SARS-CoV-2 侵入因子——ACE2 和TMPRSS2 在圍著床期胚胎和母胎界面存在表達(dá)

陳偉，袁鵬，楊銘 ，嚴(yán)智強，孔思明，嚴(yán)杰，柳溪溪，陳依東，喬杰,f,g,h,*，閆麗盈

a Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China

b Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), Ministry of Education, Beijing 100191, China

c Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China

d Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, Beijing 100871, China

e Peking–Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China

f National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, Beijing 100191, China

g Beijing Advanced Innovation Center for Genomics, Beijing 100871, China

h Research Units of Comprehensive Diagnosis and Treatment of Oocyte Maturation Arrest, Beijing 100191, China

1. 引言

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）在全世界蔓延，截至2020年6月29日，全世界報道的確診病例超過1000萬，死亡病例超過50萬。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）是一種鋅金屬肽酶，最早于2000年被發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與心功能、高血壓和糖尿病密切相關(guān)[1,2]。ACE2被認(rèn)為是SARSCoV和SARS-CoV-2的受體[3,4]，而跨膜絲氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine 2, TMPRSS2）則是一種能夠激發(fā)SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）的絲氨酸蛋白酶[5]。ACE2陽性表達(dá)的器官也因此被認(rèn)為面臨著較高的感染風(fēng)險[6]。ACE2表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞[7]、少量的II型肺泡（type II alveolar, AT2）細(xì)胞[8]和呼吸道上皮細(xì)胞[6]。也有報道稱，ACE2在心肌細(xì)胞、回腸和食道的上皮細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞和膀胱尿路上皮細(xì)胞中高表達(dá)[6]。

母體免疫系統(tǒng)在妊娠期間整體上會轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种茽顟B(tài)，以避免對作為同種異體移植物的胎兒發(fā)生排斥[9]，但這也使母體受各類病毒感染的風(fēng)險增加[10]。胎盤是阻止病毒的母嬰傳播的重要屏障之一[11]。有報道稱，ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞分布于母胎界面的多種細(xì)胞類群中，比如絨毛中的合胞滋養(yǎng)層（syncytiotrophoblast,STB）細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層（cytotrophoblast, CTB）細(xì)胞，蛻膜中血管外周（decidual perivascular, dP）細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)（decidual stromal, dS）細(xì)胞、內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞[12,13]。在STB中，ACE2能夠調(diào)控血管緊張素（angiotensin 1-7, Ang 1-7）以釋放到母體循環(huán)中促進(jìn)母體血管舒張[12]。既往研究報道，在感染了SARS-CoV或SARS-CoV-2的孕婦所分娩的新生兒中[14–16]，以及在感染了SARS-CoV和SARS-CoV-2患者的子宮中均未檢出SARS-CoV和SARS-CoV-2 [14,17]。但是最近有兩項研究聲稱，在三例新生兒血液樣本中檢測到SARSCoV-2特異性的免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）[18,19]。因為IgM抗體一般不能通過胎盤傳遞給胎兒，通常在感染后的3～7 d產(chǎn)生，這提示盡管胎兒體內(nèi)的病毒檢測結(jié)果為陰性，但宮內(nèi)感染的可能性依舊存在。胚胎植入前后在形態(tài)和分子水平上經(jīng)歷顯著變化[20–22]，胚胎受精后6 d（D6）左右從透明帶中孵出，并將直接暴露于子宮內(nèi)膜腔[23]，因此植入前后的胚胎受SARSCoV-2侵襲的潛在風(fēng)險仍有待闡明。

為了更好地了解SARS-CoV-2垂直傳播的潛在風(fēng)險，我們從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平對植入前后胚胎和母胎界面中ACE2和TMPRSS2的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，以期闡明SARS-CoV-2在母胎間宮內(nèi)垂直傳播的可能性與理論基礎(chǔ)。

