腸道優(yōu)勢菌群豐度變化與新冠病毒肺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性的臨床意義

湯靈玲 ，顧思嵐 ，龔憶雯 ，李博 ，魯海峰 ，李強 ，張如洪 ，高翔 ，吳正潔 ，張佳穎 ，張園園 ，李蘭娟 ,*

a Department of Infectious Diseases, Shulan (Hangzhou) Hospital Affiliated to Zhejiang Shuren University Shulan International Medical College, Hangzhou 310003, China

b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China

c Shaoxing Tongchuang Medical Equipment Co., Ltd., Shaoxing 312000, China

d Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430200, China

1. 引言

新冠病毒肺炎（COVID-19）是一種具有高度傳染性的疾病。國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組已將其病原體命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARSCoV-2）。COVID-19最常見的臨床表現(xiàn)為肺炎。

H7N9是一種引起肺部損害的病毒性傳染病。先前的研究發(fā)現(xiàn)，H7N9患者的腸道菌群失調(diào)，尤其是重型和危重型患者[1]。Qin等[2]分析了26例H7N9患者的腸道菌群組成，結(jié)果顯示，在門水平上，患者擬桿菌門豐度減少，而變形菌門豐度增加；在屬水平上，H7N9患者的直腸真桿菌（Eubacterium rectale）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）豐度顯著減少，而沙門氏菌（Salmonella）和腸球菌（Enterococcus, Ec）的豐度增加。有益腸道菌可調(diào)節(jié)免疫功能[3]。一項針對重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者的前瞻性研究顯示，使用益生菌可降低全身炎癥，從而使血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平降低[4]。腸道微生物菌群失衡似乎與人體炎癥反應(yīng)有關(guān)，腸道微生物組分的變化與胃腸道細(xì)菌易位引起的繼發(fā)感染相關(guān)[5]。細(xì)菌易位是多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要病因[6,7]。臨床研究表明，腸道細(xì)菌受缺氧、缺血和危重型患者抗生素使用的影響。腸道微生態(tài)制劑有助于預(yù)防感染、膿毒癥和MODS的發(fā)生[8]。

COVID-19疾病由急性呼吸道病毒感染引起，在重型和危重型病例中引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。重型患者血清IL-6水平顯著升高[9]。急性呼吸窘迫綜合征是COVID-19中最常見的器官功能障礙[10]。根據(jù)腸道菌群的豐度和臨床意義，我們采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-PCR）檢測了患者的10種腸道優(yōu)勢菌群，包括益生菌[乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌]、條件致病菌[腸球菌、腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacteriaceae, E）和奇異菌（Atopobium）]和其他共生細(xì)菌[普拉梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii）、酪酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、柔嫩梭菌（Clostridiumleptum）、直腸真桿菌和擬桿菌（Bacteroides）]，并探討它們與COVID-19嚴(yán)重程度的關(guān)系。

2. 材料與方法

2.1. 研究設(shè)計

對57例COVID-19確診患者的新鮮糞便標(biāo)本中的10種優(yōu)勢腸道菌群進(jìn)行檢測。根據(jù)中國《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[11]，將所有患者分為普通型、重型及危重型三組。

普通型患者，即具有發(fā)熱、呼吸道癥狀，影像學(xué)可見肺炎表現(xiàn)。重型患者，即符合下述任何一條者：呼吸頻率≥ 30次·min–1；靜息狀態(tài)下氧飽和度≤ 93%；動脈血氧分壓（PaO2）/吸入氧比例（FiO2）≤ 300 mmHg（注：1 mmHg = 133.3 Pa）；肺部影像學(xué)顯示24～48 h內(nèi)病灶明顯進(jìn)展＞50%。危重型患者，即符合以下情況之一者：出現(xiàn)呼吸衰竭且需要機械通氣；出現(xiàn)休克；合并其他器官功能衰竭需ICU監(jiān)護(hù)治療[11]。所有臨床數(shù)據(jù)，包括生化和免疫學(xué)指標(biāo)均從電子病歷中收集，并列于表 1。

