一個大麥突變體庫的構(gòu)建及其葉寬突變體的細(xì)胞學(xué)初步分析

秦丹丹 許甫超 徐 晴 彭嚴(yán)春 葛雙桃 董 靜 焦春海

(1湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北 武漢 430064；2 糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064)

突變體的創(chuàng)制、篩選和利用可以為種質(zhì)創(chuàng)新和育種提供有價值的基礎(chǔ)材料。上世紀(jì)20年代，美國科學(xué)家首次提出了通過離子輻射進(jìn)行誘變可以增加大麥的突變頻率，而且所獲得的突變可以穩(wěn)定遺傳給后代[1]，開啟了植物研究的新領(lǐng)域。

通過理化手段進(jìn)行誘變從而創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，可以提高基因交換和基因重組的頻率，并打破不利基因連鎖[2]，創(chuàng)造豐富的遺傳變異，拓寬原品種的遺傳基礎(chǔ)，緩解親本資源匱乏、遺傳基礎(chǔ)狹窄等問題，促進(jìn)品種遺傳改良和突破性品種的培育[3-4]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織和國際原子能機(jī)構(gòu)(FAO/IAEA)的數(shù)據(jù)庫，截止2020年10月24日，已有超過3 362 個作物新品種是通過誘變育種方法獲得的，其中80%左右是由物理誘變獲得的[5]。我國輻射誘變育種研究始于1956年，在培育新品種和創(chuàng)制新種質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用[6]。據(jù)不完全統(tǒng)計，截止2018年8月，我國利用誘變技術(shù)直接或間接育成和審定了1 033 個植物新品種，位列全球第一位，創(chuàng)造了巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。

隨著擬南芥、水稻等模式植物以及其他植物基因組測序的完成，植物的功能基因組學(xué)研究進(jìn)入了飛速發(fā)展階段。通過產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等相關(guān)突變體進(jìn)行調(diào)控基因的克隆則是獲得相關(guān)功能基因的重要途徑，如水稻矮稈基因Dwarf[7]、雄性不育基因MER3[8]、粒長基因GLA1[9]，玉米株型調(diào)控基因ZmACS7[10]，二倍體小麥的脆稈基因TmBr1[11]，小麥葉綠素和脂肪酸合成相關(guān)的鎂螯合酶基因等[12]，都是利用突變體克隆獲得的。這些研究為解析相關(guān)性狀形成的分子機(jī)理并通過分子育種的手段進(jìn)行目標(biāo)性狀的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

大麥(Hordeum vulgareL.)是全球也是我國第四大谷類作物，具有食用、飼用和釀造等多種用途。大麥一直是我國青藏高原地區(qū)最具優(yōu)勢的糧食作物之一[13]。隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高，大麥作為功能型食品，在預(yù)防和治療高血糖、高血壓等慢性病中的作用也逐漸被大眾認(rèn)知和接受[14]。但目前我國的大麥生產(chǎn)存在自給率低、對外依存度高等問題。根據(jù)海關(guān)數(shù)據(jù)，2019年1—11月，我國從加拿大、澳大利亞等大麥主要出口國進(jìn)口大麥596 萬t。因此，培育高產(chǎn)專用型大麥品種對加快我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程并改變大麥依賴進(jìn)口的局面，以及保障我國糧食安全具有重要意義。此外，大麥還具有早熟、耐寒、耐旱、耐鹽堿、耐瘠薄等特性，也是作物進(jìn)行遺傳改良的重要基因來源[15]。大麥和小麥在基因組成及排列順序上存在較高的保守性，且二者在農(nóng)藝、產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀方面也具有很高的相似性，但基因組只有小麥的1/3，因此在基礎(chǔ)研究中，大麥常被作為小麥的模式植物進(jìn)行研究[16]。

