環(huán)狀RNA及其在生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

王瑞,李亮

1.南通大學(xué)學(xué)工處, 江蘇 南通 226019;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

人口的快速增長(zhǎng)和技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致了無(wú)數(shù)的污染物和環(huán)境毒素的暴露，數(shù)以千計(jì)的人工合成化合物被創(chuàng)造出來(lái)用于工業(yè)，并隨后被引入到日常消費(fèi)產(chǎn)品中，包括藥品(如抗生素)、農(nóng)藥、獸藥、食品及飼料添加劑、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、阻燃劑等。據(jù)估計(jì)，市場(chǎng)上約有8萬(wàn)種化學(xué)品[1]，而且每年都有新合成的化學(xué)品被大量生產(chǎn)并釋放到環(huán)境中，它們?cè)诃h(huán)境中的降解、蓄積、遷移和轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成威脅。監(jiān)測(cè)污染物在環(huán)境中的遷移和轉(zhuǎn)化及其對(duì)人類和生態(tài)系統(tǒng)健康的影響是生態(tài)毒理學(xué)的研究重點(diǎn)，而敏感、有效的生物標(biāo)志物對(duì)生態(tài)毒理學(xué)研究和環(huán)境危險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義。生態(tài)毒理范疇的生物標(biāo)志物是經(jīng)外源化學(xué)物質(zhì)暴露或影響后生物體生理、生化或組織學(xué)發(fā)生變化的指標(biāo)，可用于闡明生物暴露和產(chǎn)生生物效應(yīng)的信息[2]。目前，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization，ISO)、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)、美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局(United States Environmental Protection Agency，US EPA)、美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society of Testing Materials，ASTM)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)以及我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中用于評(píng)價(jià)毒性效應(yīng)的方法側(cè)重于測(cè)量生理生化生物標(biāo)志物，觀察表型改變、形態(tài)學(xué)指標(biāo)、致死和非致死效應(yīng)、生殖和生長(zhǎng)率及死亡率等毒性終點(diǎn)。如一些研究報(bào)道了暴露在草甘膦、內(nèi)分泌干擾物和甲基叔丁基醚中的魚類，胚胎畸形、幼魚骨骼及軟組織異常、幼魚出血的發(fā)生率和死亡率增加[3-5]；也有研究顯示來(lái)自多氯聯(lián)苯和二噁英類化合物污染地區(qū)的雀形目鳥類心臟畸形，且繁殖率受到影響[6]。與這些終點(diǎn)相比，在分子水平上評(píng)價(jià)毒性終點(diǎn)呈現(xiàn)出特定的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兛梢栽诟叩纳硭匠霈F(xiàn)毒性效應(yīng)之前被檢測(cè)到，為研究人員提供早期的毒性預(yù)警。分子生物學(xué)的發(fā)展正在將生物標(biāo)志物擴(kuò)展到基因水平，作為污染物暴露和毒性效應(yīng)的早期預(yù)警指標(biāo)，分子生物標(biāo)志物因具有特異性、預(yù)警性和廣泛性等特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，并已成為國(guó)內(nèi)外生態(tài)毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[7]。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳信息表達(dá)中，RNA水平上的調(diào)控精密而復(fù)雜，且具有時(shí)空特異性[8-9]，在生命科學(xué)領(lǐng)域“RNA世界假說(shuō)”也被普遍認(rèn)同[10]。近年來(lái)，非編碼RNA成為研究熱點(diǎn)，真核生物細(xì)胞中存在多種非編碼RNA，如環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)、小RNA(microRNAs，miRNAs)、小核RNA(small nuclear RNAs，snRNAs)、Piwi相互作用的RNAs(piwi-interacting RNAs，piRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)等[11]。其中，circRNAs是一種內(nèi)源性非編碼RNA(non-coding RNAs)，在不同物種、不同發(fā)育階段和不同病理狀態(tài)下差異表達(dá)。早在20世紀(jì)70年代，Sanger等[12]就在類病毒中發(fā)現(xiàn)了單鏈、共價(jià)閉合的circRNAs分子，并且Hsu和Coca-Prados[13]在電子顯微鏡下觀察到了沒(méi)有自由末端的circRNAs，但早期研究只是證明了這些circRNAs分子的存在，并未充分認(rèn)識(shí)其潛在的生物學(xué)影響。隨著RNA-seq技術(shù)的發(fā)展以及專門的生物信息學(xué)計(jì)算管道開(kāi)發(fā)，開(kāi)啟了circRNAs爆發(fā)式的研究[11,14-15]。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs與許多疾病密切相關(guān)，如癌癥[16-18]、心腦血管疾病[19-21]、糖尿病[22-24]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[25-27]等，由于circRNAs沒(méi)有游離端，與線性轉(zhuǎn)錄本相比穩(wěn)定性更高，使它們成為臨床診斷生物標(biāo)志物和治療干預(yù)的理想候選者。此外，近期在生態(tài)毒理學(xué)研究相關(guān)的模式生物中陸續(xù)鑒定出circRNAs，如小鼠(Musmusculus)[15]、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)[15,28]、黑腹果蠅(Drosophila)[29-30]、斑馬魚(Daniorerio)[31-32]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[33-34]、水稻(Oryzasativa)[35]等，且經(jīng)環(huán)境污染物暴露的生物體內(nèi)circRNAs表達(dá)水平出現(xiàn)差異，提示circRNAs也有在生態(tài)毒理學(xué)研究中作為生物標(biāo)志物的可能性?；诖?，本文對(duì)circRNAs的生物合成與降解、生物學(xué)功能、分析方法及其目前在生態(tài)毒理學(xué)相關(guān)模式生物中的研究進(jìn)行梳理概述，探討circRNAs作為新型環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的潛能，以期為生態(tài)毒理學(xué)研究和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 CircRNAs的生物合成與降解

