姜黃素通過下調(diào)microRNA-125b 保護人視網(wǎng)膜色素上皮細胞免受高糖誘導(dǎo)的細胞損傷

蘇軍華焦永偉魏宏蓮

(1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科,石家莊 050000; 2.河北省中醫(yī)院骨科,石家莊 050000)

糖尿病是一種慢性代謝性疾病,全球約有4.15億糖尿病患者,而亞洲患病人數(shù)約超過2.3 億,且呈逐年上升趨勢,嚴重危害患者身心健康及生活質(zhì)量[1]。 糖尿病長期進展可損害眼、腎、神經(jīng)、血管等多種組織并引起嚴重并發(fā)癥[2]。 人視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞是視網(wǎng)膜細胞重要營養(yǎng)及代謝組織,糖尿病患者長期處于高糖環(huán)境下,易使RPE 細胞因高糖刺激機體產(chǎn)生過多氧自由基造成氧化應(yīng)激損傷,從而導(dǎo)致多種視網(wǎng)膜病變[3]。 糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常見眼部微血管并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致患者視力損傷甚至失明的重要原因[4-5]。 姜黃素是一種酚性色素,存在于姜黃、郁金、莪術(shù)等中藥的根莖中,具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]等多種藥理活性,但關(guān)于其對DR 的影響鮮有報道。 miR-125b是miR-125 家族中一員,其異常表達與糖尿病[9]及其胰島素抵抗[10]等密切相關(guān),是糖尿病治療的新型靶點分子。 因此通過高葡萄糖糖濃度建立高糖環(huán)境,擬探究姜黃素對高糖誘導(dǎo)人ARPE-19 細胞損傷的作用及miR-125b 表達的影響,以期揭示其作用機制,為臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

ARPE-19 細胞(目錄號:CC-Y1051)購自美國ATCC 公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F-12 培養(yǎng)基(批號:12634010)、胎牛血清(FBS,批號:10099141)均購自美國Gibco 公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(批號:6210A)、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(批號:638314)均購自大連TaKaRa 生物技術(shù)有限公司;引物及 miR-125b 抑制物( inhibitor)/陰性對照(negative control,NC)由上海生工生物工程股份有限公司合成;SOD 酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒(批號:69 -21389)購自武漢默沙克生物科技有限公司;MTT 試劑盒(批號:C0009)、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(批號:C1062S)購自上海碧云天有限公司。 CO2培養(yǎng)箱購自美國 Thermo Fisher 公司;FACS-Calibur 流式細胞儀購自美國Becton Dikinson公司;MODEL550 型酶標儀、7500 RT-qPCR 儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與處理

常規(guī)復(fù)蘇ARPE-19 細胞后于含體積分數(shù)10%FBS,1%青鏈霉素的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中置于體積分數(shù)5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞傳代用0.25%胰蛋白酶消化。 將對數(shù)期生長ARPE-19 細胞分為5 組:對照組(5 mmol/L 葡萄糖處理)、高糖組(30 mmol/L 葡萄糖處理)、高糖+姜黃素組(30 mmol/L 葡萄糖+80 μmol/L 姜黃素共處理)、高糖+inhibitor 組(30 mmol/L 葡萄糖 +miR-125b inhibitor轉(zhuǎn)染共處理)、高糖+inhibitor-NC 組(30 mmol/L 葡萄糖+ miR-125b inhibitor-NC 轉(zhuǎn)染共處理),每組6個重復(fù),培養(yǎng)48 h 后收集細胞進行后續(xù)檢測。 實驗重復(fù)4 次。

1.3.2 MTT

采用MTT 試劑盒檢測各組 ARPE-19 細胞活性,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。 細胞活性=(OD處理組/OD對照組)×100%。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI

每孔ARPE-19 細胞培養(yǎng)結(jié)束后添加500 μL 結(jié)合緩沖液重懸,加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后,添加5 μL PI,避光輕振混勻,室溫放置15 min。 同時設(shè)置對照(無Annexin V-FITC 和PI),放入流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,并計算細胞凋亡率。