2.2. 應(yīng)用q-PCR 檢測腸道優(yōu)勢菌群

所用引物見附錄A中的表S1。所有的寡核苷酸引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。實驗使用ViiATM7實時熒光PCR系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國）進(jìn)行q-PCR。擴增反應(yīng)包含10 μL的SYBRTMq-PCR預(yù)混液（由紹興同創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司提供）、8 μL引物（0.2～0.6 μmol·L–1）、2 μL模板DNA或2 μL水（陰性對照），最終體積為20 μL。每個反應(yīng)重復(fù)3次，重復(fù)之間的循環(huán)閾值（ΔCt）< 0.5。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，采集熒光信號，共40個循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板為梯度稀釋的已知濃度的質(zhì)粒，使用與目的菌相同的引物擴增得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3. 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 22.0和GraphPad 8.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，而非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)范圍（IQR）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）對臨床資料的組間差異進(jìn)行分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用曼-惠特尼（Mann-Whitney）U檢驗或克魯斯卡爾-沃利斯（Kraskal-Wallis）檢驗進(jìn)行分析。采用卡方（χ2）檢驗比較分類數(shù)據(jù)。利用皮爾遜相關(guān)分析建立微生物與實驗結(jié)果之間的相關(guān)性。構(gòu)造受試者工作特性（ROC）曲線以確定最佳截止值。曲線下面積（AUC）用于評估菌群對疾病嚴(yán)重程度的診斷價值。P< 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4. 倫理

本研究得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床研究倫理委員會（WDRY2020-K153）的批準(zhǔn)。研究內(nèi)容遵守1975年《赫爾辛基宣言》[12]中規(guī)定的倫理標(biāo)準(zhǔn)。

3. 結(jié)果

3.1. 人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征

根據(jù)中國《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[11]，所有COVID-19患者被分為普通型、重型和危重型三組。在研究人群中檢測10種主要腸道菌群。20 例患者為普通型，中位年齡為59歲（IQR, 53～63），男女比例為2∶3（表1）。19例患者為重型，中位年齡為66歲（IQR, 61～74），男女比例為9∶10。18例患者為危重型，中位年齡為68歲（IQR, 55～70），男女比例為2∶1。重型和危重型患者的中位年齡高于普通型。三組患者的性別比例無顯著差異。三組患者從入院到腸道菌群檢測送檢的時間分別為20 d、23 d和22 d，三組間無顯著差異。三組患者存在一種以上慢性疾病（包括高血壓、糖尿病、肝病和腎臟疾?。┑谋壤謩e為50.0%、63.2%和77.8%。其中存在高血壓的比例分別為35%（7 例）、42.1%（8例）、66.7%（12例），三組間存在顯著差異且呈遞增趨勢（P< 0.05）。肝腎疾病發(fā)生率無顯著差異，可能是樣本量受限。

表1 普通型、重型和危重型人群中57例COVID-19合并肺炎患者的實驗室檢查結(jié)果

3.1.1. 實驗室檢查結(jié)果

三組患者的白細(xì)胞計數(shù)（WBC）存在顯著差異（P< 0.05）。危重型組患者的白細(xì)胞計數(shù)高于普通型組（P< 0.05），但普通型組與重型組之間無顯著差異。三組患者的中性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例和單核細(xì)胞比例存在顯著差異（P< 0.05）。在C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、IL-6方面，普通型組與重型組相比無明顯差異，而危重型組明顯高于重型組（P< 0.05）。危重型組患者與重型組患者在D-二聚體、肌紅蛋白和乳酸脫氫酶（LDH）水平上存在顯著差異（P< 0.05），而普通型組與重型組患者之間無明顯差異。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）水平在三組患者之間無明顯差異。危重型患者的血清白蛋白（ALB）水平明顯降低。

3.1.2. 治療與結(jié)局

共有50.9%、5.3%和12.3%的患者分別接受了抗生素、抗真菌藥物和益生菌治療。危重型患者使用抗生素和抗真菌藥物更為普遍，而益生菌不常使用。在給予益生菌治療的患者中，普通型有1例（5%）、重型4例（21.1%）、危重型2例（11.1%）。18例危重型患者中死亡8例（44.4%）。

3.2. COVID-19 患者腸道菌群組成的變化

COVID-19患者的益生菌，如乳酸桿菌和雙歧桿菌，以及抑炎菌，如普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌的豐度在減少。條件致病菌腸球菌豐度在增加，而腸桿菌的豐度在減少。奇異菌的豐度無顯著變化。擬桿菌的豐度在三組患者間無明顯差異，下降比例分別為55%、47.4%和61.1%。

常用對數(shù)（lg）用于計算細(xì)菌數(shù)量，即每克糞便細(xì)菌的拷貝數(shù)（圖 1）。益生菌和抑炎菌豐度在三組間的差異顯著。隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，有益菌的豐度在減少。Ec/E值的計算公式為lg(1000×Ec/E)，細(xì)菌計量方式為lg，并根據(jù)既往研究健康人群的Ec/E值，用1∶1000修正。這一比值在危重型患者中顯著增加。

