具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選及抑菌物質(zhì)的特性分析

孫小涵，孫洪浩，陳秀秀，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實業(yè)有限公司，遼寧 沈陽 110127）

近年來，由于在食品和飼料中使用化學添加劑的情況越來越多，給消費者帶來的危害越來越大，因此人們對不含化學防腐劑的天然新鮮食品需求越來越高。乳酸菌具有良好的安全性和抗菌活性，在食品和飼料中得到了廣泛的應(yīng)用，是公認的食品級安全微生物。在乳酸菌中，最大的類群是乳桿菌屬，它有150多個不同的物種[1]，其中包括一些對宿主健康有益的乳桿菌屬[2]。例如，植物乳桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，其分布廣泛，包括乳制品和發(fā)酵食品，牛糞、青貯飼料和污水等環(huán)境，以及人和動物口腔、腸道和糞便等。

在以往研究中乳桿菌的抗菌物質(zhì)主要是有機酸[3]、脂肪酸[4]、短肽[5-6]等物質(zhì)。據(jù)報道，乳酸菌能產(chǎn)生6種有機酸，可抑制霉菌的生長，包括乳酸、乙酸和丙酸等[7]。后來，許多研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸也具有抗菌特性，如植物乳桿菌MILAB14中的3-羥基脂肪酸[8]。副酸桿菌所產(chǎn)生的細菌素對丙酸桿菌有明顯的抑制作用[9]。

乳酸菌的抗菌機制很復(fù)雜。一些研究人員指出，發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機酸可以通過進入細胞質(zhì)來降低細胞內(nèi)的pH，從而影響致病菌的生長和代謝[10]。此外，有研究人員還認為有機酸可以與某些成分結(jié)合，如細胞膜上的脂多糖，從而破壞細胞膜的穩(wěn)定性，達到抑菌作用[11]。Strom等[12]還發(fā)現(xiàn)苯乳酸能抑制絲狀真菌的蛋白表達。Bergsson等[13]證實脂肪酸能穿透致病細胞并與其質(zhì)膜結(jié)合，進而改變膜的通透性，達到抑菌作用。Khalaf等[14]發(fā)現(xiàn)從乳酸菌中分離出的細菌素也能夠通過破壞病原體外膜的完整性而起抗菌作用。

植物乳桿菌具有重要的抗菌活性和益生菌特性，已被用于開發(fā)功能性食品并大規(guī)模生產(chǎn)，但存在抑菌效率低、抑菌譜窄、抑菌活性不穩(wěn)定等問題，因此篩選優(yōu)良的菌株，包括菌株的抗菌物質(zhì)特性，都是值得我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。本研究擬從豬腸道中篩選出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用的菌株，并對其抑菌物質(zhì)展開初步分析，以進一步提供優(yōu)良的菌種資源，為抑菌物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2019年12月至2020年7月在遼寧波爾萊特農(nóng)牧實業(yè)有限公司肽制劑研發(fā)中心進行。

1.2 材料

金黃色葡萄球菌（SA）、大腸埃希氏菌（K88）由本實驗室保存；植物乳桿菌由本實驗室分離得到并保存；MRS肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵上清液的制備 首先將保藏的菌種復(fù)蘇、傳代，后按2%的接種量接入50 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，細菌培養(yǎng)液10 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.22 μm濾器過濾，備用。

1.3.2 指示菌菌懸液的制備 把大腸桿菌和金黃色葡萄球菌按2%接種量接入LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)16～18 h。

1.3.3 植物乳桿菌抑菌能力的篩選 采用牛津杯平板法測定發(fā)酵上清液抑菌活性。首先，加入已經(jīng)高壓滅菌的LB瓊脂培養(yǎng)基于平板中，靜止放置待培養(yǎng)基凝固后，將指示菌菌懸液（108cfu/mL）均勻地涂在LB瓊脂培養(yǎng)基上，將牛津杯置于平板上，每個牛津杯中加入200 μL已制備好的發(fā)酵上清液，于4 ℃冰箱中擴散4 h，37 ℃培養(yǎng)16～18h后，測量抑菌圈直徑大小，以未接種的MRS肉湯培養(yǎng)基上清液作為空白對照，做3次重復(fù)。測量抑菌圈直徑，評估抗菌活性。

1.3.4 不同發(fā)酵時間上清液的抑菌活性研究 植物乳桿菌LP-01按照2%的接種量轉(zhuǎn)接100 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)48 h，分別在0、4、8、12、16、20、24、32、40、48 h取發(fā)酵液，測定其OD600值；用牛津杯法測定發(fā)酵上清液在每個時間段對指示菌的抑菌活性。

1.3.5 過氧化氫抑菌作用的消除 在發(fā)酵上清液中加入1.5 mg/mL的過氧化氫酶，對照組不用過氧化氫酶處理，在37 ℃水浴作用2 h，排除發(fā)酵液中過氧化氫的作用，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，牛津杯平板法進行抑菌能力測定。