1.3.4 ROS 檢測

各組細胞培養(yǎng)結(jié)束后分別用磷酸鹽緩沖液洗滌,以終濃度為 10 μmol/L 2′-7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′-7′dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)避光37℃孵育2 h,熒光顯微鏡下觀察各組ARPE-19細胞熒光強度,以熒光強度的強弱反映細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。

1.3.5 SOD 檢測

收集各組細胞,破碎細胞后離心取上清液,采用ELISA 檢測超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD)水平,具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.6 RT-qPCR

采用TRIzol 試劑提取各組細胞總RNA,純度及濃度檢測合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用實時熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)試劑盒進行miR-125b 擴增,miR-125b 上游引物序列:5′-TGTGATCCCTGAGACCCTAAACTTGTGA-3′,下游引 物 序 列: 5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′。內(nèi)參 U6 上游引物序列:5′-GCTTCGGCAGCACAT ATACTAAAAT-3′,下游引物序列:5′-CGCTTCACG AATTTGCGTGTCAT-3′。 反應(yīng)體系:SYBR(2 ×)10 μL,ROX Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL,ddH2O 6.0 μL。 每個樣品設(shè)置 3 個復(fù)孔。 反應(yīng)條件:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40 個循環(huán)。 采用 2-ΔΔCT法分析其相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。 計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間進行單因素方差分析(One-way ANOVA),進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境下姜黃素增強ARPE-19 細胞活性

與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19 細胞活性顯著降低(圖1,P<0.01),而姜黃素和miR-125b inhibitor 可顯著升高ARPE-19 細胞活性(P<0.01)。

2.2 高糖環(huán)境下姜黃素降低ARPE-19 細胞凋亡

與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19 細胞凋亡率顯著增加(圖2,P<0.01)。 姜黃素處理及miR-125b inhibitor 轉(zhuǎn)染后,ARPE-19 細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.3 高糖環(huán)境下姜黃素抑制miR-125b 表達

與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19 細胞中miR-125b 表達水平顯著升高(圖3,P< 0.01), 而姜黃素處理及轉(zhuǎn)染 miR-125b inhibitor 可顯著降低 ARPE-19 細胞中 miR-125b 表達水平(P<0.01)。

注:A:對照組;B:高糖組;C:高糖+姜黃素組;D:高糖+inhibitor-NC 組;E:高糖+inhibitor 組。 與對照組比較,??P<0.01;與高糖組比較,&&P<0.01;與高糖+inhibitor-NC 組比較,##P<0.01。圖1 高糖環(huán)境下姜黃素對ARPE-19 細胞活性的影響(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+ curcumin group.D, High glucose + inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 1 Effect of curcumin on cell viability of ARPE-19 cells in a high glucose environment

2.4 高糖環(huán)境下姜黃素抑制ROS 生成

與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19 細胞中ROS 生成水平顯著增加(圖4,P<0.01),而姜黃素處理及轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor 可顯著降低 ARPE-19 細胞中 ROS 生成水平(P<0.01)。

2.5 高糖環(huán)境下姜黃素促進SOD 表達

與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19 細胞中SOD 表達水平顯著降低(圖5,P<0.01),而姜黃素處理及轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor 可顯著增加 ARPE-19 細胞中 SOD 表達水平(P<0.01)。

3 討論

目前用于治療和預(yù)防糖尿病血管病變的藥物有限,且存在一定副作用[11]。 現(xiàn)代研究認為,糖尿病的發(fā)生可能與環(huán)境因素、遺傳因素及自身免疫功能等共同作用有關(guān),提高機體抗氧化能力是治療糖尿病及其血管并發(fā)癥疾病的新方向[12]。 姜黃素是一種多酚類化合物,其結(jié)構(gòu)中有2 個鄰甲基化酚和1 個β-二酮功能基團,與多種生物活性密切相關(guān),具有調(diào)節(jié)血脂代謝、抗炎和抗氧化等多種功能[13]。研究報道,姜黃素在改善糖尿病、肥胖及促進GLUT4 基因表達等方面具有一定治療作用[14],還可減輕糖尿病大鼠海馬的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡和膽堿能功能障礙[15],且可通過提高DR 大鼠視網(wǎng)膜抗氧化能力及抗凋亡能力,改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜變薄、基底膜增厚及感光細胞膜盤紊亂等[16]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常細胞相比,姜黃素處理后ARPE-19 細胞活性、SOD 表達水平顯著增加,凋亡率、ROS生成水平顯著降低,與劉俊平等[17]人研究結(jié)果一致,表明姜黃素處理可逆轉(zhuǎn)高糖對ARPE-19 細胞的損傷作用,清除氧自由基,增強其抗氧化能力,促進ARPE-19 細胞存活,抑制其凋亡,但其具體作用機制尚不清楚。