圖1. COVID-19患者有組間統(tǒng)計學(xué)差異的優(yōu)勢菌屬變化。（a）乳酸桿菌：普通型組豐度的中位值為1.8 × 104，重型組為1.8 × 104，危重型組為200 ，正常值參考范圍為1.0 × 106～9.0 × 108；（b）雙歧桿菌：普通型組豐度的中位值為5.7 × 106，重型組為4.4 × 106，危重型組為1.4 × 104，正常值參考范圍為1.0 × 105～9.0 × 108；（c）普拉梭菌：普通型組豐度的中位值為5.0 × 106，重型組為1.6 × 105，危重型組為1.7 × 104，正常值參考范圍為1.0× 106～9.0 × 109；（d）丁酸梭菌：普通型組豐度的中位值為1.6 × 105，重型組為1.9 × 105，危重型組為310，正常值參考范圍為1.0 × 105～9.0 × 108；（e）柔嫩梭菌：普通型組豐度的中位值為4.3 × 106，重型組為6.4 × 105，危重型組為1.4 × 104，正常值參考范圍為1.0 × 106～9.0 × 108；（f）直腸真桿菌：普通型組豐度的中位值為1.8 × 104，重型組為8.2 × 104，危重型組為49，正常值參考范圍為1.0 × 105～9.0 × 106；（g）腸桿菌：普通型組豐度的中位值為1.1 × 104，重型組為8.6 × 104，危重型組為2.4 × 102，正常值參考范圍為1.0 × 105～9.0 × 106；（h）奇異菌：普通型組豐度的中位值為6.9× 106，重型組為4.3 × 106，危重型組為2.2 × 104，正常值參考范圍為1.0 × 103～9.0 × 106；（i）Ec/E值：普通型、重型和危重型組的中位值分別為0.4、0.7和3.3。用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖中的值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*：P < 0.05、**：P < 0.01、***：P < 0.001。Lg(copies·g?1)：每克糞便細(xì)菌拷貝數(shù)的lg值。

3.3. COVID-19 細(xì)菌豐度與臨床指標(biāo)相關(guān)性的研究

在10種優(yōu)勢菌群和COVID-19的臨床指標(biāo)之間進(jìn)行皮爾遜相關(guān)分析，評估腸道微生物的臨床價值（圖2）。產(chǎn)丁酸菌（BPB）與炎癥標(biāo)志物（CRP、WBC、淋巴細(xì)胞比例、中性粒細(xì)胞比例、IL-6）呈顯著正相關(guān)。

在普通型組中，酪酸梭菌與CRP水平呈負(fù)相關(guān)（皮爾遜相關(guān)系數(shù)R= ?0.5）。在重型組中，普拉梭菌和酪酸梭菌與中性粒細(xì)胞比例呈正相關(guān)（R= 0.5），而直腸真桿菌與IL-6水平呈正相關(guān)（R= 0.7）。在危重型組中，酪酸梭菌與CRP（R= ?0.7）和中性粒細(xì)胞比例（R= ?0.6）呈負(fù)相關(guān)，普拉梭菌與CRP呈負(fù)相關(guān)（R=?0.6）。

菌群變化也與肝功能標(biāo)志物ALT和AST濃度的變化有關(guān)。在普通型和重型患者中，條件致病菌腸球菌與AST呈正相關(guān)（R= 0.5和0.6）。重型患者血清腸桿菌濃度與ALT異常血清濃度呈正相關(guān)（R= 0.5）。在危重型組中，益生菌雙歧桿菌與ALT和AST呈負(fù)相關(guān)（R=? 0.6）。

圖2. 普通型（a）、重型（b）、危重型（c）COVID-19患者的腸道細(xì)菌與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。PT：凝血酶原時間；PTA：凝血酶原活動度；R：皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

部分菌群與器官功能指標(biāo)（D-二聚體、LDH、肌酸激酶）有關(guān)。在普通型組中，乳酸桿菌與凝血酶原時間（PT）呈負(fù)相關(guān)（R= ?0.6）。在危重型組中，雙歧桿菌與PT和LDH呈負(fù)相關(guān)（R= ?0.6和?0.5）。此外，在危重型組中，奇異菌與D-二聚體水平（R= ?0.5），以及雙歧桿菌與LDH和肌酸激酶水平（R= ?0.6）呈負(fù)相關(guān)。