2. 材料和方法

2.1. 數(shù)據(jù)下載與處理

植入前胚胎數(shù)據(jù)從已發(fā)表的文章[24]中下載，圍著床期胚胎數(shù)據(jù)則從另一篇已發(fā)表文章[22]中下載。利用STAR [25]對植入前胚胎的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗并映射至人類參考基因組參考序列（版本37），表達(dá)量采用每百萬已映射讀段中映射到外顯子的每千堿基上的片段數(shù)（fragments per kilobase per million, FPKM）進(jìn)行衡量。圍著床期胚胎數(shù)據(jù)的處理方法則如已發(fā)表文章[22]所述。蛻膜細(xì)胞和絨毛細(xì)胞的Smart-seq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（RNA轉(zhuǎn)錄本5′端轉(zhuǎn)換機制——switching mechanism at 5′ end of the RNA transcript-sequencing, SMART）的基因表達(dá)矩陣及相關(guān)細(xì)胞類型注釋文件分別從兩篇已發(fā)表文章[26,27]中下載。人母胎界面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組droplet scRNA-seq數(shù)據(jù)的原始矩陣和細(xì)胞類型注釋文件來源于已發(fā)表的數(shù)據(jù)[27]。

2.2. ACE2 和TMPRSS2 基因陽性表達(dá)的定義

在Smart-seq2數(shù)據(jù)集中，將基因表達(dá)水平[每百萬條已映射讀段中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目（transcripts per kilobase million, TPM）]大于或等于1的細(xì)胞定義為陽性表達(dá)細(xì)胞。在droplet scRNA-seq數(shù)據(jù)中，計數(shù)大于0的細(xì)胞定義為陽性表達(dá)細(xì)胞。

2.3. 差異表達(dá)基因計算和基因本體論分析

具有不同ACE2表達(dá)水平的細(xì)胞類群間的差異表達(dá)基因（DEG）是通過“Seurat v3.0”包[28]中的“Find-Markers”函數(shù)進(jìn)行鑒定的，具體參數(shù)為：logfc. threshold = log(2)、min.pct = 0.4、test.use =“roc”、only.pos= F?；虮倔w論（gene ontology, GO）富集分析是利用“clusterProfiler（3.8.1）”包中的“enrichGO”函數(shù)進(jìn)行的[29]，具體參數(shù)為：ont =“BP”、pvalueCutoff = 0.05、pAdjustMethod =“BH”、qvalueCutoff = 0.1、readable =T。使用R包“VennDiagram（1.6.20）”和“UpSetR（1.3.3）”來展示不同組別的DEG、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路或GO條目之間的相互關(guān)系[30,31]。使用R（3.5.2版）進(jìn)行所有這些分析。

2.4. 胚胎和絨毛性別的鑒定

通過由15個Y染色體特異性表達(dá)的基因來確定每個胚胎和絨毛樣品的性別，包括：RBMY2FP、RBMY1B、TTTY15、KDM5D、RBMY1J、RBMY1F、RBMY1D、RBMY1E、TSPY4、TSPY2、TSPY8、TSPY1、RPS4Y1、EIF1AY和DDX3Y。我們需要確定整體樣本的性別，因此首先計算了單個細(xì)胞內(nèi)Y染色體特異性表達(dá)基因的表達(dá)水平總和。有85%或以上細(xì)胞達(dá)到閾值的胚胎將被定義為雄胚[Y染色體（chrY）特異性表達(dá)基因水平總和≥ 100]。另外，有65%或以上的細(xì)胞達(dá)到閾值的絨毛樣品將被定義為雄胚[在Smart-seq2樣本中總chrY基因表達(dá)量≥ 5（TPM），在droplet scRNA-seq的數(shù)據(jù)中總chrY基因表達(dá)量≥ 1]。

2.5. 統(tǒng)計分析

對于箱點圖，使用Wilcoxon秩和檢驗計算兩組間的顯著性差異。使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析圍著床期D6胚胎中ACE2和TMPRSS2表達(dá)之間的相關(guān)性。