注:A:對照組;B:高糖組;C:高糖+姜黃素組;D:高糖+inhibitor-NC 組;E:高糖+inhibitor 組。 與對照組比較,??P<0.01;與高糖組比較,&&P<0.01;與高糖+inhibitor-NC 組比較,##P<0.01。圖2 高糖環(huán)境下姜黃素對ARPE-19 細胞凋亡的影響(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P<0.01.Compared with the high glucose+inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 2 Effect of curcumin on cell apoptosis of ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:對照組;B:高糖組;C:高糖+姜黃素組;D:高糖+inhibitor-NC 組; E: 高 糖 + inhibitor 組。 與 對 照 組 比 較,??P<0.01;與高糖組比較,&&P<0.01;與高糖+inhibitor-NC 組比較,##P<0.01。圖3 高糖環(huán)境下姜黃素對ARPE-19 細胞中miR-125b表達的影響(n=6)Note.A,Control group.B,High glucose group.C,High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose+inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 3 Effects of curcumin on the expression of miR-125b in ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:對照組;B:高糖組;C:高糖+姜黃素組;D:高糖+inhibitor-NC 組;E:高糖+inhibitor 組。 與對照組比較,??P<0.01;與高糖組比較,&&P<0.01;與高糖+inhibitor-NC組比較,##P<0.01。圖4 高糖環(huán)境下姜黃素對ARPE-19 細胞中ROS生成的影響(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 4 Effects of curcumin on the expression of ROS content in ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:對照組;B:高糖組;C:高糖+姜黃素組;D:高糖+inhibitor-NC 組;E:高糖+inhibitor 組。 與對照組比較,??P<0.01;與高糖組比較,&&P<0.01;與高糖+inhibitor-NC 組比較,##P<0.01。圖5 高糖環(huán)境下姜黃素對ARPE-19細胞中SOD 表達的影響(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 5 Effects of curcumin on the expression of SOD in ARPE-19 cells in a high glucose environment

miR-125 家族進化過程中高度保守,由 miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2 三個成員組成,其中miR-125b 是糖尿病治療的新型靶點生物分子[18]。有研究顯示,miR-125b 在2 型糖尿病患者外周血中顯著上調(diào)[19],可通過靶向血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的HK-2 腎小管上皮細胞ROS 的產(chǎn)生和凋亡,是預(yù)防糖尿病腎病的潛在治療靶點[20]。 且有研究報道,下調(diào)miR-125b 可增加大鼠視桿雙極細胞異常突起,增強內(nèi)層神經(jīng)元信息輸入,改善變性視網(wǎng)膜功能[21]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常ARPE-19 細胞比較,高糖誘導(dǎo)環(huán)境下ARPE-19細胞中miR-125b 表達水平顯著升高,而姜黃素處理及轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor 可顯著降低ARPE-19 細胞中miR-125b 表達水平,與Gong 等[22]人研究報道下調(diào)miR-125b 可抑制DR 進展結(jié)果一致,提示姜黃素可能通過下調(diào)miR-125b 減輕ARPE-19 細胞氧化應(yīng)激損傷,促進ARPE-19 細胞活性,抑制其凋亡。

綜上所述,本研究初步揭示了姜黃素可通過下調(diào)miR-125b 降低 ARPE-19 細胞 ROS 生成及增加SOD 表達,提高其抗氧化能力,減輕ARPE-19 細胞受高糖誘導(dǎo)的細胞損傷,可能為姜黃素用于DR 治療及研究提供新的治療手段。 但關(guān)于姜黃素對miR-125b 下游靶向基因調(diào)控機制尚不明確,是本研究不足之處,有待進一步深入探究。