• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種快速定量檢測猴組織中SIV/SHIV 的方法

    2021-01-25 03:07:02歌孟鳳珍姚艷豐
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2020年12期
    關(guān)鍵詞:定量質(zhì)粒特異性

    高 歌孟鳳珍姚艷豐?

    (1.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,武漢國家生物安全實驗室,武漢 430071;2.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,武漢大學(xué)動物實驗中心,武漢 430071)

    艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球三大傳染病之一,自發(fā)現(xiàn)以來在全球迅速蔓延,對人類的生命健康造成嚴(yán)重威脅。 世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)2020 年統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示,全球已有3800 萬人感染了艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV),2019 年新增170 萬病例,AIDS 導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá) 69萬[1]。 在眾多HIV 相關(guān)研究的動物模型中,非人靈長類動物如恒河猴感染SIV 后出現(xiàn)的臨床癥狀和發(fā)病機(jī)制與人類感染 HIV 相似[2-3]。 因此,SIV 感染非人靈長類動物模型被廣泛應(yīng)用于HIV/AIDS 的研究,并為 WHO 所推薦[4]。 抗 HIV/AIDS 的逆轉(zhuǎn)錄治療的主要靶點(diǎn)是HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶。 為了建立逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的動物模型,研究人員將SIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因改造為HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因,形成基于SIV 骨架,含有HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶的SIV-HIV 雜交病毒,即SHIV[5]。 SHIV 感染猴主要用于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物耐藥性的研究[5]。 近年來,越來越多的研究人員將 SHIV 感染猴模型用于抗 HIV 新藥的研究[6-8]。 檢測感染猴體內(nèi)SIV/SHIV 載量的變化是評價和分析疾病發(fā)展的重要指標(biāo)[9-11]。 因此,建立一種快速,敏感和特異的實驗方法監(jiān)測SIV/SHIV載量十分必要。 基于SIV/SHIV 骨架中重要且高度保守的gag基因作為目標(biāo)檢測對象,本研究利用TaqMan 探針技術(shù)建立了檢測SIV/SHIV 病毒核酸的實時熒光定量法。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物

    普通級雄性中國恒河猴17 只,體重6 ~8 kg,5歲。 均購于中國科學(xué)院昆明動物研究所[SCXK(滇)K2017-0003]。 無菌手術(shù)在武漢大學(xué)動物實驗中心生物安全三級實驗室進(jìn)行[SYXK(鄂)2019-0013]。 這些動物是按照國際實驗動物護(hù)理評估和認(rèn)證協(xié)會的規(guī)定進(jìn)行護(hù)理。 該研究方案和程序經(jīng)武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物管理與使用委員會批準(zhǔn)(2015024)。 所有的動物組織樣本均保存于武漢大學(xué)動物實驗中心動物生物安全三級實驗室。

    1.1.2 毒株

    R5 SHIVSF162p3n(由美國 Aaron Diamond 艾滋病研究中心Cecilia Cheng-Mayer 博士惠贈);SHIVKU-1、SIVmac239、SIVmac251、HCV JFH-1(由美國 NIH艾滋病研究項目提供);pCMV ayw HBV(由吉林大學(xué)呂銘宇博士惠贈);EBV(B95-8 毒株)、HSV-1 17syn+以及HSV-2 G 毒株(由中國科學(xué)院武漢病毒研究所胡勤學(xué)博士惠贈)。

    1.2 主要試劑與儀器

    TIANprep Mini Plasmid Kit 購自北京天根生化科技有限公司;E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 購自美國 Omega Bio-Tek 公司;pGEM? -T and pGEM? -T Easy Vector Systems 購自美國 PROMEGA 公司;JM109 購自美國 BioVector NTCC 公司;Taq DNA Polymerase 購 自 TaKaRa 公 司; Ficoll-PaqueTMPREMIUM 購自美國 GE Healthcare 公司;Tri Reagent-LS 購自美國 MRC 公司;AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit (50)購自美國Qiagen 公司; M-MLV RT 5X Buffer、 M-MLV Reverse Transcriptase、 Random Hexame primer、 RiboLock RNase inhibitor 購自美國 Thermo 公司;REGULAR AGAROSEG-10 購自西班牙 Biowest 公司。 Real-Time PCR Bio-Rad MyIQTM2 和 PCR Bio-Rad MyCyclerTMthermal cycler 購自美國 Bio-Rad 公司;NANODROP 2000 spectrophotometer 購自美國Thermo 公司。