目前，通過甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate，EMS)誘變構(gòu)建了二棱大麥Optic[17]和Barke[18]的突變?nèi)后w，利用疊氮化鈉構(gòu)建了Morex[19]和Lux[20]的突變體庫。我國科學(xué)家利用EMS 構(gòu)建了自育大麥品種浙農(nóng)大3 號[21]和國外引進(jìn)種質(zhì)Tamalpais[22]的突變體庫。突變體在大麥重要功能基因的克隆中也發(fā)揮了舉足輕重的作用，如大麥淀粉合成相關(guān)基因Fra[23]、分蘗和葉形調(diào)控基因HvHNT1[24]等，都是利用突變體通過圖位克隆的方法獲得的。通過誘變處理獲得的特殊種質(zhì)，為克隆目標(biāo)性狀調(diào)控基因奠定了基礎(chǔ)，如從北青7號突變體庫中篩選的穗分枝突變體[25]，從浙農(nóng)大3 號中篩選的蠟粉缺失突變體P1[26]等。但是，上述突變體庫均采用單一誘變方法，所獲得的突變類型有限，而且利用自育大麥品種構(gòu)建突變體庫的報道相對較少。

為構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的大麥突變體庫，本研究通過60Co-γ 射線輻射和EMS 復(fù)合誘變，構(gòu)建了自育品種鄂大麥934 的突變體庫，并對葉寬突變體的葉片細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察，旨在為大麥種質(zhì)資源創(chuàng)新以及重要性狀調(diào)控基因的克隆和形成機(jī)理解析提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鄂大麥934 是由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育的糧草兼用型大麥品種，于2014年通過湖北省品種審(認(rèn))定(鄂審麥2014003)，并于2018年進(jìn)行了國家非主要農(nóng)作物品種登記[GPD 大麥(青稞)(2018)420016]，品種權(quán)號CNA20151702.8。根據(jù)湖北省大麥區(qū)域試驗(yàn)結(jié)果，鄂大麥934 屬二棱皮大麥，株型較緊湊，幼苗半匍匐生長，分蘗力較強(qiáng)，生育期184 d，株高80.8 cm，穗粒數(shù)24.6 粒，千粒重39.3 g。

1.2 材料種植及處理方法

1.2.1 材料種植 本試驗(yàn)所有材料均種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所核心試驗(yàn)田(湖北，武昌)。材料的田間種植、性狀記載及成熟后收獲均在大麥正常生長季內(nèi)完成，田間栽培管理措施同當(dāng)?shù)?、?dāng)季常規(guī)種植大麥。

1.2.2 材料處理 2012年夏正常收獲的鄂大麥934種子，及時晾干和脫粒。挑選大小均勻一致、健康無病害的鄂大麥934 飽滿種子1.5 kg。首先利用總劑量為320 Gy 的60Co-γ 射線輻射處理39 min(劑量率為1.92～26.00 Gy·min-1)(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心)。然后將處理后的種子在室溫下浸泡1 h 后用1%EMS(v/v，美國Sigma 公司)溶液浸泡，并置于搖床上輕微晃動，確保溶液和種子充分接觸。處理8 h 后用自來水沖洗3 h，除去胚上殘留的EMS，并在通風(fēng)處進(jìn)行短時間晾干。

1.2.3 發(fā)芽率和發(fā)芽勢 統(tǒng)計經(jīng)誘變處理和未經(jīng)處理(對照)的種子各100 粒，均勻擺放在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為22℃/18℃，光照時間為12 h。培養(yǎng)期間及時補(bǔ)充水分，保證濾紙?zhí)幱跐駶櫊顟B(tài)，7 d 后統(tǒng)計發(fā)芽率、苗高、根數(shù)和主根長。

