐低溫脅迫過程調(diào)控。10 個(gè)差異表達(dá)基因的qRT-PCR 動(dòng)態(tài)分析結(jié)果與RNA-seq 變化一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，基因表達(dá)變化和生理指標(biāo)的變化也一致。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)低溫脅迫下的苦瓜材料進(jìn)行測(cè)序，通過生物信息學(xué)方法對(duì)苦瓜耐低溫性的多種代謝途徑進(jìn)行分析，并從分子水平闡述了苦瓜低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究苦瓜耐低溫脅迫分子生物學(xué)研究功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

附表1: 10 個(gè)候選基因相似性比較結(jié)果Schedule 1: Similarity comparison results of 10 candidate genes