    引物和探針的設(shè)計合成:擴(kuò)增gag基因的引物和探針是參考文獻(xiàn)[12](Forward primer gag: 5’-TGGAGAACAAAGAAGGATGTCAAA-3 ’, Reverse primer gag: 5’-CACCAGATGACGCAGACAGTATTA T-3’;Gag-Probe: FAM-5’-TTGGCACTAATGGAGCT AAGACCGAAAGTATT-3’-BHQ1)由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 RNA 的提取和 cDNA 的合成

    按照RNA 提取試劑Tri Reagent-LS 操作步驟從病毒液中提取SHIVSF162p3n病毒的RNA,加入20 μL無 RNA 酶的水溶解,56℃助溶 15 min,然后用NanoDrop 2000 檢測 RNA 的濃度。 將得到的 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為20 μL,分別加入 4 μL M-MLV RT 5X Buffer,1 μL dNTPs(5 μmol/L),1 μL Random Hexame primer(5 μmol/L), 0.5 μL RiboLock RNase inhibitor( 1 U), 0.5 μL M-MLV Reverse Transcriptase(10 U),10 μL RNA(1 μg)模板,剩余體積用 Rnase free water 補(bǔ)足到20 μL。 逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序為37℃,60 min;95℃,5 min。

    1.3.2 SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

    以1.3.1 中得到的病毒cDNA 為模板,使用gag引物,通過普通PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。 擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行DNA 凝膠電泳之后用E.Z.N.ATMGel Extraction Kit 進(jìn)行純化和回收,然后利用 pGEM? -T and pGEM? -T Easy Vector Systems 進(jìn)行片段連接和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。 利用藍(lán)白斑篩選白色單克隆菌落加入到含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中,在37℃恒溫培養(yǎng)振蕩儀中180 r/min 培養(yǎng)過夜。 過夜培養(yǎng)得到的菌液用TIANprep Mini Plasmid Kit 提取質(zhì)粒 DNA,然后測序鑒定。

    將測序鑒定正確的質(zhì)粒DNA 用NanoDrop 2000測定濃度,然后用公式計算出DNA 模板濃度:DNA模板濃度(copies/μL)= [質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9×6.02×1023]/[660 g/mol×堿基對數(shù)目]。

    1.3.3 TaqMan 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

    以pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒作為反應(yīng)模板,同時設(shè)End1/E6E7 細(xì)胞DNA 為陰性對照,無RNA 酶水為空白對照。 通過對PCR 反應(yīng)體系中各種成分(Taq 酶,引物和探針濃度)以及反應(yīng)程序中的相關(guān)條件(退火溫度,循環(huán)數(shù))進(jìn)行一系列的優(yōu)化實驗,通過比較檢測結(jié)果的各相關(guān)系數(shù)(CT 值,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2等),最終得到該法的最佳檢測條件。

    1.3.4 檢測靈敏度的分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    取 107~101copies/μL 濃度的 pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為TaqMan 實時熒光定量PCR 的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行擴(kuò)增,每個濃度做3 個平行,同時設(shè)End1/E6E7 細(xì)胞DNA 陰性對照,無RNA 酶的水空白對照,由定量PCR 儀自動繪制出線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.5 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性分析

    選擇 R2在 0.997 ~ 1.000 之間的 pGEM? -TSHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度樣本作為檢測模板,每個濃度做5 個平行檢測樣本,通過計算Ct 值的變異系數(shù)CV 來評價檢測方法的重復(fù)性。

    1.3.6 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析

    除了檢測SHIVSF162p3n,SHIVKU-1,SIVmac239,SIVmac251 的cDNA 外,還同時檢測了 HCV,EBV,HBV,HSV-1 以及HSV-2 的DNA。 人原代巨噬細(xì)胞DNA 為陰性對照,無RNA 酶水作為空白對照。