1.1 CircRNAs的生物合成

CircRNAs是由pre-mRNAs成熟過(guò)程中發(fā)生的剪接事件產(chǎn)生的，可來(lái)自外顯子(exonic circular RNAs，ecircRNAs)、內(nèi)含子(circular intronic RNAs，ciRNAs)、外顯子-內(nèi)含子(exon-intron circular RNAs，EIciRNAs)。當(dāng)下游的5′端剪接位點(diǎn)(供體位點(diǎn))反向連接到上游3′端剪接位點(diǎn)(受體位點(diǎn))時(shí)形成包含外顯子的套索，外顯子發(fā)生反向剪接和環(huán)化，從而形成ecircRNA或EIciRNA(圖1a)[36]。基于外顯子兩側(cè)內(nèi)含子中反向重復(fù)互補(bǔ)序列(如Alu重復(fù)序列)配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化過(guò)程，形成ecircRNA或EIciRNA(圖1b)[37]。RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)二聚化促使上游和下游內(nèi)含子之間形成“橋梁”，然后反向剪接形成ecircRNA或EIciRNA(圖1c)[38]。ciRNA在細(xì)胞核中含量豐富，它們參與親本基因的表達(dá)調(diào)控，形成機(jī)制是由靠近5′端剪接位點(diǎn)附近富含GU的7個(gè)堿基元件和鄰近的分支剪接位點(diǎn)富含C的11個(gè)堿基元件共同作用。在反剪接過(guò)程中，這2個(gè)元件結(jié)合成一個(gè)包含切除的外顯子和內(nèi)含子的套索中間產(chǎn)物，被剪接體切斷形成ciRNA(圖1d)[39]。ecircRNAs還可能由成熟的mRNA外顯子經(jīng)過(guò)反向剪接環(huán)化形成(圖1e)[40]。在古生菌和果蠅中還發(fā)現(xiàn)了一種特殊的tricRNAs(tRNA intronic circRNAs)，是通過(guò)tRNA剪接酶剪接Pre-tRNA內(nèi)含子而形成的，一部分由3′-5′磷酸二酯鍵生成tricRNAs，另一部分生成tRNA(圖1f)[41-42]。