3. 結(jié)果

3.1. 圍著床期胚胎SARS-CoV-2 感染的潛在風(fēng)險

我們先前的研究全面繪制了人類植入前和圍著床期胚胎在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄動態(tài)圖譜[22,24]。ACE2是SARS-CoV-2的細(xì)胞受體，因此為了研究植入前和圍著床期胚胎的潛在感染風(fēng)險，我們根據(jù)之前的研究[22,24]進(jìn)一步分析了卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段胚胎中ACE2的表達(dá)模式。我們發(fā)現(xiàn)，ACE2在植入前胚胎的各個發(fā)育階段均有表達(dá)，表達(dá)水平在合子期最高，并從4細(xì)胞階段開始急劇下降，直至桑椹胚階段已基本檢測不到，但在囊胚（blastocyst, Bst）階段其表達(dá)水平重新升高[圖1（a）]。在圍著床期胚胎中，ACE2主要在受精后第6天胚胎的滋養(yǎng)外胚層（day 6 trophectoderm, D6_TE）、第10天胚胎的原始內(nèi)胚層（day 10 primitive endoderm, D10_PE）和第12天胚胎的原始內(nèi)胚層（day 12 primitive endoderm, D12_PE）細(xì)胞中表達(dá)[圖1（b）]。由于SARSCoV-2進(jìn)入細(xì)胞還依賴于ACE2和TMPRSS2的共表達(dá)[5]，因此研究了圍著床期胚胎中TMPRSS2的表達(dá)。TMPRSS2在TE譜系細(xì)胞類群中高表達(dá)，并且在D6_TE細(xì)胞中的表達(dá)水平最高[圖1（c）、（d）]。得益于單細(xì)胞測序，我們可以了解在不同發(fā)育階段細(xì)胞間的異質(zhì)性。接下來，總結(jié)了在各發(fā)育階段，ACE2和TMPRSS2陽性表達(dá)細(xì)胞（TPM ≥1）的比例。ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例在D6_TE細(xì)胞類群中最高（38.9%），而在上胚層細(xì)胞類群中，ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例很低。和ACE2表達(dá)水平的觀察結(jié)果一致，D10_PE細(xì)胞也具有較高的ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例[圖1（e）]。有趣的是，TMPRSS2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例在D6_TE細(xì)胞類群中同樣是最高的（74.1%），而在上胚層（epiblast, EPI）和PE譜系細(xì)胞類群中則相對較低[圖1（f）]。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，D6_TE中的ACE2和TMPRSS2共表達(dá)細(xì)胞的比例在各細(xì)胞類群中最高（33.3%）[圖1（g）]，而且在194個ACE2陽性表達(dá)的TE細(xì)胞中有166個同時表達(dá)了TMPRSS2。在圍著床期胚胎中，D6雌胚TE中的ACE2與TMPRSS2表達(dá)水平之間的相關(guān)性最高[圖1（h）]。在92個ACE2陽性表達(dá)的D6雌胚TE細(xì)胞中，有80個也同時表達(dá)TMPRSS2[圖1（i）]。以上結(jié)果表明，發(fā)育第6天的囊胚可能相對易受SARS-CoV-2感染，在圍著床期胚胎發(fā)育過程中存在SARS-CoV-2感染的潛在風(fēng)險。