    1.3.7 TaqMan 實時熒光定量 PCR 檢測方法的應(yīng)用

    本研究中使用的動物組織樣本包括SIV 或SHIV 感染猴和健康猴的血漿(plasma)、外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear, PBMC)、淋巴結(jié)(lymph node)[13-14]。 血漿為猴靜脈全血經(jīng)過EDTA抗凝處理后所得,PBMC 為猴靜脈全血經(jīng)過Ficoll-PaqueTMPREMIUM 處理分離所得。 淋巴結(jié)組織樣本為猴安樂死后,直接解剖取材所得。 SIV 感染猴(n= 3)腸系膜 LN,SHIV 感染猴(n= 7)Plasma、PBMC、腋下LN、腹股溝LN、腸系膜LN 和結(jié)腸 LN,健康猴(n=7)Plasma、PBMC、腋下 LN、腹股溝 LN、腸系膜 LN 和結(jié)腸 LN。 使用 AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal kit(美國Qiagen)提取標(biāo)本的DNA和RNA,RNA 按照1.3.1 的操作步驟獲得 cDNA。將cDNA 和DNA 按照1.3.3 中優(yōu)化好的方法進(jìn)行檢測,同時設(shè)人原代巨噬細(xì)胞作為陰性對照和無RNA 酶水空白對照。

    注:圖中陰影部分為引物和探針結(jié)合目的片段部位。圖1 重組質(zhì)粒pGEM? -T-SHIV gag 測序鑒定結(jié)果Note.The part of primers and probe combined with targeted fragment was indicated.Figure 1 Identification results of recombinant plasmid pGEM? -T-SHIV gag sequencing

    2 結(jié)果

    2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

    普通PCR 擴(kuò)增SHIV cDNA 的片段大小為109 bp,克隆到載體中制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)過氨芐青霉素篩選的陽性單克隆菌株經(jīng)測序鑒定與GeneBank(AY033146.2)中記錄的SHIVgag片段序列一致(圖1)。

    2.2 TaqMan 實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立

    反應(yīng)結(jié)束后,通過Bio-Rad 軟件系統(tǒng)分析PCR的結(jié)果。 得出最佳反應(yīng)體系見表1,最佳反應(yīng)程序為:95℃,10 min;95℃,15 s,60℃,1 min,55 個循環(huán)。

    2.3 靈敏度及定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

    將pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋,以 107~101copies/μL 稀釋度作為 PCR擴(kuò)增的模板,如圖2 所示,SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在107~102copies/μL 濃度間標(biāo)準(zhǔn)曲線定量線性關(guān)系很好。 R2=0.998,slope=-3.304。 因此,我們把該法的檢測靈敏度定為102copies/μL。

    2.4 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法重復(fù)性分析

    以 R2在 0.997~1.000 的 107~102copies/μL 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板重復(fù)測定5 次,然后計算Ct 值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差s以及變異系數(shù)(表2)。 結(jié)果表明,該檢測方法具有可重復(fù)性。

    2.5 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析

    為了確定該方法的特異性,我們檢測了多個SHIV 和SIV 株以及其它無關(guān)病毒。 如圖3 所示,該法 只 能 擴(kuò) 增 SHIVSF162p3n、 SHIVKU-1、 SIVmac239、SIVmac251 的 cDNA,而對其它病毒(HCVJFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+和 HSV-2 G)無擴(kuò)增作用。人原代巨噬細(xì)胞DNA 陰性對照和無RNA 酶的水空白對照均為陰性。

    2.6 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法的臨床應(yīng)用

    TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測健康猴和感染SIV/SHIV 猴的 Plasma、PBMC、LN,結(jié)果見表3。 結(jié)果顯示,TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測SIV/SHIV感染猴樣本均能檢測到SIV/SHIV 的RNA 和前病毒DNA;檢測健康猴樣本時,所有樣本的檢測結(jié)果都為陰性。

    表1 TaqMan 實時熒光定量PCR 的反應(yīng)體系Table 1 Reaction systems of TaqMan real-time FQ-PCR

    表2 TaqMan 實時熒光定量PCR 的重復(fù)性實驗Table 2 Repeatability evaluation of TaqMan real-time FQ-PCR

    注:A:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線;B:將107-102copies/μL 10 倍倍比稀釋的pGEM? -T-SHIV gag 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線;標(biāo)準(zhǔn)曲線定量線性方程為Y=-3.304x+41.556,R2=0.998, slope=-3.304。圖2 pGEM? -T-SHIV gag 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線Note.A, Fluorescence quantitative amplification plot of 10-fold serial dilutions standard plasmids.B, Standard curve obtained with 10-fold serial dilutions of the pGEM? -T-SHIV gag plasmids from 107-102 copies/μL, the quantitative equation was Y=-3.304x+41.556,R2=0.998, slop=-3.304.Figure 2 TaqMan real-time FQ-PCR quantitative fluorescence amplification plot and standard curve of pGEM? -T-SHIV gag

