環(huán)境豐容對SD 大鼠行為和腎上腺皮質(zhì)激素的影響研究

劉 帥宋佳陽呂 賽李軍延

(中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所,北京 100050)

環(huán)境豐容(environmental enrichment)又稱為環(huán)境豐富,作為提高實驗動物福利的有效手段,近年來在行業(yè)內(nèi)逐漸受到重視,應(yīng)用也逐漸廣泛[1]。 國外對此進(jìn)行了大量的研究,從動物行為和生理指標(biāo)兩方面對環(huán)境豐容的作用進(jìn)行了評估。 但不同的研究結(jié)論常常不一致[2],給我們的參考應(yīng)用帶來困惑。 統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)約有70%的文獻(xiàn)報道環(huán)境豐容提高了動物福利,10%左右的文獻(xiàn)報道環(huán)境豐容并未達(dá)到預(yù)期效果。 差異的研究結(jié)果表明環(huán)境豐容的作用與采用的環(huán)境豐容的方式、作用時間,應(yīng)用動物的品系、性別有關(guān)[3]。 而目前我國實驗動物環(huán)境豐容的研究較少,行業(yè)內(nèi)還沒有關(guān)于環(huán)境豐富應(yīng)用的行業(yè)指南或是標(biāo)準(zhǔn),各單位都是根據(jù)自己需要進(jìn)行豐富,豐富的方式和選擇的材料都不統(tǒng)一,其實施過程多種多樣,而我們對于這些應(yīng)用對實驗動物福利的提升及生物學(xué)指標(biāo)的影響知之甚少。 因此本研究選擇了市售的3 類功能8 種材料組成了不同的環(huán)境豐容方案,從行為及生理角度評價不同環(huán)境豐容的效果及對SD 大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

45 只 SPF 級雄性 SD 大鼠,6 周齡,體重 180 ～200 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心動物實驗室屏障環(huán)境[SYXK(京)2019-0050],飼喂60Co 滅菌大小鼠維持飼料。 飲水經(jīng)反滲透紫外殺菌處理。 本研究通過了中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所實驗動物管理與福利倫理審查委員會審查(EAWE-2015-007)。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;5417R 低溫離心機購自 Eppendorf 公司;MultiskanMK3 型酶標(biāo)儀購自Thermo 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

大鼠隨機分為4 組,其中單籠組9 只,單籠飼養(yǎng)于白色不透明籠盒內(nèi)。 新奇組、豐容組、對照組各12 只,3 只/籠飼養(yǎng)于透明籠盒內(nèi)。 所有籠盒尺寸都為:47 cm×31.5 cm×20 cm。 盒內(nèi)添加楊木刨花和玉米芯顆粒為基礎(chǔ)墊料。

1.3.2 環(huán)境豐容方案

豐容材料購自益新(中國)有限公司和北京美綠洲生物科技有限公司,包括3 種功能的8 種材料,詳見表1。

新奇組由表1 中的3 種功能的豐容材料各取一種構(gòu)成8 種豐容組合,每周提供一種組合,連續(xù)豐容8 周,期間豐容材料有損壞會及時更換。 新奇組具體豐容方案見表2。

表1 環(huán)境豐容材料Table 1 Environmental enrichment items

表2 新奇組豐容方案Table 2 Enrichment program of novelty group

豐容組動物只提供3 種功能豐容材料中的一類,同樣是每周更換,期間有損壞會及時更換。 對照組和單籠組不添加豐容材料。 豐容組具體豐容方案見表3。

1.3.3 檢測指標(biāo)

(1)大鼠行為觀察

實驗第 9 周,采用瞬時掃描法記錄大鼠行為[4]。 行為觀察記錄由同一個觀察者完成,觀察者提前10 min 進(jìn)入動物飼養(yǎng)室,讓動物熟悉一下后再進(jìn)行觀察記錄。 每日觀察時間為上午10 ～11 點,下午4～5 點,連續(xù)觀察7 d,共14 h。

采用瞬時掃描法順序觀察籠盒內(nèi)的每一只動物,掃描間隔為10 s(即每只動物觀察10 s),則1 h的觀察時段內(nèi)每只動物可記錄8 個行為頻次,連續(xù)7 d 的觀察后,每只動物可以記錄112 個行為頻次。

結(jié)合對大鼠行為的觀察和文獻(xiàn)描述制定大鼠行為譜[4],詳見表4。

(2)大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)酮的測定

試驗第7 周時抓取大鼠按摩腹部促進(jìn)排尿,每只取尿樣50 μL,-20℃凍存。 9 周后解剖時取腹主動脈血,分離血清-20℃凍存。 用購自上海江萊生物科技有限公司的ELISA 檢測試劑盒檢測尿液和血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮(CORT)濃度。

