結(jié)節(jié)性硬化基因1/2突變與肝細(xì)胞癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系

張 勇，毛正發(fā)

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 225500

肝細(xì)胞癌(HCC)病因復(fù)雜，主要為HBV、HCV感染，其他因素還包括過(guò)量飲酒、接觸或食用曲霉菌毒素以及各種代謝紊亂等[1]。約有80%的HCC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。索拉非尼是目前作為唯一被批準(zhǔn)用于肝癌的特效藥物[3]，但因多發(fā)手足綜合征、疲乏、腹瀉、皮疹、血壓升高及白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)，使很多患者不能耐受[4-7]，大大降低了藥物的效用。此外，HCC的異質(zhì)性大，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，亟需探索更多新藥治療方案。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究的不斷進(jìn)展，疾病與基因的相關(guān)性被廣泛研究，許多基因片段如VEGFA、FGF19/CNND1等都在HCC發(fā)生中發(fā)揮重要作用[8]，為HCC的治療開(kāi)拓了新方向。研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)節(jié)性硬化基因(TSC)1/2基因突變與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可導(dǎo)致hamartin-tuberin復(fù)合物異?；蚝铣烧系K，從而引起哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其下游信號(hào)通路過(guò)度激活，mTOR作為PI3K/AKT下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)S6K1及4E-BP1等因子的磷酸化水平，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。Ho等[13]通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，TSC1/2基因突變通過(guò)抑制mTOR的活性，導(dǎo)致HCC中癌細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，提示TSC1/2基因可能與HCC的侵襲性相關(guān)。但目前關(guān)于TSC1/2的臨床研究尚少，本研究通過(guò)分析TSC1/2基因突變與HCC的相關(guān)性，觀察TSC1/2基因突變?cè)贖CC中所發(fā)揮的作用，為拓展HCC的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2020年1月本院收治的HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理學(xué)檢查證實(shí)HCC；(2)年齡40～75歲；(3)對(duì)本研究知情，并自愿受試；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)節(jié)性硬化患者以及家族中直系親屬中有結(jié)節(jié)性硬化疾病的患者；(2)面部血管纖維瘤、腎血管肌質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌、肺淋巴管肌瘤病患者；(3)兒童期患有心臟橫紋肌瘤病的患者；(4)自閉癥譜系病患者。

1.2 臨床分期 對(duì)所有患者進(jìn)行肝臟CT或MRI檢查，根據(jù)結(jié)果記錄肝細(xì)胞癌大小和數(shù)量。在HCC最常見(jiàn)轉(zhuǎn)移部位，如肺、骨等部位進(jìn)行B超、增強(qiáng)CT及MRI檢查，對(duì)于普通檢查難以發(fā)現(xiàn)并且高度懷疑轉(zhuǎn)移的患者，進(jìn)行PET-CT檢查以明確有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移。通過(guò)增強(qiáng)CT或者增強(qiáng)MRI檢查，明確是否存在肝靜脈及門靜脈癌栓。采集靜脈血進(jìn)行生化檢查，體力狀況評(píng)分(PS)。根據(jù)2018年中國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)(CSCO)原發(fā)性肝癌診療指南[10]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分期。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑與檢索數(shù)據(jù)庫(kù) 血液基因DNA提取試劑盒(美國(guó)QIAGEN公司)；測(cè)序用試劑：核酸外切酶buffer及big-dye、蝦減酶；多重PCR擴(kuò)增儀及3730XL自動(dòng)測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)。基因突變檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心GeneBank；HGNC Home Page數(shù)據(jù)庫(kù)；International HapMap Project數(shù)據(jù)庫(kù)；cBioPortal腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)；ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 TSC1/2基因突變的檢測(cè) 采集患者外周靜脈血樣本2 ml，裂解紅細(xì)胞，提取白細(xì)胞進(jìn)行DNA的提取、結(jié)合、洗脫、檢測(cè)及定量，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用Sanger法進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)基因、腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道判斷TSC1/2基因突變是否為致病突變。記錄患者TSC1/2基因突變情況，采用雙盲、隊(duì)列研究的方式評(píng)估基因突變與疾病進(jìn)展(HCC臨床分期)的關(guān)系。