圖1 CircRNAs的形成Fig.1 The formation of CircRNAs

1.2 CircRNAs的降解

由于circRNAs沒(méi)有游離末端，對(duì)核糖核酸酶R不敏感，因此不能通過(guò)典型的RNA降解途徑降解。體外實(shí)驗(yàn)研究證明，大多數(shù)circRNAs的半衰期(18.8～23.7 h)都長(zhǎng)于其線性對(duì)應(yīng)物的半衰期(4.0～7.4 h)[43]。最具特征性的circRNAs降解途徑是miRNAs介導(dǎo)的降解，迄今為止唯一的例子是miR-671對(duì)ciRS-7的降解，ciRS-7也稱為小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 anti-sense，CDR1as)，miR-671以AGO2(Argonaute 2)依賴的方式內(nèi)切CDR1as，直接調(diào)節(jié)CDR1as的量，CDR1as中miR-671的結(jié)合位點(diǎn)高度保守[14]，該位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致CDR1as水平顯著增加[44]。RNA的N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修飾也具有潛在的circRNAs降解作用。m6A修飾廣泛存在于circRNAs中[45]，Park等[46]研究發(fā)現(xiàn)，RNA的m6A修飾可促進(jìn)招募具有circRNAs降解潛能的核酸內(nèi)切酶。還有研究顯示HeLa細(xì)胞被聚肌胞苷酸[poly(I∶C)]刺激或腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)感染后出現(xiàn)circRNAs的降解現(xiàn)象[47]。另外，胞吐作用也可以將circRNAs從細(xì)胞中清除[48]。

2 CircRNAs的生物學(xué)功能

2.1 作為miRNAs海綿

研究發(fā)現(xiàn)有些circRNAs含有多個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)circRNAs可以作為吸附miRNAs的海綿，抑制miRNAs對(duì)靶基因的作用。如CDR1as有73個(gè)miR-7的結(jié)合位點(diǎn)[14]，Piwecka等[49]發(fā)現(xiàn)在CDR1as基因敲除小鼠腦中，miR-7的表達(dá)量平緩但顯著降低，同時(shí)miR-7的直接靶基因Fos表達(dá)量增強(qiáng)。睪丸特異性circ-SRY中含有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn)，可以抑制miR-138在細(xì)胞中的表達(dá)量[14]。CircHIPK3也被證實(shí)能與9種miRNAs(miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654)相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)[50]。最近有研究證明circ-ITCH通過(guò)吸附miR-17和miR-224，上調(diào)p21和PTEN的表達(dá)，從而抑制膀胱癌病情的發(fā)展[51]。

2.2 與RBPs互作

circRNAs還能與RBPs共同作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯和細(xì)胞周期。HuR是一種被廣泛研究的RBPs，可以與多種RNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)，CircPABPN1能抑制HuR與核多聚腺苷酸結(jié)合蛋白[poly(A) binding protein nuclear1，PABPN1] mRNA的結(jié)合，從而降低了PABPN1的表達(dá)[52]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟成纖維細(xì)胞中，circ-Foxo3通過(guò)與p21和周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)結(jié)合，形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元復(fù)合物，抑制了CDK2的活性，進(jìn)而延緩了細(xì)胞周期進(jìn)程[53]。

2.3 翻譯為蛋白質(zhì)