    表3 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測猴樣本的結(jié)果Table 3 Results of samples from monkeys detected by TaqMan real-time FQ-PCR

    注:SHIV 和 SIV 有特異性擴(kuò)增,HCV JFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+以及HSV-2 G Strain 以及人原代巨噬細(xì)胞、無RNA 酶水?dāng)U增結(jié)果都為陰性。圖3 TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測方法特異性分析Note.To analyze the specificity of TaqMan real-time FQ-PCR for detecting SHIV or SIV gagmRNA.Except for the strains of SHIV and SIV, the method could not amplify cDNA or DNA of other viruses.Figure 3 Specific amplification tests of TaqMan real-time FQ-PCR

    3 討論

    SIV 感染獼猴是目前研究HIV/AIDS 的最佳動物模型[15]。 為了獲得更接近HIV 感染人類的猴動物模型,研究人員構(gòu)建了由HIV 和SIV 嵌合的病毒,被稱為SHIV 病毒,SHIV 能有效地感染獼猴[16],已被廣泛地用于 HIV/AIDS 的研究工作。 由于SHIV 的遺傳基因包括了HIV 的逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列,SHIV 感染的非人靈長類動物模型成為評估抗HIV 藥物和疫苗的重要工具[5]。 SHIV 感染后期,由于病毒繁殖受到免疫抑制,血中病毒量下降。 但仍有部分病毒以前病毒(provirus)DNA 或RNA 分子形式潛伏在感染細(xì)胞中[17-18]。 在SHIV 感染的潛伏期和平臺期,血漿病毒載量降低或消失的情況下,前病毒DNA 載量更能反映感染的狀態(tài),與疾病的發(fā)展密切相關(guān)。

    在本研究中我們發(fā)現(xiàn)TaqMan 實時熒光定量PCR 能夠檢測出 SHIV/SIV,而對其它幾種病毒(HCV JFH-1、EBV、HBV、HSV-1 17syn+和HSV-2 G)的擴(kuò)增結(jié)果都為陰性(圖3),說明該方法檢測SHIV/SIV 具有高特異性。 此外,為了能夠定量檢測病毒,我們還構(gòu)建了pGEM? -T-SHIVgag質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,圖2 的結(jié)果顯示,構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 R2在0.997-1.000 之間,說明該標(biāo)準(zhǔn)品所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。 由表2 中所顯示的各個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過5 次獨(dú)立重復(fù)實驗擴(kuò)增得到的CT 值的變異系數(shù)在0.6%~1.1%之間,說明該方法具有較好的可重復(fù)性。 為了進(jìn)一步評價該方法的特異性和靈敏度,我們使用該方法檢測了SHIV 和SIV感染恒河猴的血漿,外周血單核細(xì)胞以及淋巴結(jié)中病毒RNA 以及前病毒DNA 的水平。 如圖4 所示,所有SIV 或SHIV 感染猴樣本的結(jié)果都為陽性,而健康猴樣本的結(jié)果均為陰性,說明該方法能夠特異性檢測出SHIV/SIV 感染猴不同組織中的病毒RNA以及前病毒DNA。

    傳統(tǒng)的熒光定量PCR 檢測方法是利用熒光染料與雙鏈DNA 結(jié)合之后發(fā)出熒光信號,通過檢測該熒光信號進(jìn)行定量檢測。 而本研究采用的TaqMan探針實時熒光定量PCR 檢測的是積累熒光,由于增加了探針的識別步驟,PCR 檢測的特異性比傳統(tǒng)的熒光定量 PCR 更高[19]。 雖然已有研究運(yùn)用TaqMan 探針的方法檢測猴艾滋病毒[20],但本研究構(gòu)建的檢測方法靈敏度更高,并同時檢測了SHIV和SIV 不同毒株的病毒核酸,在特異性評價實驗中同時檢測了多種RNA 病毒和DNA 病毒核酸,且在實際應(yīng)用評價中檢測了多種猴組織樣本(血漿,PBMC 以及淋巴結(jié))中的病毒RNA 和前病毒DNA。