1.3 突變體鑒定

取誘變處理后的M0種子15 000 粒進(jìn)行點(diǎn)播，行長3.0 m，行距25 cm，株距5 cm，每50 行種植1 行未經(jīng)處理的鄂大麥934 作為對照。成活M1植株進(jìn)行性狀初步調(diào)查，挑選與對照表現(xiàn)不同的單株按單株收獲，剩余單株收獲單穗。將收獲的單株和單穗，每株或每穗取1 粒種子混合點(diǎn)播成M2群體，種植方法同上。對成活單株進(jìn)行全生育期調(diào)查，選擇在株高、株型、生育期、葉型、葉色、穗長、穗度、穗型、粒形、結(jié)實(shí)率等性狀中至少有一個與對照表現(xiàn)不同的單株，掛牌并及時收獲、晾曬和保存。將M2收獲的單株種植成株行并調(diào)查，選擇至少有一個性狀與對照表現(xiàn)不同的株行，從中挑選典型單株掛牌和收獲，行內(nèi)表現(xiàn)為分離的株行則分別掛牌和收獲。對收獲單株繼續(xù)種植，并對目標(biāo)性狀提純，直至獲得行內(nèi)純合的株行，按行收獲。

1.4 葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察

挑選葉寬與野生型相比有顯著差異的突變體3 個(葉細(xì)1 個，葉寬2 個)，與野生型一起，剪取抽穗期旗葉，通過番紅-固綠法觀察并比較葉片細(xì)胞大小和形態(tài)等變化。該試驗(yàn)由武漢谷歌生物科技有限公司協(xié)助完成，具體步驟參照公司說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變后種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢

為了明確所實(shí)施的60Co-γ 和EMS 復(fù)合誘變處理對大麥種子活力的影響，對經(jīng)處理和未經(jīng)處理(對照)的鄂大麥934 種子7 d 發(fā)芽率及生長勢進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，經(jīng)處理的種子發(fā)芽率顯著降低，幼苗和主根生長明顯受到抑制，但是根數(shù)變化不大(表1)。

表1 誘變處理后種子性狀測定Table 1 Seed traits of control and treatment

2.2 突變體庫性狀調(diào)查

將處理后的15 000 粒M0種子種植后，除誘變處理對種子本身發(fā)芽率產(chǎn)生了較大影響外，部分出苗后的植株因?yàn)榘谆蛘咂渌蛩劳觯婊畈⒆罱K可正常收獲的M1植株共8 432 株。存活植株中，有部分在M1即表現(xiàn)出與對照不同的性狀。對這些變異單株掛牌、統(tǒng)計和收獲，共計收獲405 株(部分植株可能表現(xiàn)為多重性狀)。其中涉及株高變異的67 株、株型14株、生育期50 株、葉片大小36 株、葉片形狀8 株、葉片顏色10 株、穗寬12 株、穗長43 株、穗分枝形態(tài)4 株、粒形60 株、育性降低120 株。其他單株每株收獲1穗。從以上收獲的單株和單穗上各取1 粒種子混合播種，并進(jìn)行多輪篩選，最終獲得與對照存在明顯差異且性狀無分離、可遺傳的變異株982 株，性狀涉及葉片、莖稈、穗部、籽粒、生育期和結(jié)實(shí)率等。有些突變體表現(xiàn)為相同或相似的性狀，也有些突變體表現(xiàn)為多重性狀突變。

2.2.1 葉片性狀突變體 本研究所獲得的葉片性狀變異主要涉及葉片形狀、葉片顏色以及葉片與莖稈夾角。葉片形狀變異包括葉長、葉寬、葉厚、圓葉、卷葉、早衰、皺縮等(圖1)。野生型鄂大麥934 抽穗期的旗葉平均長度為15.9 cm，寬度為1.4 cm。對突變?nèi)后w中各材料進(jìn)行測量發(fā)現(xiàn)，旗葉長度變異在8.64 ～23.30 cm 之間，寬度變異在0.56～2.20 cm 之間(圖1-b)。

葉片顏色變異主要表現(xiàn)為葉色深、葉色淺、葉片金黃色、白色、條紋白、灰綠色、銹狀斑點(diǎn)、燙傷狀枯死等(圖1-c～f)。這些葉片顏色變異通常從苗期即開始表現(xiàn)，貫穿整個生育周期，有的則可以在后期轉(zhuǎn)為正常葉色，如白色葉片突變體。