3.4. 危重型患者腸道微生態(tài)衰竭

我們對7種有益菌進(jìn)行進(jìn)一步分析，其中包括益生菌（乳酸桿菌和雙歧桿菌）、抑炎菌（普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌、直腸真桿菌）和擬桿菌。如果以正常范圍的下限的1000倍作為閾值，則出現(xiàn)至少一種有益菌顯著減少，分別占普通型、重型和危重型患者的80%、84.2%和94.4%。危重型患者的腸道有益菌群出現(xiàn)顯著下降，10例患者（55.6%）表現(xiàn)為腸道微生態(tài)衰竭，即三種以上有益菌顯著減少。15例患者的腸道細(xì)菌總數(shù)減少，這些患者的7 d、14 d死亡率分別為26.7%和40%。

條件致病菌腸球菌和腸桿菌科細(xì)菌均為條件致病菌。存活者（49例）的Ec/E值的平均值為1.3 ± 2.5，而死亡患者（8例）為 3.3 ± 1.4（P< 0.05）。在18例危重型患者中，17例患者的Ec/E值出現(xiàn)了增加。

3.5. 產(chǎn)丁酸菌含量降低對危重型患者預(yù)后的影響

通過ROC曲線分析評估4種產(chǎn)丁酸菌（普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌）對危重型患者的預(yù)測價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌能較好地區(qū)分重型和危重型患者，且AUC分別為0.70 [95%置信區(qū)間（CI），0.50～0.89；特異性（SPE），0.44；靈敏度（SEN），0.93]、0.73（95%CI，0.54～0.92；SPE，0.84；SEN，0.62）、0.75（95%CI，0.57～0.92；SPE，0.88；SEN，0.57），和0.80（95%CI，0.61～0.98；SPE，0.71；SEN，0.92）；截斷值分別為6.4×104、2.2×103、7.8×104和2.8×103[圖3（a）]。4種產(chǎn)丁酸菌亦能較好地區(qū)分普通型和危重型患者，且AUC分 別 為0.87（95% CI，0.74～0.99；SPE，0.78；SEN，0.86）、0.81（95% CI，0.64～0.97；SPE，1.00；SEN，0.54）、0.81（95% CI，0.65～0.97；SPE，0.77；SEN，0.86）和0.82（95% CI，0.65～0.98；SPE，0.61；SEN，0.92）；截斷值分別為1.7×106、880、8.0×105和180 [圖3（b）]。

4. 討論

根據(jù)疾病嚴(yán)重程度，我們將COVID-19患者分為三組。結(jié)果顯示，危重型患者的年齡大于普通型和重型患者。此外，危重型患者表現(xiàn)出更多的合并癥，同時危重型患者的WBC、PCT、IL-6、D-二聚體、LDH和CRP的水平顯著高于其他兩組，然而這些指標(biāo)在普通型組和重型組之間沒有顯著差異。三組間血清ALT、AST、Cr水平無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

在我們的研究中，8例患者死亡（均為危重型患者），50.9%的患者接受了抗生素治療，而7例患者接受了益生菌治療。為了預(yù)防和控制繼發(fā)感染，抗生素的使用比例在重型和危重型組中相對較高。而檢測腸道微生物菌群組成的變化可以揭示COVID-19患者的腸道菌群失調(diào)情況，尤其針對重型組和危重型組患者，從而為經(jīng)驗性抗生素治療提供依據(jù)。

圖3. 產(chǎn)丁酸菌對COVID-19重型患者與危重型患者（a）以及普通型患者與危重型患者（b）的預(yù)測能力對比。

腸道作為人體最大的免疫器官，居住著大約1014個細(xì)菌[13]。腸道微生物菌群是必不可少的功能器官，參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、營養(yǎng)吸收代謝以及感染控制[14–16]。病毒感染、抗生素使用和化療等因素會導(dǎo)致腸道微生物菌群與宿主免疫系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)[1,3]。微生物菌群失調(diào)表現(xiàn)為腸道內(nèi)正常微生物菌群數(shù)量、種類和比例的異常變化，導(dǎo)致一系列病理生理反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者存在腸道菌群顯著改變，這與既往在H7N9患者中的發(fā)現(xiàn)類似，表現(xiàn)為乳酸桿菌、雙歧桿菌和產(chǎn)丁酸菌的豐度減少，以及機會性病原體，如腸球菌和腸桿菌的過度生長，同時這些菌群與疾病嚴(yán)重性密切相關(guān)[2]。