    本研究構(gòu)建的TaqMan 實時熒光定量PCR 檢測法的靈敏度為102copies/μL(圖2)。 如果樣本的病毒量少于102copies/μL,需重復(fù)檢測避免漏診,必要時還應(yīng)動態(tài)地檢測動物血漿病毒載量的變化。 本法的特異性高,除了能特異性地診斷是否有SIV/SHIV 感染外,還能定量檢測SIV/SHIV 的RNA 和前病毒DNA 的水平。 因此,該法具有特異、敏感和快速的優(yōu)點(diǎn),適用于 SIV/SHIV 感染猴模型的動物研究。

    猜你喜歡
    定量質(zhì)粒特異性
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    兒童非特異性ST-T改變
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    亚洲在线观看片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 十八禁人妻一区二区| 精品午夜福利在线看| 成人特级黄色片久久久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产亚洲欧美98| xxxwww97欧美| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费在线观看成人毛片| 一进一出抽搐动态| 国产淫片久久久久久久久 | 成年免费大片在线观看| 亚洲精华国产精华精| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美黄色片欧美黄色片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品国产三级普通话版| 男人舔女人下体高潮全视频| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 一级作爱视频免费观看| 成人特级av手机在线观看| 午夜福利欧美成人| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品久久久久久久久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美精品国产亚洲| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产熟女xx| 国产精品久久久久久久久免 | 久久性视频一级片| 精品午夜福利在线看| 91久久精品电影网| 欧美日本视频| 国产精品永久免费网站| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费大片18禁| 亚洲激情在线av| 亚洲成人久久性| 99久久九九国产精品国产免费| 麻豆一二三区av精品| 精品久久久久久成人av| bbb黄色大片| 男插女下体视频免费在线播放| 级片在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av电影在线进入| 高清日韩中文字幕在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 黄色日韩在线| 国内精品久久久久精免费| 亚洲精品456在线播放app | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 香蕉av资源在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久久久av| 精品久久久久久久久亚洲 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| aaaaa片日本免费| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美日韩福利视频一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美日韩国产亚洲二区| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品久久视频播放| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久久久精品吃奶| 91av网一区二区| 悠悠久久av| 一个人看的www免费观看视频| 中文字幕高清在线视频| 九色国产91popny在线| 桃色一区二区三区在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 深夜a级毛片| 国内精品一区二区在线观看| 天堂影院成人在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 一级a爱片免费观看的视频| 国产免费男女视频| 亚洲在线自拍视频| 51国产日韩欧美| 亚洲黑人精品在线| 免费看美女性在线毛片视频| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久成人免费电影| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 美女大奶头视频| eeuss影院久久| 天堂√8在线中文| 亚洲av电影在线进入| 日本 欧美在线| 熟女人妻精品中文字幕| 99久国产av精品| 看免费av毛片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 97人妻精品一区二区三区麻豆| www.色视频.com| 黄色女人牲交| 中文字幕熟女人妻在线| 最近中文字幕高清免费大全6 | 精品久久国产蜜桃| 免费搜索国产男女视频| 桃红色精品国产亚洲av| 夜夜爽天天搞| 露出奶头的视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲专区中文字幕在线| 九九在线视频观看精品| 国产午夜精品论理片| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产亚洲欧美98| 少妇人妻精品综合一区二区 | 午夜a级毛片| 午夜福利欧美成人| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久精品影院6| 亚洲国产精品999在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 深夜a级毛片| 日本 av在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 两个人视频免费观看高清| 哪里可以看免费的av片| 欧美精品国产亚洲| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品色激情综合| 欧美黄色片欧美黄色片| 少妇被粗大猛烈的视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品久久久久久,| 国产野战对白在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产一区二区三区视频了| 少妇高潮的动态图| 小说图片视频综合网站| 一区二区三区激情视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲色图av天堂| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 少妇丰满av| 美女免费视频网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品人妻1区二区| 两个人的视频大全免费| 在线a可以看的网站| 少妇高潮的动态图| 国产精品电影一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 91在线观看av| 成人永久免费在线观看视频| 内射极品少妇av片p| 亚洲最大成人中文| 国产精品国产高清国产av| 成人国产综合亚洲| 老熟妇乱子伦视频在线观看| av天堂在线播放| 搡老岳熟女国产| 长腿黑丝高跟| 亚洲av电影在线进入| 亚洲性夜色夜夜综合| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲无线在线观看| 精品一区二区免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一本一本综合久久| 亚洲黑人精品在线| 国产成人影院久久av| 