根據(jù)葉片與莖稈夾角是大還是小，相應(yīng)的表現(xiàn)即為葉披或者葉挺。本研究發(fā)現(xiàn)了兩種極端類型的葉夾角突變體，其中一種旗葉較為直立，與莖稈夾角約為20°(圖1-g)，另外一種旗葉在穗子完全抽出前即已下垂，與莖稈的夾角接近180°(圖1-h)。

其他類型的葉片變異還包括葉片早衰，并鑒定出一種特殊的葉片變異，表現(xiàn)為旗葉正常，但是穗子基部還包圍著一層苞葉狀葉片(圖3-i)。

2.2.2 莖稈性狀突變體 莖稈性狀涉及株高、莖粗細(xì)、莖稈顏色、莖稈節(jié)數(shù)、莖稈蠟質(zhì)、分蘗、株型等(圖2)。本研究中，鄂大麥934 的平均株高為84 cm，所發(fā)現(xiàn)的莖稈長度突變體株高變異范圍較廣，在30 ～103 cm 之間(圖2-a)。此外還發(fā)現(xiàn)一種表現(xiàn)為莖稈節(jié)數(shù)增多但株高變矮的突變類型，該突變體莖稈平均節(jié)數(shù)可達(dá)10 節(jié)，較野生型的5 節(jié)顯著(P＜0.05)增多，但是株高只有40 cm，不足野生型的50%(2-b)。

蠟質(zhì)合成與植物的抗逆性密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)的蠟質(zhì)合成突變體，莖稈表現(xiàn)為完全無蠟，呈翠綠色(圖2-c)。2019—2020年度田間觀察發(fā)現(xiàn)，該突變體葉片和莖稈上出現(xiàn)了嚴(yán)重的、不同于銹病的銹狀斑點(diǎn)，但正季播種的同一突變體未觀察到這一性狀。在所鑒定的突變體中，還有一株表現(xiàn)為莖稈紫色(圖2-d)。

野生型的鄂大麥934 具有很強(qiáng)的分蘗能力，可以形成10 個以上的分蘗。在包含有982 個突變體的群體中，共檢測到43 株表現(xiàn)為分蘗增多(圖2-e)，分蘗可超過50 個。但多數(shù)分蘗增多的突變體，還伴隨著莖稈變細(xì)、穗子變小、千粒重降低等性狀。此外，還有植株表現(xiàn)為分蘗變少，只能形成1～3 個分蘗。

株型一直是大麥育種家所關(guān)注的重要性狀之一，本研究也發(fā)現(xiàn)了株型發(fā)生改變的突變類型，包括緊湊型、分散型和叢生等(圖2-f、g)。

此外，抗倒性是大麥極為重要的育種目標(biāo)之一，莖稈粗度通常被認(rèn)為是影響植株抗倒伏能力的重要因素。成熟的鄂大麥934 莖稈直徑平均為3 mm，本研究發(fā)現(xiàn)的莖稈粗細(xì)突變體中，莖稈直徑變異在2 ～4 mm之間(圖2-h)。

圖1 葉片顏色和形態(tài)突變體Fig.1 Leaf color and morphology mutation

圖2 莖稈性狀突變Fig.2 Stem traits mutation

2.2.3 穗部性狀突變體 在所鑒定的突變體中，穗長和穗寬均表現(xiàn)出較大變異。鄂大麥934 的平均穗長為8.5 cm(圖3-a、b)，突變?nèi)后w中，穗長(不含芒)變異在5.3～10.4 cm 之間(圖3-b)。芒是野生大麥種子得以在大自然中傳播的重要器官，也是生長后期植株進(jìn)行光合作用的場所之一。本研究所鑒定的突變體中，芒長也表現(xiàn)出較大變異。其中，鄂大麥934 為長芒大麥，但在突變?nèi)后w中發(fā)現(xiàn)了短芒、無芒等變異類型(圖3-c、d)；還有一個突變株系頂部小穗為白色且不育，頂芒也為白色(3-e)，且該性狀穩(wěn)定可遺傳。