3.2. 母胎界面發(fā)生SARS-CoV-2 感染的潛在風(fēng)險

為了評估胚胎植入后發(fā)生SARS-CoV-2垂直傳播的潛在風(fēng)險，我們基于已發(fā)表的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26,27]檢測了母胎界面上ACE2基因的表達(dá)水平。先前的研究詳細(xì)解析了母胎界面上不同類群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征，本文采用了先前研究中對每一細(xì)胞類型的已有定義。ACE2和TMPRSS2基因的表達(dá)水平在母胎界面上不同細(xì)胞類型間具有高度異質(zhì)性（見附錄A中的圖S1和S2）。基于droplet scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，孕婦外周血中未檢出ACE2陽性表達(dá)的細(xì)胞類群。ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞占比最大的4類細(xì)胞群分別為蛻膜血管周細(xì)胞（dP1和dP2，1和2表示不同的細(xì)胞亞型）、絨毛中的STB和CTB [分別為10%、5%、9%和5%；圖S3（a）和表S1]。基于Smart-seq2數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析顯示，ACE2陽性表達(dá)的蛻膜細(xì)胞類型比例最高的是Endo（L）（占所有5個細(xì)胞的20%）和dP（占84個細(xì)胞的13%）[圖2（a）和表S2]。此外，盡管ACE2在各自細(xì)胞類群中的占比較低，但是在蛻膜自然殺傷細(xì)胞（decidual natural killer, dNK,1%）和蛻膜巨噬細(xì)胞（decidual macrophages, dM, 1%）中也存在ACE2陽性表達(dá)的細(xì)胞（表S2）。在絨毛細(xì)胞類群中，整體的ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的占比為8.5%，而在6類主要絨毛細(xì)胞類群中，ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞在STB和CTB中占比最高（STB_8W：41%和CTB_8W：20%）[圖2（b）和表S3]。相較于droplet scRNA-seq的數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果，此處ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞比例的顯著增加，可能是由于更高的測序深度使得表達(dá)水平較低的ACE2也能夠被檢出。值得注意的是，在從妊娠24周的胎盤蛻膜面富集的絨毛外滋養(yǎng)層（EVT_24W）細(xì)胞中，ACE2陽性表達(dá)的細(xì)胞占比達(dá)到63%，這要遠(yuǎn)高于妊娠8周的絨毛外滋養(yǎng)層（EVT_8W, 3%）細(xì)胞[圖2（b）及表S3]。和ACE2相似，我們同樣能夠在上述提及的絨毛以及蛻膜的細(xì)胞類群中檢測到TMPRSS2基因的表達(dá)，其中TMPRSS2陽性表達(dá)細(xì)胞占比最高的細(xì)胞類群分別為STB_8W（26%）、EVT_24W（19%）和腺狀上皮細(xì)胞（Epi, 19%）[圖S3（b）～（d）和表S1～S3]。ACE2和TMPRSS2的共表達(dá)主要存在于STB_8W和EVT_24W [13%和14%；圖2（c）和表S3]，而在其他蛻膜細(xì)胞類群中并未觀察到[圖2（d）和表S2]。這表明絨毛中的STB和蛻膜中的EVT均易感染SARS-CoV-2。以上結(jié)果表明，由于母胎界面上存在ACE2和TMPRSS2雙陽性表達(dá)細(xì)胞，因此妊娠期內(nèi)存在發(fā)生SARS-CoV-2垂直傳播的潛在風(fēng)險。

圖1. 植入前和圍著床期胚胎中ACE2和TMPRSS2的表達(dá)模式。（a）不同階段植入前胚胎中ACE2的表達(dá)水平；（b）不同階段圍著床期胚胎中ACE2的表達(dá)水平；（c）不同階段植入前胚胎中TMPRSS2的表達(dá)水平；（d）不同階段圍著床期胚胎中TMPRSS2的表達(dá)水平；（e）不同階段圍著床期胚胎中ACE2陽性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞的比例；（f）不同階段圍著床期胚胎中TMPRSS2陽性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞的比例；（g）不同階段圍著床期胚胎中具有不同ACE2和TMPRSS2表達(dá)模式的細(xì)胞比例（double_pos：ACE2和TMPRSS2均為陽性表達(dá)的細(xì)胞；only_ACE2_pos：ACE2陽性表達(dá)但不表達(dá)TMPRSS2的細(xì)胞；only_TMPRSS2_pos：TMPRSS2陽性表達(dá)但不表達(dá)ACE2的細(xì)胞；double_neg：TMPRSS2和ACE2均為陰性表達(dá)的細(xì)胞）；（h）D6 圍著床期胚胎中ACE2和TMPRSS2表達(dá)之間的相關(guān)性，R表示斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)；（i）D6圍著床期期胚胎中ACE2和TMPRSS2陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目。Bst：囊胚；ysTE：卵黃囊滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。誤差線代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。