1.3.6 pH對抑菌物質(zhì)的影響 在發(fā)酵上清液中起到抑菌作用的可能是細菌素，或是有機酸等物質(zhì)。為排除酸性物質(zhì)的干擾，用2 mol/L的氫氧化鈉將發(fā)酵上清液調(diào)至pH 7.0，用牛津杯平板法進行抑菌試驗，未被堿中和的發(fā)酵上清液做對照，比較處理前后抑菌圈的變化。

1.3.7 溫度對發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將發(fā)酵上清液分別于65、85和100 ℃水浴20 min，對照組為無高溫處理的發(fā)酵上清液原液，用牛津杯平板法比較處理前后抑菌能力的變化。具體方法參照1.3.3。

1.3.8 蛋白酶對發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將發(fā)酵上清液分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K在各自最適宜的溫度和pH下作用2 h，酶濃度為2.5 mg/mL，再將發(fā)酵上清液pH調(diào)回至初始值，空白對照組不加酶并用相同條件處理發(fā)酵上清液，用指示菌進行抑菌能力的測定。牛津杯法比較處理前后抑菌能力的變化。

2 結(jié)果

2.1 不同植物乳桿菌的抗菌活性比較

用牛津杯方法測定5種植物乳桿菌的抗菌能力，結(jié)果表明，5種植物乳桿菌對指示菌均具有良好的抗菌活性。如表1所示，根據(jù)各菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用，LP-01具有最高的抗菌活性，抑菌圈直徑分別為18.08 mm和18.93 mm。因此，選擇此菌進行下一步試驗。

表1 指示菌抑菌圈直徑的測定結(jié)果 mm

2.2 不同發(fā)酵時間抑菌活性比較

由圖1可知，植物乳桿菌LP-01從2 h進入對數(shù)生長期，16～20 h后開始趨于平穩(wěn)生長。發(fā)酵上清液在初始階段（0～4 h）沒有明顯的抑菌活性，從8 h開始明顯改善，抑菌活性隨著時間增加逐漸增強。到20 h抑菌活性趨于穩(wěn)定，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌指示菌抑菌圈直徑分別達到18.73 mm和19.32 mm。同時，從圖1可直觀地看出表明發(fā)酵上清液的抗菌作用與細菌的生長情況呈正相關(guān)。

2.3 溫度、pH、酶對植物乳桿菌LP-01抑菌活性的影響

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌株，測定了pH、溫度和酶對LP-01發(fā)酵上清液抑菌活性的影響，其抑菌效果如表2所示。結(jié)果表明，在100 ℃處理20 min后，發(fā)酵上清液抑菌活性無顯著變化，說明抑菌物質(zhì)具有很好的耐熱性；當發(fā)酵液pH為7.0時，抑菌活性徹底喪失，表明抑菌物質(zhì)只有在酸性條件下才有良好的抑菌作用；同時，用過氧化氫酶、胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K處理的發(fā)酵上清液與對照組相比沒有出現(xiàn)明顯差異（P＞0.05），對發(fā)酵上清液抑菌活性影響不大，表明LP-01發(fā)酵過程中沒有產(chǎn)生過氧化氫，且發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)沒有抑菌作用，說明抑菌物質(zhì)對消化液蛋白酶不敏感。

表2 不同條件處理下LP-01的抑菌圈直徑 mm

3 討論

在本研究中，筆者比較了幾種植物乳桿菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LP-01具有優(yōu)良的抗菌活性，可有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。筆者對LP-01發(fā)酵上清液的抗菌物質(zhì)特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)該抗菌物質(zhì)在酸性條件下具有良好的熱穩(wěn)定性和抗菌活性，在堿性條件下失去抗菌活性，表明發(fā)酵上清液中含有具有熱穩(wěn)定的有機酸類物質(zhì)。此外，經(jīng)過蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活性無明顯變化，表明蛋白質(zhì)在LP-01發(fā)酵上清液中的抗菌作用有限。

乳酸菌的抑菌作用涉及各種代謝物。例如，乳酸菌產(chǎn)生的乙酸和丁酸對霉菌有抑制作用[15-16]；Guo等[17]從植物乳桿菌IMAU10014中提取的苯乳酸具有抑菌作用；有研究者從植物乳桿菌中分離出了其他抗菌物質(zhì)如3-羥基癸酸和癸酸，對真菌具有良好的抗菌活性。此外，Atanasova等[18-19]還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的過氧化氫和其他物質(zhì)也顯示出了抗菌活性。為此，許多研究者對代謝物中的抗菌機制進行了廣泛的研究。共同的研究機制是有機酸可抑制細菌細胞膜的穩(wěn)定性或降低細胞內(nèi)的pH，從而影響致病菌的代謝，起到抑制作用。而細菌素是通過增加細胞膜的通透性，引起細胞內(nèi)各離子的滲漏和能量的消耗，最終導(dǎo)致細菌死亡。

綜上所述，乳酸菌的抑菌作用與其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，不同乳酸菌的代謝產(chǎn)物不同。筆者通過試驗探究乳酸菌的抑菌物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)LP-01上清液的主要抗菌物質(zhì)為含有熱穩(wěn)定的有機酸，有機酸通過破壞了細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細菌不能正常生長和繁殖，從而導(dǎo)致細菌死亡，發(fā)揮其抑菌作用。其抑菌物質(zhì)及機制還需要進一步地研究加以佐證。