由于circRNAs缺少翻譯所需要的起始元件5′端帽子結(jié)構(gòu)和3′端的poly(A)尾部，所以被認(rèn)為不具有編碼蛋白質(zhì)的能力。但是早在20世紀(jì)80年代就有研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于丁肝病毒的circRNAs可以作為翻譯模版，合成一段含有122個(gè)氨基酸的多肽鏈[54]。近年來(lái)有研究表明circRNAs可被翻譯，并且它們的翻譯機(jī)制不依賴于5′端帽子，而是與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)有關(guān)。其中許多circRNAs與宿主mRNA使用相同的起始密碼子，并具有進(jìn)化上保守的終止密碼子，被與膜偶聯(lián)的核糖體翻譯[55]。m6A是真核生物中最豐富的RNA內(nèi)部修飾方式[56]。2017年，Yang等[57]首次發(fā)現(xiàn)circRNAs包含大量的m6A修飾，能夠以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，并且單個(gè)m6A位點(diǎn)足以驅(qū)動(dòng)翻譯的起始。隨后Leginii等[58]對(duì)小鼠和人成肌細(xì)胞體外分化過(guò)程中的circRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Circ-ZNF609與重鏈多核糖體相關(guān)，并以剪接依賴性和帽依賴性的方式表達(dá)出定位于細(xì)胞核蛋白質(zhì)，這項(xiàng)研究為真核細(xì)胞內(nèi)源性circRNAs被翻譯成蛋白質(zhì)的潛力提供了證據(jù)。另一項(xiàng)研究顯示，circRNAs編碼的肽在癌癥中具有的潛在分子功能。Circ-FBXW7編碼一個(gè)21 kD的蛋白質(zhì)FBXW7-185aa，在癌細(xì)胞中上調(diào)FBXW7-185aa的表達(dá)量，可以抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的加速[59]。雖然這項(xiàng)研究是基于circRNAs的過(guò)表達(dá)，但也為circRNAs可編碼體內(nèi)功能性蛋白提供了依據(jù)。然而，由于多核糖體相關(guān)的circRNA的比例和翻譯效率都較低，因此預(yù)期circRNAs在生物學(xué)相關(guān)水平上不會(huì)產(chǎn)生許多蛋白質(zhì)。

2.4 調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄

在各類circRNAs中，ecircRNAs主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而ciRNAs和EIciRNAs在細(xì)胞核中含量豐富，研究表明ciRNAs和EIciRNAs在調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用。Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和剪接之間的偶聯(lián)可能允許加工的ciRNA在其親本基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)累積，與延伸的RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)復(fù)合體締合增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，并以順式作用方式調(diào)節(jié)親本基因的轉(zhuǎn)錄。EIciRNA可以在其親本基因的啟動(dòng)子上與U1小核糖核蛋白(U1-snRNP)結(jié)合，EIciRNA-U1 snRNP復(fù)合物可能與PolⅡ復(fù)合體相互作用以促進(jìn)宿主基因表達(dá)[60]。這些結(jié)果說(shuō)明EIciRNAs和ciRNAs可以促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。此外，ecircRNAs也顯示出調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。FECR1是來(lái)自FLI1的外顯子circRNA，分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，可以結(jié)合FLI1啟動(dòng)子并募集TET1脫甲基酶，誘導(dǎo)啟動(dòng)子的CpG島DNA去甲基化來(lái)順式調(diào)控FLI1轉(zhuǎn)錄[61]。

3 CircRNAs的分析方法和數(shù)據(jù)庫(kù)

3.1 分析方法

通過(guò)RNA測(cè)序(RNA-seq)和基因芯片技術(shù)(gene chip technology，GCT)可以獲取大量的circRNAs。RNA-seq測(cè)序不限于檢測(cè)與現(xiàn)有基因組序列相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，且具有背景信號(hào)低且靈敏度高的特點(diǎn)，目前構(gòu)建circRNAs文庫(kù)的方式分為兩種：一種為去除rRNA的文庫(kù)構(gòu)建，另一種為去除rRNA和線性RNA的文庫(kù)構(gòu)建。前者可同時(shí)檢測(cè)各類RNA的表達(dá)水平，便于關(guān)聯(lián)分析，但對(duì)低豐度表達(dá)的circRNAs不敏感，而后者則更利于檢測(cè)低豐度表達(dá)的circRNAs?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)效率高，得到的circRNAs數(shù)目比RNA-seq更多，然而只能檢測(cè)已知的circRNAs，因而RNA-seq更適合用于新circRNAs的鑒定。若進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn)circRNAs差異表達(dá)水平，則需對(duì)檢測(cè)出的circRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)分析，RT-PCR是鑒定circRNA最簡(jiǎn)單快速的方法[62-63]。CircRNA預(yù)測(cè)軟件有circRNA_finder、find_circ、CIRCexplorer、CIRI、MapSplice、DCC、KNIFE、NCLscan、PTESFinder、UROBORUS、segemehl等，不同的軟件使用不同的算法有各自的優(yōu)點(diǎn)，滿足了大部分研究者的需求[64]。