圖2. ACE2和TMPRSS2在早期母胎界面的表達(dá)模式。（a）不同蛻膜細(xì)胞類群中ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞的比例；（b）不同絨毛細(xì)胞類群中ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞的比例；（c）不同絨毛細(xì)胞類群中，在ACE2和TMPRSS2表達(dá)水平上存在差異的各細(xì)胞亞群的比例；（d）不同的蛻膜細(xì)胞類群中，在ACE2和TMPRSS2表達(dá)水平上存在差異的各細(xì)胞亞群的比例。DC：樹突細(xì)胞；dM：蛻膜巨噬細(xì)胞；dNK：蛻膜自然殺傷細(xì)胞；dP：蛻膜血管外周細(xì)胞；dS：蛻膜間質(zhì)細(xì)胞；Endo：內(nèi)皮細(xì)胞；Epi：腺狀上皮細(xì)胞；ILC：固有淋巴細(xì)胞；STB：合胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；CTB：絨毛內(nèi)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞；EVT：絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞；Marc：胎兒巨噬細(xì)胞（也稱霍夫鮑爾細(xì)胞）；Mes：間充質(zhì)細(xì)胞；L：淋巴；m：孕婦；p：增殖；CD16也被稱為FcγRIII，屬于免疫球蛋白超家族（IgSF），CD16+/?表示在免疫熒光染色中呈現(xiàn)CD16陽性或陰性表達(dá)的細(xì)胞；T細(xì)胞：胸腺依賴性淋巴細(xì)胞。

3.3. 不同細(xì)胞類群中ACE2 陽性表達(dá)細(xì)胞的共同特征

如同前文所述，D6雌胚的TE細(xì)胞、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞是受SARS-CoV-2感染風(fēng)險最高的三種細(xì)胞類群。為了進(jìn)一步探究這些細(xì)胞類群的特征，我們對這三個細(xì)胞類群中ACE2陽性表達(dá)和陰性表達(dá)細(xì)胞亞型之間的DEG進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析（詳細(xì)內(nèi)容見表S4和表S5）。在隨后的整合分析中，我們發(fā)現(xiàn)不同富集列表中存在共同的DEG、GO和通路條目[圖3（a）與圖S4（a）、（b）]。GO分析顯示，三組表達(dá)上調(diào)的DEG中均存在“病毒生命周期”（viral life cycle）“利用自噬機制的過程”（utilizing autophagic mechanism）和“膜融合”（membrane fusion）過程富集，其中前兩個過程甚至存在于所有的五組富集分析結(jié)果中[圖3（b）、圖S4（c）和圖S5]。同時，“鞘脂代謝”（sphingolipid metabolism）是三個上調(diào)DEG富集組中共有的KEGG通路，“溶酶體”（lysosome）在5個富集分析組中均存在富集[圖3（c）和圖S6]。許多研究曾報道，“鞘脂代謝”和“溶酶體”相關(guān)機制參與了病毒感染及相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答過程[32–35]。這表明ACE2陽性表達(dá)和ACE2陰性表達(dá)的細(xì)胞除了對SARS-CoV-2的易感性不同外，它們對病毒感染的應(yīng)答狀態(tài)也可能不同。3類細(xì)胞的比較組中存在的與免疫和病毒相關(guān)的GO富集條目[圖S7（a）]，同樣支持了我們的這一猜想。而且這些條目中涉及的DEG包含許多已經(jīng)報道的干擾素應(yīng)答基因（IFN-stimulated gene,ISG）以及參與炎癥和病毒感染防御的基因[圖S7（b）～（g）]。此外，EVT_24W或STB_8W細(xì)胞類群中的ACE2陽性表達(dá)和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞可能在代謝方面存在差異，因為對應(yīng)的DEG在相關(guān)代謝過程/通路上也存在富集，如“膽固醇代謝過程調(diào)控”（regulation of cholesterol metabolic process）的GO條目和“甾體生物合成”（steroid biosynthesis）的KEGG通路[圖S4（c）和圖S6（a）]。在3類ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞中共有12個表達(dá)水平均顯著上調(diào)的DEG [圖3（d）]，其中MDK、UGCG和RAB25與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和細(xì)胞遷移等過程密切相關(guān)。綜上所述，與ACE2陰性表達(dá)的細(xì)胞相比，D6雌胚的TE細(xì)胞、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞類群中ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞存在一定的共性差異，這展示了潛在的對SARS-CoV-2易感的早期和后期滋養(yǎng)外胚層譜系細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上的共同特征。