鄂大麥934 為二棱大麥，本研究鑒定出了多種其他棱型的突變體，包括側(cè)小穗部分退化成圓點(diǎn)狀、分枝穗、絨狀花穗等(圖3-f、g、h)。此外，上述提到的多節(jié)矮化突變穗部性狀也與野生型不同，表現(xiàn)為同一分蘗上的多個節(jié)上均著生有穗子，而且最頂端穗子的基部還可以分化出多個小穗(圖3-j)。此外，還發(fā)現(xiàn)一個突變體株系開花期花藥外露(圖3-k)，以及一株穗柄扭曲(圖3-l)。

圖3 穗部性狀突變體Fig.3 Spike morphology mutation

2.2.4 籽粒性狀突變體 本研究所發(fā)現(xiàn)的籽粒性狀變異主要表現(xiàn)在籽粒大小、籽粒形狀和籽粒飽滿度方面(圖4)，還有些突變體籽粒表現(xiàn)為黑胚。其中，籽粒大小突變體主要表現(xiàn)為籽粒變短(圖4-a)或者變細(xì)，籽粒形狀突變體主要表現(xiàn)為籽粒變圓(圖4-b)。

2.2.5 其他發(fā)育性狀突變體 根據(jù)湖北省大麥區(qū)域試驗(yàn)結(jié)果，鄂大麥934 生育期為184 d。本研究發(fā)現(xiàn)的生育期發(fā)生改變的突變體中，抽穗期最早和最晚的分別較同期種植的鄂大麥934 早和晚約20 d。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了雄性不育和結(jié)實(shí)率下降的突變體(圖5-a)，該雄性不育突變體穎殼蓬松發(fā)亮，花藥發(fā)育異常(圖5-b)。

2.3 葉寬突變體葉片細(xì)胞顯微觀察

葉片是植物進(jìn)行光合作用最重要的器官，在一定程度上決定了植物的最終產(chǎn)量。為了進(jìn)一步分析本研究所獲得的葉寬突變體形成的原因，分別挑選了1 個葉寬變細(xì)和2 個葉寬變寬的突變體，觀察旗葉的葉片細(xì)胞并與同期野生型葉片(圖6-a)進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些葉寬突變體在細(xì)胞水平上表現(xiàn)各不相同。葉細(xì)突變體(圖6-b)上表皮細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則狀，且相鄰葉脈之間的距離較野生型變大，而葉寬突變體(圖6-c)相鄰葉脈間的細(xì)胞數(shù)目與野生型相同，但細(xì)胞變小，因此導(dǎo)致相鄰葉脈間的距離變短，另一葉寬突變體(圖6-d)上表皮細(xì)胞較野生型變大，但相鄰葉脈間的細(xì)胞數(shù)目減少，最終導(dǎo)致相鄰葉脈間距離與野生型差異不明顯。

3 討論

構(gòu)建有效的突變體庫不僅是鑒定基因功能并進(jìn)一步解析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效途徑，而且對作物品種遺傳改良及拓寬遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。獲得突變體的方法包括自發(fā)突變、理化誘變和插入突變。由于自發(fā)誘變的通量有限，而插入突變對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的依賴性較強(qiáng)，因此理化誘變成為應(yīng)用最廣泛的方法。目前，包括大麥在內(nèi)的突變庫構(gòu)建大多是采用單一的物理或者化學(xué)誘變方法。如通過EMS 誘變所構(gòu)建的浙農(nóng)大3號突變體庫，共包含81 株穩(wěn)定可遺傳的突變株系，表型變異率約為7.46%[21]；通過不同劑量7Li 離子束誘變獲得的粒型、品質(zhì)等變異株[27]；也有少數(shù)通過理化復(fù)合處理對小麥[28]和大麥[29]進(jìn)行誘變的報道。這些研究均發(fā)現(xiàn)復(fù)合處理對植株的影響大于單獨(dú)處理。在大麥中，不同基因型所能承受的誘變強(qiáng)度差異較大，如利用總劑量為1 500 Gy(劑量率1 Gy·min-1)60Co-γ 處理浙秀2 號，發(fā)芽率仍可達(dá)70.3%，較對照(83.1%)只減少12.8 個百分點(diǎn)[30]，而僅300 Gy(6.25 Gy·min-1)的60Co-γ 處理對昆侖15 號的株高、莖粗等性狀就可產(chǎn)生顯著影響[31]。為了最大限度地對大麥基因進(jìn)行突變，構(gòu)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的大麥飽和突變體庫，本研究選用自育品種鄂大麥934，利用總劑量320 Gy的60Co-γ 和1% EMS 對其進(jìn)行復(fù)合處理。