表3 豐容組豐容方案Table 3 Enrichment program of environmental enrichment group

表4 大鼠行為譜Table 4 Ethogram for behavioural elements recorded

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理,方差齊性的數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析比較差異,方差不齊的數(shù)據(jù)應(yīng)用非參檢驗比較差異,P<0.05 為顯著差異,P<0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 雄性大鼠的行為時間分配規(guī)律

經(jīng)對雄性大鼠行為頻次的統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)在上午 10 ∶00-11 ∶00 及下午 16 ∶00-17 ∶00 兩個時間段內(nèi),大鼠表現(xiàn)最多的是不活躍行為,即睡覺(平均發(fā)生32.5 次,占29%)和清醒不動(平均發(fā)生28.2次,占25.2%)。 其次為活動性行為,例如:梳理哈欠(平均發(fā)生13.5 次,占12%),探究(平均發(fā)生12.6 次,占 11%),運動活動(平均發(fā)生 8.3 次,占7%),控制墊料(平均發(fā)生7.1 次,占6%)。 采食和飲水各平均發(fā)生5.2 和2 次,占5%和2%。 發(fā)生頻率最少的是社交行為,非攻擊性社交平均發(fā)生1.9次,占2%,而攻擊行為發(fā)生0.7 次,占1%。

如表5 所示,豐容組和對照組兩組間除對照組采食行為增加外,其他各行為都無顯著差異。 單籠組動物不活躍行為增加,如清醒不動顯著高于新奇組和對照組,探究性行為減少,控制墊料的行為顯著低于對照組(P=0.02),單純性活動行為極顯著高于其他組(P<0.01)。 而新奇組探究性行為極顯著高于其他三組(P<0.01)。

2.2 雄性大鼠尿液和血液中ACTH 和CORT 的濃度

利用ELISA 試劑盒檢測大鼠尿液中和血清中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)酮(CORT)的濃度。 檢測結(jié)果顯示,血清中各組間 ACTH 和CORT 的濃度無顯著性差異。 尿液中 ACTH 和CORT 濃度呈現(xiàn)新奇組>單籠組>對照組>豐容組的趨勢,但除新奇組ACTH 極顯著高于其他三組,其他差異不顯著。 另外,CORT 在尿液中濃度要高于血清中的。 詳見表6。

表5 雄性SD 大鼠行為頻次Table 5 Behavioural performance of SD rats

表6 雄性SD 大鼠ACTH 和CORT 的濃度Table 6 Concentration of ACTH and CORT

3 討論

環(huán)境豐容的實施目的是讓動物表達(dá)天性行為,改善動物福利[5]。 豐容材料的選取應(yīng)考慮動物的行為需求,確保動物能夠使用這些材料,對這些材料感興趣[6]。 在給予動物豐容材料時可進(jìn)行動物對材料的偏愛性觀察,如直接觀察動物對豐容材料的反應(yīng),也可間接通過痕跡來判定動物是否對豐容材料有反應(yīng),還可以與預(yù)期目標(biāo)進(jìn)行對比來初步判定豐容效果[7]。 在本實驗中根據(jù)文獻(xiàn)[8]及嚙齒類動物的天性,選取了3 種功能的豐容材料:筑巢材料、遮蔽物、磨牙棒。 實驗過程中發(fā)現(xiàn)雄性大鼠對于筑巢材料未達(dá)到預(yù)期效果,紙屑筑巢材料基本平鋪在籠盒中,未有筑巢行為發(fā)生,棉棒被大鼠撕咬打開,但同樣未有明顯的筑巢行為發(fā)生。 這可能是因為本實驗的大鼠都為雄性,筑巢行為不是其特殊需求[9]。 對于兩種材質(zhì)(紙質(zhì)和尼龍)的4 種遮蔽物,都有觀察到大鼠對其反應(yīng),使用情況良好,尼龍材質(zhì)比較耐用,實驗期間未有損壞,而紙質(zhì)遮蔽物一般一周就需更換。 觀察到與大鼠互動最多的豐容材料為磨牙棒,但在實驗中也發(fā)現(xiàn)不同動物對不同的豐容材料有明顯的偏愛。 兩種材質(zhì)的磨牙棒:木質(zhì)和尼龍材質(zhì)。 有的大鼠偏愛木質(zhì)磨牙棒,對尼龍磨牙棒不理睬,而有的大鼠剛好相反。 因此在制定與實施豐容方案前應(yīng)根據(jù)大鼠對豐容材料的偏愛對其進(jìn)行篩選。