圖3. 在D6雌胚TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞中，ACE2陽性表達(dá)和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞亞群間的差異基因和富集的生物學(xué)過程/通路。（a）在D6雌胚TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞中，細(xì)胞類型特異性或細(xì)胞間共有的GO富集條目的數(shù)量；（b）在D6雌胚TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞中，表達(dá)水平上調(diào)的DEG共有的GO富集條目；（c）在D6雌胚TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞中，表達(dá)水平上調(diào)的DEG共有的KEGG富集通路；（d）在D6雌胚TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞中，表達(dá)水平上調(diào)的DEG共有的DEG數(shù)量。

3.4. 圍著床期胚胎和絨毛細(xì)胞類群中ACE2 表達(dá)的性別差異

由于ACE2基因位于X染色體上，并且是染色體失活的逃逸基因[36]，我們推測由于雄胚和雌胚中的X染色體拷貝數(shù)不同，ACE2基因的表達(dá)水平可能存在差異。通過比較不同性別胚胎，我們發(fā)現(xiàn)，在D6雌胚的TE和PE細(xì)胞中，ACE2的表達(dá)水平較高，但在植入后發(fā)育的后期并不高[圖4（a）]。除了圍著床期胚胎的D12 TE細(xì)胞外，TMPRSS2基因表達(dá)水平在雄胚與雌胚間并無顯著差異[圖4（b）]。我們同樣比較了ACE2和TMPRSS2基因在后續(xù)不同性別的絨毛細(xì)胞中的表達(dá)水平。在droplet scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，我們鑒定出3個絨毛樣本源自雄胚。ACE2的表達(dá)水平在ACE2陽性表達(dá)的STB和CTB細(xì)胞亞群中存在顯著的性別差異，但在TMPRSS2陽性表達(dá)細(xì)胞中，TMPRSS2基因的表達(dá)水平并無性別差異[圖4（c）、（d）及圖S8（a）]。Smart-seq2數(shù)據(jù)中僅有1例雄胚絨毛樣本，在STB_8W和EVT_8W細(xì)胞類群中觀察到的結(jié)果與植入后胚胎的TE細(xì)胞相似，并無明顯的性別偏差[圖S8（b）～（d）]?？傊?，ACE2表達(dá)水平整體上在植入后胚胎中并未顯示出性別偏差，但其在D6雌胚的TE和PE細(xì)胞中表達(dá)水平的升高以及陽性表達(dá)的STB和CTB細(xì)胞亞群表現(xiàn)出的性別差異，表明D6胚胎以及妊娠期間的不同性別胚胎對SARS-CoV-2的易感性可能存在差異。

圖4. 不同性別的圍著床期胚胎和絨毛細(xì)胞類群中ACE2的表達(dá)水平。（a）不同性別的圍著床期胚胎的各細(xì)胞類群中ACE2的表達(dá)情況；（b）不同性別的圍著床期胚胎的各細(xì)胞類群中TMPRSS2的表達(dá)情況；（c）droplet scRNA-seq數(shù)據(jù)中不同性別絨毛細(xì)胞的ACE2陽性表達(dá)亞群中ACE2的表達(dá)情況；（d）droplet scRNA-seq數(shù)據(jù)中不同性別絨毛細(xì)胞的TMPRSS2陽性表達(dá)亞群中TMPRSS2的表達(dá)情況。Nor_count：歸一化后的片段數(shù)；HB：霍夫鮑爾細(xì)胞；fFB1：胎兒成纖維細(xì)胞類群1。采用Wilcoxon秩和法計算兩組間的p值。