圖4 籽粒形狀突變體Fig.4 Seed shape mutation

圖5 雄性不育突變Fig.5 Male sterile mutation

圖6 葉寬突變體的細(xì)胞顯微觀察Fig.6 Microscopic analysis of cells of leaf width mutation

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合處理引起鄂大麥934 發(fā)芽率降低了43 個百分點(diǎn)，說明本研究中所采取的320 Gy的60Co-γ 射線和8 h 的1% EMS 為該品種半致死劑量，可以作為進(jìn)行大麥復(fù)合誘變處理的參考劑量。在篩選過程中發(fā)現(xiàn)，有些突變株系在早代出現(xiàn)了性狀分離，對這些單株分別進(jìn)行了收獲和統(tǒng)計，但由于未對根系、品質(zhì)、抗逆性等性狀進(jìn)行考察，故沒有對突變率進(jìn)行統(tǒng)計。最終篩選出982 株在葉片、莖稈、穗部、籽粒、生育期、育性等性狀發(fā)生了明顯可穩(wěn)定遺傳的突變株系。

本研究所鑒定的突變類型中，有些性狀研究較多，如葉色淺、分蘗性、株型、分枝穗和蠟質(zhì)合成[16，23，25，32]等，雖然所用材料不同，但在后續(xù)研究中，仍需對相關(guān)突變體進(jìn)行等位性檢測，排除與其他研究重復(fù)或者相似的突變株系。有些性狀則研究較少，如一蘗多穗、點(diǎn)狀側(cè)小穗等(圖3)。此外，有些自然界中存在的性狀，或者其他研究中所出現(xiàn)的變異類型，在本研究中未出現(xiàn)，如六棱大麥[33]、粒色變異[34]、皮裸性變異[16]等。鄂大麥934 為二棱大麥，在突變體庫中，沒有發(fā)現(xiàn)六棱的突變株系，但是發(fā)現(xiàn)了其他不規(guī)則棱形的突變體(圖3)。這些性狀的調(diào)控基因可能為已報道的棱形調(diào)控基因的等位基因，也有可能是新的基因，需要進(jìn)一步研究明確。

通過多年觀察發(fā)現(xiàn)，本研究所鑒定的蠟質(zhì)合成突變體在不同的環(huán)境下種植出現(xiàn)了新的性狀，初步推測該性狀可能與環(huán)境濕度有關(guān)。這種現(xiàn)象在其他類型的突變體中也有報道，如通過X 射線誘變獲得的大麥突變體mnd，在田間種植時表現(xiàn)為莖稈節(jié)數(shù)增多、株高變矮，但是在溫室種植時表現(xiàn)正常[35]。因此，為了全面認(rèn)識所鑒定的突變體，還需要對重點(diǎn)突變體進(jìn)行多年多點(diǎn)和多環(huán)境觀察，為深入解析這些性狀形成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

高生物產(chǎn)量一直是包括大麥在內(nèi)的飼草品種選育的重要目標(biāo)之一，大葉是增加生物產(chǎn)量的有效途徑[36]。本研究所構(gòu)建的突變?nèi)后w中，葉長和葉寬變異豐富(圖1-b)。了解它們形成的原因是應(yīng)用這些性狀的基礎(chǔ)。本研究對所鑒定的葉寬突變體的旗葉進(jìn)行了細(xì)胞觀察，發(fā)現(xiàn)不同類型甚至相同類型的突變體在細(xì)胞水平上表現(xiàn)各不相同，如葉細(xì)突變體的異常不僅體現(xiàn)在細(xì)胞形狀的異常，而且相鄰葉脈間的間隔也與野生型不同。同為葉片變寬的突變體，有的細(xì)胞大小沒有發(fā)生改變，有的細(xì)胞大小則發(fā)生了改變。這些葉寬突變體在細(xì)胞水平上表現(xiàn)差異暗示這些性狀可能由不同基因調(diào)控。如在大麥中，棱形調(diào)控基因VRS1 突變導(dǎo)致的葉片變寬是由葉脈數(shù)目增加引起的[37]，而PHOTOPERIOD-H1 則主要通過影響細(xì)胞數(shù)目來調(diào)控葉片大小[38]。