亚洲国产精品成人综合色| 高清毛片免费观看视频网站| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产探花在线观看一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 嫩草影视91久久| 一区福利在线观看| 床上黄色一级片| 搡老妇女老女人老熟妇| 嫁个100分男人电影在线观看| 99热这里只有是精品在线观看 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美午夜高清在线| or卡值多少钱| 99riav亚洲国产免费| 三级毛片av免费| 国产精品永久免费网站| 脱女人内裤的视频| 激情在线观看视频在线高清| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲av.av天堂| 淫秽高清视频在线观看| 成人无遮挡网站| xxxwww97欧美| 国产色爽女视频免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 中文字幕av成人在线电影| 日本 av在线| 淫秽高清视频在线观看| 97热精品久久久久久| 一本一本综合久久| 99热6这里只有精品| 69人妻影院| 色哟哟·www| 亚洲精华国产精华精| 欧美黄色淫秽网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 看十八女毛片水多多多| 人人妻人人澡欧美一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成人久久爱视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产探花极品一区二区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产高清激情床上av| 在线观看舔阴道视频| 99热精品在线国产| 亚洲av五月六月丁香网| 国产男靠女视频免费网站| 长腿黑丝高跟| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲美女黄片视频| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美在线二视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 成年女人永久免费观看视频| 国产日本99.免费观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久色成人| 久久久久久久久中文| 亚洲美女黄片视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜久久久久精精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲一区高清亚洲精品| 中文字幕高清在线视频| 日本黄大片高清| av欧美777| 亚洲精华国产精华精| 首页视频小说图片口味搜索| 精品福利观看| 长腿黑丝高跟| 麻豆av噜噜一区二区三区| netflix在线观看网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 九九热线精品视视频播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看舔阴道视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩欧美免费精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产黄片美女视频| 国产精品,欧美在线| 最近在线观看免费完整版| 赤兔流量卡办理| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 最近中文字幕高清免费大全6 | 一个人免费在线观看电影| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 一区二区三区高清视频在线| 久久午夜亚洲精品久久| 一个人看的www免费观看视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 日日夜夜操网爽| av欧美777| 麻豆av噜噜一区二区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美乱妇无乱码| 波野结衣二区三区在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成+人综合+亚洲专区| 成年女人永久免费观看视频| 免费人成在线观看视频色| 色吧在线观看| 中文在线观看免费www的网站| eeuss影院久久| 国产视频内射| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最近最新免费中文字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 一个人免费在线观看电影| 中文字幕av在线有码专区| 国产高清视频在线观看网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 色噜噜av男人的天堂激情| 97热精品久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品国产高清国产av| 在线观看一区二区三区| 俺也久久电影网| 亚洲在线观看片| 此物有八面人人有两片| 51午夜福利影视在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 日日夜夜操网爽| 婷婷精品国产亚洲av在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 麻豆成人av在线观看| 亚州av有码| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人人妻人人看人人澡| 久久亚洲精品不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲午夜理论影院| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色播亚洲综合网| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲真实伦在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 日本a在线网址| www.熟女人妻精品国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99久国产av精品| 日本五十路高清| 亚洲av熟女| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 真人做人爱边吃奶动态| 久久亚洲精品不卡| 美女 人体艺术 gogo| 波野结衣二区三区在线| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲第一电影网av| 国产乱人视频| 69av精品久久久久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品久久久久久久久亚洲 | 嫁个100分男人电影在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲自偷自拍三级| 一级黄片播放器| 国产视频一区二区在线看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美极品一区二区三区四区| 国内精品美女久久久久久| 69人妻影院| 美女被艹到高潮喷水动态| 婷婷色综合大香蕉| 国产真实乱freesex| 首页视频小说图片口味搜索| 国产黄片美女视频| 国产一区二区激情短视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线观看66精品国产| 色综合站精品国产| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产成年人精品一区二区| 麻豆国产av国片精品| 伦理电影大哥的女人| 有码 亚洲区| www.