4. 討論

新冠病毒肺炎（COVID-19）大流行對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。考慮到SARS-CoV-2感染相關(guān)的妊娠并發(fā)癥及其對子宮內(nèi)胎兒發(fā)育的潛在不良影響，因此需要特別關(guān)注妊娠期罹患COVID-19的孕婦患者。SARSCoV-2能否感染胚胎或胎盤，干擾妊娠的建立或維持，以及垂直傳播是否存在均是熱門話題。在本研究中，我們?nèi)娣治隽瞬煌l(fā)育階段的植入前后胚胎及母胎界面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，具體闡述了ACE2、TMPRSS2及其他與SARS-CoV-2感染相關(guān)的分子的表達(dá)特征。我們發(fā)現(xiàn)較大比例的D6雌胚的TE、STB_8W和EVT_24W細(xì)胞類群中存在ACE2和TMPRSS2的共表達(dá)現(xiàn)象。同時我們也在這3類受SARS-CoV-2感染風(fēng)險最高的細(xì)胞類群中觀察到了共同的DEG、GO條目和KEGG通路，這表明ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞相較于ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞在“溶酶體”、自噬相關(guān)過程以及免疫和病毒相關(guān)過程存在較為保守的改變。此外，我們還揭示了ACE2高表達(dá)于D6雌胚的TE和PE細(xì)胞類群中，并且在ACE2陽性表達(dá)的STB細(xì)胞中同樣呈現(xiàn)出顯著的性別差異?？傮w而言，本研究首次在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上展示了ACE2在圍著床期胚胎和母胎界面細(xì)胞類群中的表達(dá)模式，提示了在圍著床期和妊娠期存在SARS-CoV-2垂直傳播的潛在風(fēng)險。

ACE2在圍著床期胚胎各譜系細(xì)胞中存在表達(dá)。D6 TE細(xì)胞中ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例最高，其他譜系相對較低。TMPRSS2陽性表達(dá)細(xì)胞的比例和ACE2/TMPRSS2共表達(dá)細(xì)胞的比例在D6 TE細(xì)胞中同樣是最高的，這表明發(fā)育第6天的胚胎對SARS-CoV-2易感性可能相對較高。然而其他發(fā)育階段的胚胎依然存在ACE2表達(dá)，盡管表達(dá)水平相對較低，但仍然存在感染的可能性。這同樣提示在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過程中存在潛在的SARS-CoV-2感染風(fēng)險。

在母胎界面中，CTB、STB、EVT和dP細(xì)胞類群中的ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞的占比較高，STB_8W和EVT_24W中的ACE2和TMPRSS2共表達(dá)細(xì)胞的占比最高。正如我們所知，CTB由TE發(fā)育而來，進(jìn)而可分化為STB和EVT。前者被母體血液浸潤，后者則侵入子宮螺旋動脈[23,37]。據(jù)此前發(fā)表的一項研究[38]，在來自205名患者的307個血液樣本中，檢測到三個SARSCoV-2陽性樣本，盡管檢出率很低。由于STB直接暴露在母體血液中，因此血液中存在的病毒很可能會感染STB。EVT存在于蛻膜與血管壁中，因此也存在較高的感染風(fēng)險。雖然ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞在EVT_24W中的比例要遠(yuǎn)高于EVT_8W，但妊娠不同階段的垂直傳播風(fēng)險是否具有差異仍有待評估。綜上所述，這些結(jié)果表明了妊娠期間SARS-CoV-2垂直傳播的潛在風(fēng)險。

2013年6月從佛山當(dāng)?shù)胤N植的“鴻運金鉆蔓綠絨”快速繁殖無性系群體中篩選到10 株變異株，與親本“鴻運金鉆蔓綠絨”相比，顏色更加豐富鮮艷。對1 株變異單株進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖、栽培和育種目標(biāo)性狀穩(wěn)定性觀察，結(jié)果表明，突變單株易工廠化繁殖、后代性狀穩(wěn)定，綜合性狀好，符合育種目標(biāo)，命名為“鴻福金鉆蔓綠絨”(表1)。