多數(shù)研究認(rèn)為通過理化誘變獲得的突變多為隱性突變，M1所獲得的變異在M2中不能穩(wěn)定存在[39]，所以在M1通常不進(jìn)行選擇。但是本研究在M1即收獲了405 株初選突變體，在這些初選突變體中，約1/3 表現(xiàn)為高度不結(jié)實(shí)，還有的在下季種植過程中與對照無顯著差異，最終保留982 株，其中約10%來源于405 株初選突變體。這說明通過理化誘變也可以獲得顯性突變，這種現(xiàn)象在小麥中也有報道[40]。

通常認(rèn)為物理誘變會引起DNA 片段丟失、異位或者倒位，而EMS 化學(xué)誘變往往產(chǎn)生點(diǎn)突變。本研究所鑒定的突變體是通過理化復(fù)合誘變產(chǎn)生的，因此不能確定所表現(xiàn)出來的性狀變異是由一種還是兩種誘變方式引起的。但是，本研究利用幾個突變體構(gòu)建了分離群體，性狀涉及葉色、棱型和莖稈節(jié)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這幾個性狀均由單隱性基因調(diào)控。如金黃葉色(圖1-c)性狀，利用集團(tuán)分離分析(bulked segregant analysis，BSA)法成功將該基因定位在大麥基因組上約12.7 cM 的區(qū)間內(nèi)，為該基因的精細(xì)定位和克隆奠定了基礎(chǔ)[41]。在其他研究中也有通過物理誘變獲得單基因突變體的報道，如通過γ 射線處理大麥品種Vlamingh所獲得的多分蘗突變體[24]和經(jīng)60Co 輻射誘變所獲得的彎稈矮生性狀調(diào)控基因[42]，都是由單隱性基因調(diào)控的質(zhì)量性狀。

構(gòu)建突變體庫的最終目的是利用這些突變體及其調(diào)控基因進(jìn)行新品種的培育，并服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。如上世紀(jì)60年代，捷克利用核輻射誘變育成的矮稈高產(chǎn)大麥突變品種Diamant，不僅被直接推廣利用至歐洲各國，而且被作為核心親本加以利用，先后培育出150 余個具有Diamant 血統(tǒng)的優(yōu)良品種并推廣至歐洲、北美和亞洲各國，種植面積占全歐洲大麥面積的54.6%[43]。本研究所鑒定的直立株型、粗莖稈型、大葉型、大穗型、大粒型等包含有利性狀的突變體，都可作為育種過程中的重要親本資源加以應(yīng)用。而對這些性狀的調(diào)控基因進(jìn)行克隆和功能鑒定也將是未來工作的重點(diǎn)。此外，還需對各突變體的根部性狀、品質(zhì)性狀以及抗逆性等進(jìn)行評價，從而篩選優(yōu)異種質(zhì)并加以利用。

4 結(jié)論

本研究采用60Co-γ 和EMS 復(fù)合誘變方法構(gòu)建了自育大麥品種鄂大麥934 的突變體庫，共鑒定了982株性狀穩(wěn)定且可遺傳的突變株系，突變類型豐富，涉及葉片、莖稈、穗部、籽粒、發(fā)育等多個性狀。對葉寬突變體的旗葉細(xì)胞大小進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，各株系的細(xì)胞大小和形態(tài)呈現(xiàn)各不相同的變異類型。本研究結(jié)果為大麥功能基因組學(xué)研究及新品種選育提供了重要資源。