量化分析動物行為的改變是評價環(huán)境豐容效果的有效方法。 其中掃描法獲得動物行為時間分配是比較容易操作的一種。 本實驗中在進(jìn)行大鼠行為時間分布觀察前,先進(jìn)行了大鼠12 h(動物照明時間)行為觀察,選取大鼠行為最豐富或者最活躍的時間段(上下午各1 h)進(jìn)行后續(xù)觀察。 即使是在此時間段內(nèi),大鼠最主要的行為也是清醒不動或睡覺(占比超過50%)。 實驗動物因為標(biāo)準(zhǔn)化圈養(yǎng)的關(guān)系,食物飲水提供充足,覓食行為減少,籠盒大小無法充分滿足它們的活動需要,限制了它們的活動量,導(dǎo)致其行為發(fā)生適應(yīng)性變化[10],動態(tài)和積極行為減少,而動態(tài)和積極行為是動物的自然行為,是表現(xiàn)生命活力的行為[11]。 因此有必要根據(jù)實驗動物的需求設(shè)置一定的環(huán)境豐容材料,以改善實驗動物的行為。

本實驗中,單籠組大鼠的不活躍行為(睡覺和清醒不動)增加,探究性活動減少,而單純性活動極顯著增加。 籠養(yǎng)大鼠典型的刻板行為之一即為在籠盒內(nèi)不停轉(zhuǎn)圈,此種行為可由單純性活動增加逐漸演變而來[12]。 本實驗中單籠組大鼠雖還未觀察到明顯的刻板行為,但是已經(jīng)有顯著的單純性活動增加。 大鼠作為群居動物,單籠飼養(yǎng)阻礙了大鼠間的相互交流,是對動物福利的損害[13]。 環(huán)境豐容后,新奇組探究行為極顯著高于其他三組,由此可見環(huán)境豐容能夠明顯改善SD 大鼠的行為,使其不活躍行為減少,促進(jìn)并展示出了更多的積極行為。放置環(huán)境豐容材料后,大鼠有了新的樂趣,而且躲藏在遮蔽物中以及磨牙與其生活習(xí)性相適應(yīng)。 前人的研究也表明,環(huán)境豐容能夠增加動物的活動性行為[14],減少異常行為及不活躍行為,說明環(huán)境豐容對動物行為具有積極影響[15]。

腎上腺皮質(zhì)激素是動物應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物,文獻(xiàn)中也常用皮質(zhì)激素來反映動物的福利水平[16-17]。 在大鼠中主要的皮質(zhì)激素為皮質(zhì)酮(CORT)。 血清中為蛋白結(jié)合的皮質(zhì)酮,尿液中為游離皮質(zhì)酮,即有活性的皮質(zhì)酮[18]。 同時因為尿液采集對動物無損傷,所以逐漸被人們所提倡。 本實驗的檢測結(jié)果,尿液中皮質(zhì)酮的濃度是顯著高于血清中的,說明尿液完全可以取代血清,而且可能比血清更為靈敏。

本實驗中,新奇組尿液中ACTH 與COAT 都是最高的,且ACTH 極顯著高于其他三組,說明新奇組的豐容方案可能給動物帶來了一定程度的應(yīng)激。一種可能是新奇組給動物提供3 種豐容材料,且每周更換不同的組合,這對動物來說是一種明顯的刺激,導(dǎo)致應(yīng)激的產(chǎn)生。 此外,豐容材料越多,相應(yīng)的動物需要的飼養(yǎng)空間也越多,但是籠盒面積是固定的。 增加的豐容材料侵占了大鼠的飼養(yǎng)空間,對其造成了壓力,引起了應(yīng)激[19]。 由此可知,實驗動物環(huán)境豐容并不是豐容材料越多越好,豐容方案越新奇越好,要根據(jù)飼養(yǎng)條件選擇合適的豐容材料和方案[20]。

尿液中ACTH 與COAT 濃度呈現(xiàn)出單籠組、對照組、豐容組遞減的趨勢,但差異不顯著。 提示本試驗采取的單一材料環(huán)境豐容方案確實可能提高了動物的福利水平,降低了SD 大鼠的皮質(zhì)激素的水平。 但由于一是本實驗中即使是對照和單籠飼養(yǎng)也都給予了楊木刨花和玉米芯顆粒的墊料,二是實驗持續(xù)時間還不夠久,帶來的激素改變還沒達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著水平[21]。

綜上所述,作為群居動物,單籠飼養(yǎng)SD 大鼠會減少其探究行為,增加其不活躍行為及單純性活動行為,極易導(dǎo)致產(chǎn)生刻板行為,是對大鼠福利的損害。 而環(huán)境豐容有助于改善SD 大鼠的行為,提高動物福利,但過于復(fù)雜新奇的環(huán)境豐容也可能對動物帶來壓力,產(chǎn)生應(yīng)激。 因此應(yīng)在基于動物需求的基礎(chǔ)上,根據(jù)動物實際飼養(yǎng)條件,選擇簡單實用的環(huán)境豐容材料和方案,既確保豐容措施能夠改善動物福利水平,又能確定環(huán)境豐容措施的使用不給動物帶來新的刺激和壓力。