3.2 CircRNA數(shù)據(jù)庫(kù)

隨著circRNA的研究越來(lái)越多，已知的circRNA數(shù)據(jù)信息也在快速增長(zhǎng)，常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有circBase、circRNABase、circ2Traits、circNet、deepBase v2.0、CircInteractome、circRNADb、CIRCpedia v2、TSCD(tissue-specific circRNA database)、CSCD(cancer-specific circRNA database)、Mi OncoCirc、exoRBase、circRNADisease、AtCircDB、circbank等，各數(shù)據(jù)庫(kù)的基本信息見(jiàn)表1。

表1 CircRNAs數(shù)據(jù)庫(kù)Table 1 Databases for circRNAs

4 CircRNAs在生態(tài)毒理學(xué)中研究進(jìn)展

化學(xué)物質(zhì)與生物體的所有初級(jí)相互作用都發(fā)生在細(xì)胞的分子水平上，因此從分子水平上理解生態(tài)毒理學(xué)是了解毒性機(jī)理和提高預(yù)測(cè)能力的關(guān)鍵[80]。幾乎無(wú)一例外，基因表達(dá)的改變是毒性暴露過(guò)程中直接或間接的結(jié)果[81]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用可以從分子機(jī)制上理解生物或種群的毒性效應(yīng)，在時(shí)間和空間上架起不同尺度的橋梁，從而彌合分子和生態(tài)系統(tǒng)水平之間因果的鴻溝。許多研究已經(jīng)揭示了非編碼RNA在毒性作用中的重要性[82-85]，隨著circRNAs研究的深入，其在環(huán)境化學(xué)污染物毒性中的作用也受到廣泛關(guān)注。

4.1 CircRNAs在有毒有害氣體生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

空氣中的有毒有害氣體是主要的環(huán)境污染物。氡(222Rn)是最臭名昭著的環(huán)境放射性氣體，已被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)歸類為致癌物質(zhì)[86]。氡可從建筑材料和土壤中釋放出來(lái)并在大氣中迅速擴(kuò)散，通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入身體后，體內(nèi)組織器官都可能受到暴露。Pei等[87]將6只小鼠每天暴露于濃度為100 000 Bq·m-3的氡中12 h，累積劑量達(dá)60個(gè)工作水平月(working level months，WLM)。研究結(jié)果表明，氡暴露對(duì)小鼠肺組織造成了嚴(yán)重的損傷，對(duì)照組和暴露組小鼠肺組織中circRNAs的表達(dá)譜顯示，氡暴露小鼠肺組織中有107個(gè)circRNAs上調(diào)及83個(gè)circRNAs下調(diào)，并預(yù)測(cè)了前30個(gè)上調(diào)及下調(diào)circRNAs中每個(gè)circRNA的5個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些circRNAs和miRNAs可能在氡致肺損傷中發(fā)揮重要的協(xié)同作用。

氨氣(NH3)是畜禽養(yǎng)殖舍內(nèi)主要的有害氣體之一，動(dòng)物吸入后會(huì)刺激呼吸道粘膜并引起肝損傷和繁殖能力下降。Chen等[88]提取了42 d NH3暴露后的雞胸腺組織進(jìn)行研究分析，組織病理學(xué)結(jié)果表明，NH3可導(dǎo)致雞胸腺炎癥性損傷。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)，NH3暴露降低了雞胸腺抗氧化相關(guān)基因gpx、gst4的mRNA表達(dá)，同時(shí)增加了炎癥相關(guān)基因IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS的mRNA表達(dá)，而且有5個(gè)circRNAs基因和100個(gè)mRNAs基因表達(dá)顯著異常。共表達(dá)結(jié)果顯示circRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)泛素化和降解功能、發(fā)育和功能成熟過(guò)程及保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷密切相關(guān)。該研究證明circRNAs和mRNAs的共表達(dá)參與了NH3暴露誘導(dǎo)的雞胸腺炎癥性損傷。