1.3.3 預(yù)后隨訪 對(duì)所有入組患者進(jìn)行3年隨訪，截至2020年1月，隨訪時(shí)間不足3年的患者不納入隨訪范圍。隨訪采用電話咨詢及患者自動(dòng)來(lái)院的形式進(jìn)行，每月1次。采用雙盲、隊(duì)列研究方式，將TSC1/2突變患者納入突變組，結(jié)合突變組患者年齡、性別、治療方式及飲酒史、基礎(chǔ)肝炎疾病等情況，在未突變患者中選取相同樣本量的患者納入對(duì)照組。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：2011倫審第10號(hào)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料兩組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)；采用多元logistic回歸分析相關(guān)性，隨訪資料采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者基因突變情況 共納入HCC患者492例，其中男358例，女134例，年齡40～75歲。其中59例患者出現(xiàn)TSC1/2基因突變(TSC1突變20例，TSC2突變41例，共同突變2例)，總體突變率為11.99%。通過(guò)與基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變，且所有突變均為致病突變。在20例TSC1突變中，18例為點(diǎn)突變，具體突變點(diǎn)包括：Exon 12(4例)、Exon 19(3例)、Exon 6/15(各2例)、Exon 2/3/4/7/11/14/17(各1例)；2例出現(xiàn)基因缺失：Exon 5(堿基AA堿基缺失)、Exon 15(堿基G缺失)。在41例TSC2突變中，37例為點(diǎn)突變，具體突變點(diǎn)包括：Exon 21(6例)、Exon 12/18(各4例)、Exon 23/28(各3例)、Exon 3/6/32/37/38(各2例)、Exon 1/2/5/8/16/25/27(各1例)；2例出現(xiàn)基因缺失：Exon 20(CCATGGT堿基缺失)、Exon 31(CTCCC CGCTCGCCCAGTG GCCTCCGGCCCCG AGG TTAC ACCA TCT CCGACTCGGCC堿基缺失)；2例出現(xiàn)堿基插入引起：Exon 10(T堿基插入)、Exon 39(GC堿基插入)。

2.2 TSC1/2基因突變HCC患者臨床特征比較 TSC1、TSC2基因突變組患者性別、年齡、Child-Pugh分級(jí)及腫瘤大小與未突變組相較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，兩組腫瘤個(gè)數(shù)、肝外轉(zhuǎn)移情況及PS評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05)(表1)。

表1 TSC1/2基因突變患者臨床特征比較

2.3 TSC1/2突變與HCC臨床分期的關(guān)系 選擇可能對(duì)HCC疾病加重有關(guān)的因素：性別、年齡、TSC1/2基因突變與否進(jìn)行變量賦值。其中，因變量以HCC Ⅲ～Ⅳ期為參照因素，自變量以女性、60歲≤年齡<75歲、無(wú)TSC1/2突變?yōu)閰⒄兆兞?。logistic回歸分析結(jié)果顯示，TSC1/TSC2基因突變與HCC臨床分期嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(OR=1.706，P<0.05)。

2.4 隨訪情況分析 共隨訪TSC1/2突變組患者35例，隨機(jī)選取TSC1/2未突變的HCC患者35例為對(duì)照組，兩組基本情況比較見(jiàn)表2。

表2 隨訪的TSC1/2突變組與未突變組患者基本情況比較

隨訪過(guò)程中，TSC1/2突變組有1例患者死于心肌梗死，1例死于腦出血，1例患者失訪。未突變組患者1例失訪，1例死于墜樓。上述患者定為刪失數(shù)據(jù)。兩組生存分析比較結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，TSC1/2突變組患者的生存率明顯低于未突變組，前者3年病死率高達(dá)60.3%，與未突變組(38.6%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.923,P<0.05)(圖1)。