雖然尚無直接證據(jù)證明SARS-CoV-2的垂直傳播，但The Journal of the American Medical Association（JAMA）發(fā)表的兩項研究報道了3例新生兒存在SARSCoV-2 IgM抗體陽性，這暗示了垂直傳播存在的可能性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)母胎界面存在ACE2和TMPRSS2表達(dá)雙陽性的細(xì)胞，這為妊娠期間發(fā)生SARS-CoV-2垂直傳播提供了理論上的可能性。如果孕婦在懷孕初期感染了SARS-CoV-2，則應(yīng)加強對母嬰的健康監(jiān)測。因此，SARS-CoV-2是否存在垂直傳播可能會直接影響受感染孕婦的臨床治療方案。本研究希望為孕婦的臨床診療提供理論依據(jù)，而垂直傳播的直接證據(jù)仍需臨床病例的進(jìn)一步積累和相關(guān)基礎(chǔ)研究的確認(rèn)。

我們對3類具有SARS-CoV-2的高感染風(fēng)險的細(xì)胞類群（D6雌胚的TE、EVT_24W和STB_8W細(xì)胞類群）中ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞的差異基因做了進(jìn)一步分析。我們發(fā)現(xiàn)一些病毒相關(guān)以及細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)過程和通路在這3種細(xì)胞類群中均存在富集。GO條目：“利用自噬機制的過程”（process utilizing autophagic mechanism）和KEGG通路：“溶酶體”（Lysosome）在全部5個DEG組中均能夠觀察到。而自噬作為一個“溶酶體”依賴的過程，被認(rèn)為在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抵御病毒感染方面發(fā)揮重要作用[39,40]。許多研究表明，病毒在侵襲細(xì)胞期間可能會劫持在進(jìn)化上十分保守的自噬機制以促進(jìn)感染過程[41,42]。在不同階段的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞譜系中，我們發(fā)現(xiàn)ACE2陽性表達(dá)和ACE2陰性表達(dá)細(xì)胞之間存在差異，并且均存在一些涉及自噬過程的變化，從這點上我們認(rèn)為將自噬過程作為治療SARS-CoV-2感染策略中的靶標(biāo)之一是具有一定合理性的[43]。我們還發(fā)現(xiàn)這3個細(xì)胞類群中的DEG均在免疫和對病毒防御應(yīng)答相關(guān)生物過程中存在富集。在GO條目中，這些富集的生物學(xué)過程包含許多ISG。Ziegler等[44]表示ACE2實際上是一個被忽略的ISG，這部分解釋了ACE2和這些ISG在3個細(xì)胞類群中的協(xié)同變化。

X染色體失活（XCI）是平衡雄性（XY）和雌性（XX）X染色體表達(dá)劑量的關(guān)鍵表觀遺傳機制。作為逃逸基因，曾有報道稱ACE2顯示出性別差異[36]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)D6雌胚的TE細(xì)胞中的ACE2表達(dá)水平顯著高于同階段的雄胚，但在隨后的發(fā)育階段并沒有顯著差異。STB和CTB中的ACE2陽性表達(dá)細(xì)胞具有顯著的性別差異。這說明在圍著床期和妊娠期發(fā)生的SARS-CoV-2垂直傳播也可能存在性別差異。另外，這一結(jié)果表明ACE2可能無法逃逸植入后胚胎發(fā)育后期的X染色體失活，這增進(jìn)了我們對胚胎發(fā)育過程中XCI的了解。

5. 結(jié)論

雖然在新生兒的血液樣本中檢測出IgM抗體，但SARS-CoV-2能否通過宮內(nèi)傳播依舊存在爭議，急需更確鑿的證據(jù)進(jìn)行檢驗。本研究為圍著床期胚胎和妊娠期間SARS-CoV-2垂直傳播的可能性提供了理論依據(jù)，同時也為在妊娠期或備孕期感染的患者提供了一些參考建議。

致謝

Author contributions

Wei Chen, Peng Yuan and Ming Yang wrote the manuscript. Wei Chen and Peng Yuan performed bioinformatic analysis. Zhiqiang Yan, Siming Kong, Jie Yan, Xixi Liu and Yidong Chen were helpful for the discussion of this study.Jie Qiao and Liying Yan developed the study conception and designs. All the authors have read and approved the final manuscript.

Compliance with ethics guidelines

Wei Chen, Peng Yuan, Ming Yang, Zhiqiang Yan, Siming Kong, Jie Yan, Xixi Liu, Yidong Chen, Jie Qiao, and Liying Yan declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2020.07.013.