4.2 CircRNAs在農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

草甘膦(glyphosate)和阿特拉津(atrazine)除草劑是全球廣泛使用的農(nóng)用化學(xué)品，在環(huán)境中殘留量很大，嚴(yán)重影響陸地和水生態(tài)系統(tǒng)。體外研究實(shí)驗(yàn)表明，草甘膦可通過(guò)血腦屏障和胎盤屏障[89]，圍產(chǎn)期小鼠接觸草甘膦會(huì)導(dǎo)致子代前額葉皮質(zhì)中miRNA的差異表達(dá)[90]?？紤]到circRNAs在基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，Yu等[91]對(duì)圍產(chǎn)期小鼠進(jìn)行50 mg·kg-1·d-1劑量的草甘膦暴露，然后分析暴露組和對(duì)照組小鼠海馬circRNAs的表達(dá)譜。與對(duì)照組相比，暴露組中有663個(gè)circRNAs表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，其中330個(gè)顯著上調(diào)，而剩余333個(gè)顯著下調(diào)，表明circRNAs在草甘膦誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中發(fā)揮潛在作用。從差異表達(dá)的circRNAs中篩選出MMU-circRNA-014015、MMU-circRNA-28128和MMU-circRNA29837進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析，結(jié)果顯示它們與細(xì)胞氮化合物代謝過(guò)程、有機(jī)物代謝過(guò)程、免疫突觸和tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及醛固酮合成和分泌途徑相關(guān)，表明這3種circRNAs可能通過(guò)調(diào)節(jié)應(yīng)激相關(guān)的類固醇代謝途徑參與草甘膦誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。circRNAs-miRNA基因網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)MMU-circRNA-29837可能作為腦損傷相關(guān)miRNAs(MMU-miR-7035e5p、MMU-miR3083e5p和MMU-miR-34a-5p)的靶向海綿。上述結(jié)果提示，異常表達(dá)的circRNA參與了草甘膦誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，為理解草甘膦暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性分子機(jī)制提供了新思路。

阿特拉津是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可誘導(dǎo)許多動(dòng)物的生殖毒性。Sai等[92]報(bào)道阿特拉津暴露引起的circRNAs表達(dá)變化與非洲爪蟾睪丸發(fā)育毒理密切相關(guān)。研究顯示，經(jīng)過(guò)180 d 100 μg·L-1阿特拉津的暴露會(huì)導(dǎo)致雄性非洲爪蟾(Xenopuslaevis)蝌蚪生殖腺的發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)異常，睪丸中有405個(gè)circRNAs差異表達(dá)，包括44個(gè)上調(diào)的circRNAs和361個(gè)下調(diào)的circRNAs，其中282個(gè)差異表達(dá)的circRNAs具有miRNAs海綿功能。KEGG通路分析表明，差異表達(dá)的circRNAs相關(guān)靶基因與Wnt信號(hào)通路和孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路有關(guān)，可能參與了阿特拉津誘導(dǎo)的睪丸發(fā)育異常。