在本研究中，檢測的優(yōu)勢菌群在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。眾所周知，乳酸桿菌和雙歧桿菌可以產(chǎn)生乳酸，并在調(diào)節(jié)機體免疫和維持腸道屏障功能方面發(fā)揮重要作用[17,18]。普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌能產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA），有助于宿主抵抗腸道病原體定植和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。腸桿菌科細(xì)菌，特別是大腸桿菌（Escherichia coli）能產(chǎn)生各種毒力因子。因此，我們假設(shè)通過檢測COVID-19患者的腸道菌群的豐度，可反映COVID-19患者腸道微生態(tài)失調(diào)情況，其中包括菌群組成和功能變化。

我們發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的豐度接近或低于正常范圍下限（圖1），尤其在重型組中，這與既往在重型H7N9患者中的發(fā)現(xiàn)類似[2]。此外，在部分患者中未檢測到乳酸桿菌。在危重型組患者中，雙歧桿菌的豐度與ALT、AST、LDH水平呈負(fù)相關(guān)，提示雙歧桿菌與臟器功能，如肝功能及心功能密切相關(guān)。

在大多數(shù)COVID-19患者中，產(chǎn)丁酸菌，如普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌表現(xiàn)為菌群豐度下降。這些菌群豐度的中位數(shù)在普通型組和重型組患者中接近正常參考范圍的下限，而在危重型組患者中顯著低于正常參考范圍的下限。丁酸能抑制條件致病菌過度生長、維持腸道黏膜屏障的完整性、激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答、增強機體抗病毒免疫力[19,20]。體外研究表明，丁酸可以調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的數(shù)量和功能，并促進(jìn)輔助T細(xì)胞（Th17和Th1）的活化[21]。此外，機體炎癥反應(yīng)的強度，特別是細(xì)胞因子風(fēng)暴與COVID-19患者的病情加重相關(guān)[22]。這些研究表明，產(chǎn)丁酸菌在抵抗SARS-CoV-2感染中發(fā)揮重要作用。抑炎菌豐度的減少往往提示患者病情愈加嚴(yán)重。重型患者中產(chǎn)丁酸菌豐度的降低可能與宿主免疫力降低和炎癥反應(yīng)有關(guān)。產(chǎn)丁酸菌豐度與外周血炎癥標(biāo)志物的相關(guān)性分析提示，普通型組患者中酪酸梭菌和CRP水平呈負(fù)相關(guān)（R= ?0.5），而危重型組患者中酪酸梭菌和CRP（R= ?0.7）、酪酸梭菌和中性粒細(xì)胞比例（R= ?0.6）、普拉梭菌和CRP（R= ?0.6）呈負(fù)相關(guān)。因此，產(chǎn)丁酸菌豐度的減少可能加重病毒性肺炎的炎癥反應(yīng)，并可能與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，普拉梭菌、酪酸梭菌、柔嫩梭菌和直腸真桿菌的菌群變化情況可用于預(yù)測疾病嚴(yán)重程度。產(chǎn)丁酸菌豐度的變化可以準(zhǔn)確區(qū)分危重型組和普通型組患者，另外，微生物菌群特征可能是預(yù)測疾病嚴(yán)重程度的有力工具。

Qin等[2]發(fā)現(xiàn)H7N9患者的普拉梭菌和直腸真桿菌的豐度顯著下降，提示COVID-19患者中產(chǎn)丁酸菌的減少可能與呼吸道病毒感染的炎癥發(fā)病機制有關(guān)，并與細(xì)胞因子釋放綜合征有關(guān)。在COVID-19早期階段給予針對性的微生態(tài)制劑治療，有助于減少重型和危重型患者人數(shù)。值得注意的是，酪酸梭菌在COVID-19患者中表現(xiàn)為豐度減少，但在H7N9患者中豐度增加。因此需要更多的研究來闡明病毒感染對腸道有益菌的影響。