熟女人妻精品国产| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久亚洲真实| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品久久国产蜜桃| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 日韩欧美国产一区二区入口| 成人午夜高清在线视频| av专区在线播放| 久久国产乱子伦精品免费另类| 少妇人妻精品综合一区二区 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 色视频www国产| 91久久精品电影网| 久久午夜福利片| 国产精品亚洲美女久久久| 国产av不卡久久| 99热这里只有精品一区| 亚洲精品一区av在线观看| 97热精品久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 一a级毛片在线观看| 青草久久国产| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产一区二区激情短视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 悠悠久久av| 一本久久中文字幕| 精品福利观看| a在线观看视频网站| 精品不卡国产一区二区三区| av视频在线观看入口| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费电影在线观看免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲专区国产一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| www.色视频.com| 黄色丝袜av网址大全| 在线免费观看的www视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲午夜理论影院| 69人妻影院| 婷婷精品国产亚洲av| 免费搜索国产男女视频| 国产免费男女视频| 我要看日韩黄色一级片| 国产真实乱freesex| 午夜福利免费观看在线| 99热这里只有是精品50| 亚洲av免费在线观看| 内地一区二区视频在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜激情欧美在线| 1000部很黄的大片| 国产成人影院久久av| 欧美乱色亚洲激情| 国内揄拍国产精品人妻在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 51国产日韩欧美| 国产高潮美女av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 嫩草影院入口| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 国内精品久久久久久久电影| 一级a爱片免费观看的视频| 国产av一区在线观看免费| 天堂√8在线中文| 国产熟女xx| 久久亚洲真实| 免费在线观看影片大全网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产色婷婷99| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 波野结衣二区三区在线| 简卡轻食公司| eeuss影院久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 九九热线精品视视频播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人欧美在线观看| 久久中文看片网| a级一级毛片免费在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本成人三级电影网站| 欧美日韩福利视频一区二区| www日本黄色视频网| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色综合站精品国产| 免费无遮挡裸体视频| 青草久久国产| 亚洲美女黄片视频| 国产 一区 欧美 日韩| a级毛片a级免费在线| 亚洲av五月六月丁香网| 成人av在线播放网站| 美女免费视频网站| 成人美女网站在线观看视频| 制服丝袜大香蕉在线| 熟女电影av网| 国产日本99.免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美潮喷喷水| 欧美成人a在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 欧美日韩国产亚洲二区| 男插女下体视频免费在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产欧美人成| 免费无遮挡裸体视频| 国产人妻一区二区三区在| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 午夜福利在线在线| 在线播放国产精品三级| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 国产人妻一区二区三区在| 少妇被粗大猛烈的视频| 日日夜夜操网爽| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 三级国产精品欧美在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产黄a三级三级三级人| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品久久久久久精品电影| 中出人妻视频一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 级片在线观看| 久久中文看片网| 日韩大尺度精品在线看网址| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日本在线视频免费播放| 久久久成人免费电影| 老女人水多毛片| 变态另类丝袜制服| 少妇高潮的动态图| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产高清激情床上av| 少妇的逼水好多| 久久午夜福利片| 国产av在哪里看| 国产色爽女视频免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美日韩黄片免| 女人被狂操c到高潮| 天堂动漫精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产成人av教育| 亚洲综合色惰| 亚洲,欧美,日韩| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩中字成人| 美女被艹到高潮喷水动态| 老鸭窝网址在线观看| 此物有八面人人有两片| 国产大屁股一区二区在线视频| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美中文日本在线观看视频| 99在线人妻在线中文字幕| 看十八女毛片水多多多| aaaaa片日本免费| 久久中文看片网| 日本熟妇午夜| 可以在线观看的亚洲视频| www.色视频.com| 一本综合久久免费| 最近在线观看免费完整版| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲经典国产精华液单 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线播放无遮挡| 亚洲成av人片免费观看| 少妇丰满av| 国产精品人妻久久久久久| 日本一二三区视频观看| 日韩中字成人| 日韩欧美在线乱码| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 99riav亚洲国产免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 在线播放国产精品三级| 观看美女的网站| 全区人妻精品视频| 欧美成人免费av一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av电影在线进入| 国产一区二区三区视频了| 亚洲不卡免费看| 国产精品女同一区二区软件 | 国产三级黄色录像| 欧美区成人在线视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国内精品美女久久久久久| 欧美国产日韩亚洲一区| 午夜亚洲福利在线播放| 久久精品人妻少妇|