4.3 CircRNAs在抗腫瘤藥物的生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，隨之而來(lái)的是抗腫瘤藥物產(chǎn)量和使用量也逐年攀升?？鼓[瘤藥物的作用機(jī)制是通過(guò)直接或間接的方式破壞DNA結(jié)構(gòu)，抑制轉(zhuǎn)錄，從而影響蛋白質(zhì)的生物合成，母體藥物及代謝產(chǎn)物最終會(huì)排放到自然環(huán)境中，對(duì)非靶標(biāo)生物具有潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)。雷公藤甲素在多種人類腫瘤中發(fā)揮著有效的抗腫瘤活性，是一種很有前途的抗癌新藥。然而，動(dòng)物和人類暴露于雷公藤甲素可能會(huì)導(dǎo)致器官損傷，它還通過(guò)干擾嚙齒類動(dòng)物的精子產(chǎn)生和精子功能而導(dǎo)致不孕不育。對(duì)10周齡雄性C57BL/6J小鼠以50 μg·kg(體重)-1·d-1的雷公藤甲素進(jìn)行暴露，35 d后與只給予生理鹽水(0.9% NaCl)的對(duì)照組相比，雷公藤甲素暴露小鼠睪丸重量明顯減輕(P<0.05)，精子頭部和尾部畸形率顯著增加(45.75%)，睪丸組織學(xué)顯著改變，如生精細(xì)胞減少、管腔縮小、空泡化和其他形態(tài)異常。在睪丸中一共檢測(cè)到33 057個(gè)lncRNAs和11 956個(gè)circRNAs，經(jīng)雷公藤甲素暴露后，344個(gè)lncRNAs上調(diào)，143個(gè)lncRNAs下調(diào)，對(duì)于circRNAs，有374個(gè)上調(diào)，206個(gè)下調(diào)；同時(shí)，雷公藤甲素可上調(diào)2 551個(gè)mRNAs，下調(diào)1 028個(gè)mRNAs。GO和KEGG分析表明，差異表達(dá)的lncRNAs靶點(diǎn)、circRNAs同源基因和mRNAs的功能與精子發(fā)生的許多過(guò)程密切相關(guān)，提示circRNAs作為雷公藤甲素雄性生殖毒性的候選標(biāo)志物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究[93]。另一項(xiàng)研究報(bào)道了抗腫瘤藥物米托蒽醌(mitozantrone)對(duì)斑馬魚胚胎的毒性作用，并分析了米托蒽醌暴露處理前后斑馬魚胚胎差異性表達(dá)的circRNAs，結(jié)果顯示這些circRNAs的來(lái)源基因與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物代謝、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和降解以及神經(jīng)活性配體-受體作用通路相關(guān)，表明差異性表達(dá)的circRNAs可能參與了斑馬魚胚胎的體內(nèi)運(yùn)輸以及米托蒽醌誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用[94]。

5 展望

生態(tài)毒理學(xué)研究的核心是環(huán)境污染物對(duì)生命有機(jī)體產(chǎn)生的生物效應(yīng)。環(huán)境化學(xué)污染物進(jìn)入生物體后作用于靶位點(diǎn)，引起分子水平上的改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官受損，最終表現(xiàn)為生理或行為上的變化。而生物標(biāo)志物是生態(tài)毒理學(xué)中用于診斷毒性效應(yīng)的主要技術(shù)手段之一，用來(lái)指示環(huán)境暴露和毒效應(yīng)之間的關(guān)系。目前環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的毒性終點(diǎn)普遍基于運(yùn)動(dòng)行為、致畸性、死亡率等表型指標(biāo)，但是考慮到基因的遺傳多態(tài)性和表觀遺傳學(xué)差異對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，不同物種對(duì)環(huán)境化學(xué)污染物暴露的反應(yīng)也會(huì)存在差異，有可能導(dǎo)致相同的毒性機(jī)制卻表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。因此，可靠、敏感和特異的分子水平生物標(biāo)志物可了解和診斷生物體的毒性效應(yīng)，并快速預(yù)測(cè)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的不利影響，對(duì)生態(tài)毒理研究和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義。

CircRNAs因其高度的保守性、穩(wěn)定性以及時(shí)空特異性都預(yù)示著它有作為分子生物標(biāo)志物的潛能，上述基于環(huán)境化學(xué)污染物暴露后生物體內(nèi)circRNAs的研究結(jié)果也表明，經(jīng)過(guò)暴露后生物體內(nèi)的circRNAs出現(xiàn)差異性表達(dá)，暗示了circRNAs參與了環(huán)境化學(xué)污染物誘導(dǎo)的毒性效應(yīng)。這提示circRNAs或許可作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中。然而，研究circRNAs對(duì)環(huán)境暴露相關(guān)毒性效應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展作用仍處于初級(jí)階段，未來(lái)的研究可針對(duì)2個(gè)方面：鑒定與毒性效應(yīng)相關(guān)的特異性circRNAs，以及環(huán)境化學(xué)污染物暴露濃度與circRNAs表達(dá)水平間的定量關(guān)系。相信隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展以及在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用，對(duì)circRNAs在毒性效應(yīng)中的作用機(jī)制會(huì)有更透徹的認(rèn)識(shí)，circRNAs也極有可能作為新型的生物標(biāo)志物，在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中為生態(tài)毒理學(xué)家和環(huán)境學(xué)工作者提供新的技術(shù)手段與研究方向。