條件致病菌，如腸球菌和腸桿菌可通過受損的腸道屏障進(jìn)入血液并引起感染。此外，條件致病菌的過度生長易導(dǎo)致腸道菌群進(jìn)一步失調(diào)、腸道上皮屏障破壞和繼發(fā)感染的發(fā)生[5,23,24]。在本研究中，73.7%（42/57）患者的Ec/E值增加，特別是危重型患者。同時，該比值在普通型和重型患者之間存在顯著性差異。死亡組與存活組之間也存在顯著性差異。危重型患者的腸桿菌明顯減少，這可能與抗菌藥物的使用有關(guān)。危重型患者的碳青霉烯、頭孢菌素類等抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致腸道內(nèi)腸桿菌的豐度下降，同時也造成Ec/E值的增高，進(jìn)一步造成腸道菌群失調(diào)[1]。重型患者的腸球菌豐度與血清ALT水平呈正相關(guān)（R= 0.5）。除了繼發(fā)真菌感染外，應(yīng)注意萬古霉素耐藥腸球菌血流感染在晚期并發(fā)癥中的發(fā)生率[25]。防止腸道細(xì)菌易位是COVID-19治療和預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥的一個重要手段。然而，經(jīng)驗性抗生素預(yù)防會破壞腸道菌群穩(wěn)態(tài)，是繼發(fā)性細(xì)菌和真菌感染的危險因素。微生態(tài)制劑治療目前在急性感染性疾病的研究中沒有得到足夠的重視[26]。在我們的隊列中，少數(shù)患者使用了益生菌制劑來改善腸道微生物菌群并維持腸道屏障的完整性。

Qin等[2]對40例H7N9患者和健康人群的腸道菌群進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)H7N9患者中擬桿菌豐度減少，腸桿菌、腸球菌等病原菌豐度增加。與之類似的是，在我們研究的COVID-19重型和危重型患者中，擬桿菌的豐度顯著減少。腸道中擬桿菌對宿主有益，但易位時可引起顯著的病理改變[27]。此外，擬桿菌可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸有助于改善腸道功能，調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡和宿主免疫系統(tǒng)[28]。然而，一些擬桿菌屬可能引起感染。目前擬桿菌屬在COVID-19中的作用機制尚不清楚 [29]。

菌群豐度的變化與臟器功能相關(guān)血清標(biāo)志物，如D-二聚體、LDH和肌酸激酶等有關(guān)。例如，在普通型患者中，乳酸桿菌的豐度與PT呈負(fù)相關(guān)（R= ?0.6）。在危重型組中，雙歧桿菌的豐度與PT（R= ?0.6）和LDH（R=?0.5）呈負(fù)相關(guān)，奇異菌的豐度與D-二聚體、擬桿菌和LDH、肌酸激酶均呈負(fù)相關(guān)。因此，腸道菌群失調(diào)可能導(dǎo)致血液學(xué)指標(biāo)的改變[30]。

在本研究中，通過q-PCR監(jiān)測了10種腸道優(yōu)勢菌群的含量，與第二代測序相比，q-PCR具有快速、易于使用、可靠的優(yōu)點[31]。及早識別微生態(tài)失衡有助于臨床醫(yī)生實施有效的診斷和治療，減少由于腸道微生態(tài)失調(diào)甚至衰竭引起的疾病加重，并改善治療過程。SARSCoV-2通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體進(jìn)入宿主細(xì)胞[32]。ACE2受體存在于幾乎所有人體細(xì)胞中，據(jù)報道，在糞便中可檢測到SARS-CoV-2 [9,33]。我們推測腸道菌群失調(diào)增加了病毒感染的風(fēng)險，因為微生物有助于維持腸道黏膜的完整性。鑒于腸道微生物菌群在COVID-19患者中的重要作用，包括抗病毒應(yīng)答和預(yù)防感染，明確病毒感染與腸道微生物菌群之間的相互作用機制及其對SARS-CoV-2感染宿主反應(yīng)的影響是至關(guān)重要的。

5. 結(jié)論

研究結(jié)果表明，10種腸道優(yōu)勢菌群變化與COVID-19患者血液學(xué)參數(shù)之間存在潛在的相關(guān)性。本研究首次使用Ec/E值預(yù)測危重型患者的死亡。

致謝

本研究獲浙江省重點研發(fā)計劃應(yīng)急項目（2020C03123）、國家“十三五”科技重大專項“突發(fā)急性重癥呼吸道傳染病救治新技術(shù)和新方案研究”（2017ZX10204401）和浙江省自然科學(xué)基金（LED20H190001）的支持。

Compliance with ethics guidelines

Lingling Tang, Silan Gu, Yiwen Gong, Bo Li, Haifeng Lu, Qiang Li, Ruhong Zhang, Xiang Gao, Zhengjie Wu,Jiaying Zhang, Yuanyuan Zhang, and Lanjuan Li declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.05.013.