圖1 TSC1/2突變組與未突變組患者生存情況

3 討論

不同基因的突變能夠引起HCC患者不同的病理改變，如CTNNB1突變引起腫瘤體積大，分化好，可見(jiàn)膽汁淤積、小梁和假腺形態(tài)，無(wú)炎性浸潤(rùn)；TP53突變引起的腫瘤分化差，細(xì)胞形態(tài)致密，多核，多形，容易侵犯血管[15]。

本研究結(jié)果顯示，TSC1/2突變與否在患者性別、年齡、腫瘤的體積及Child-Pugh分級(jí)方面無(wú)明顯差異，而在腫瘤的個(gè)數(shù)、肝外轉(zhuǎn)移及患者PS評(píng)分上有明顯差異，提示TSC1/2突變使HCC更具有侵襲性。

針對(duì)HCC腫瘤微環(huán)境的研究[16]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素靶點(diǎn)抑制劑及抗PD-1抗體的協(xié)同作用能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。而作為機(jī)體內(nèi)重要的mTOR/S6K1信號(hào)調(diào)控基因，TSC1/hamartin、TSC2/tuberin在HCC的病程中發(fā)揮著重要的作用[17]。TSC1/2復(fù)合物是mTOR信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵的因子，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用,在細(xì)胞的生長(zhǎng)、合成代謝中發(fā)揮重要作用，其信號(hào)傳導(dǎo)通路異常與80%的癌癥相關(guān)[18]。TSC1/2復(fù)合物最初被認(rèn)為與結(jié)節(jié)性硬化綜合征密切相關(guān)[19]。該綜合征具有多種臨床特征，包括面部血管纖維瘤、腎血管肌質(zhì)瘤、肺淋巴管肌瘤病、心臟橫紋肌瘤以及自閉癥[20]。為了排除結(jié)節(jié)性硬化綜合征的干擾，保證研究較高的針對(duì)性，筆者團(tuán)隊(duì)在選取入組患者時(shí)排除了上述疾病。對(duì)于不同疾病，TSC1和TSC2的突變比率有所不同，如在結(jié)節(jié)性硬化癲癇患者中，TSC2突變組嬰兒肌痙攣發(fā)生率高于TSC1突變組(47.3% vs 23%)[21]；在室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤合并結(jié)節(jié)性硬化綜合征患兒中，TSC1突變與TSC2突變發(fā)生率為(33.7 vs 13.2%)[22]。筆者通過(guò)對(duì)比分析相關(guān)腫瘤基因庫(kù)發(fā)現(xiàn)，HCC患者TSC1突變與TSC2突變發(fā)生率為1∶1.5～6.0，與本研究結(jié)果相近。

TSC1/2基因突變抑制mTOR的活性，可導(dǎo)致HCC的侵襲能力增強(qiáng)[13]，本研究也提示，TSC1/2的基因突變與HCC的惡性程度呈正相關(guān)。通過(guò)對(duì)患者為期3年的隨訪發(fā)現(xiàn)，在去除與HCC惡化相關(guān)的其他因素影響后，TSC1/2突變的患者的遠(yuǎn)期生存率明顯小于未突變患者。筆者團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)開(kāi)展更長(zhǎng)期的隨訪，后續(xù)研究仍在進(jìn)行中。

綜上所述，TSC1/2基因突變可以作為一種潛在檢查手段，對(duì)于HCC的進(jìn)展具有早期評(píng)估作用。出現(xiàn)TSC1/2突變的患者預(yù)后更差，臨床上應(yīng)針對(duì)性采取更為早期積極的治療方案，以提升療效。同時(shí)，本研究也提示基因突變靶向藥物治療對(duì)于延緩HCC發(fā)展可能具有一定療效，對(duì)此應(yīng)開(kāi)展更深入廣泛的研究探索。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：張勇負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；毛正發(fā)負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，修改論文；張勇、毛正發(fā)負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。