高效液相色譜法測定復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿中四種維生素的含量

馮久芳，謝瑩霞

1.商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河南 商丘 476000；2.商丘市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 商丘 476001

復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿是一種中西藥復(fù)方制劑，其顏色為紅棕色，性狀較為稠厚，氣味芬芳，口感甜，主要用于兒童營養(yǎng)不良及維生素缺乏癥［1-2］。方中含有較多種類的B 族維生素與中藥提取物?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對維生素B1 和維生素B6 進(jìn)行了質(zhì)量控制，其他有效成分不能得到有效控制。有研究指出，復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿的處方成分較為復(fù)雜，是一種由10余種中藥提取物混合制成的維生素制劑，同時(shí)也由于B 族維生素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且容易受到外界因素影響，易出現(xiàn)降解而影響藥物的療效，因此針對于該制劑中的維生素做更深一步的質(zhì)量控制是極為重要的。目前國內(nèi)針對于此類藥物的報(bào)道多是僅僅針對其中一種或者兩種維生素的含量進(jìn)行測定，或者采用多種方式對于藥物中的不同維生素進(jìn)行測定，處理方式復(fù)雜，其檢驗(yàn)結(jié)果也往往受到多種客觀因素的影響，很難對此類藥物的維生素含量與質(zhì)量進(jìn)行全面的評價(jià)［3］。本文采用高效液相色譜法，對制劑中的四種維生素同時(shí)測定，方法簡便，易于操作，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提供了有利的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），XS205DU型電子分析天平（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司），KQ400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

維生素B1 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-201505，含量為97.0%）、維生素B2 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100369-201504，含量為98.2%）［2］、維生素B6 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100116-201404，含量為100%）和煙酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100115-201604，含量為99.9%）乙腈、甲醇（德國Merek 公司）均為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純，復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿（國藥控股星鯊制藥有限公司，批號：20960901，20960902，20960903，20961001，20960603）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Betasil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-5 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（含0.05% 甲酸）水（B）溶液；流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL；梯度洗滌時(shí)間、流動(dòng)相比例［3-5］，見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備：分別取維生素B1、B2、B6 和煙酰胺對照品適量，精密稱定，置同一25 mL 量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備質(zhì)量濃度分別為576、116、172 和576 μg/mL的維生素B1、B2、B6 和煙酰胺混合溶液作為對照品溶液［3］。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密量取供試品5 mL，置于具塞錐形瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液10 mL，超聲處理20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，加上述溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液［4］。

2.2.3 陰性對照溶液的制備：除維生素B1、B2、B6 和煙酰胺外，其他各藥按處方量投料按復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿的制備工藝制成陰性對照，然后按供試品的制備方法，制成陰性對照溶液［5］。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明四種維生素的峰型良好，分離度達(dá)到要求，陰性對照溶液在與對照品主峰的相應(yīng)位置無干擾。

表1梯度洗滌時(shí)間、流動(dòng)相比例

圖1 混合對照品溶液（A）、樣品溶液（B）和陰性對照溶液（C）的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系

分別稱取維生素B1、B2、B6 和煙酰胺對照品適量，精密稱定，置同一25 mL量瓶中，加0.05 %甲酸：10 %甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，遵循2.2.1 對照品溶液的制備步驟，制備5.76、11.53、23.05、28.89、57.5、115.2 μg/mL 質(zhì)量濃度的維生 素B1，1.16、2.33、4.65、5.9、11.5、23.20 μg/mL 質(zhì) 量 濃 度 的 維 生 素B2，1.72、3.43、6.87、8.5、17.1、34.4 μg/mL 質(zhì)量濃度的維生素B6，5.76、11.53、23.04、28.7、57.8、115.2 μg/mL 質(zhì)量濃度的煙酰胺等一系列混合對照品溶液。精密量取對照品系列溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄峰面積積分值［6］。以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰值面積均值Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2。結(jié)果表明四種維生素的線性關(guān)系良好。

表2 4種成分的線性關(guān)系曲線

2.5 加樣回收率

精密量取一系列混合供試品溶液進(jìn)行樣測定，分別計(jì)算各濃度梯度待測成分的加樣回收率，見表3。

3 樣品測定

5 個(gè)批次的復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿（精準(zhǔn)量取5.0 mL）按照2.2.2供試品溶液的制備步驟制備供試品溶液，分別對樣20 μL 的測定峰面積進(jìn)行記錄和含量進(jìn)行計(jì)算，具體數(shù)值見表4。

表3 加樣回收率研究分析

表4 樣品含量測定分析

4 討論

4.1 色譜柱、測定波長、提取溶劑的選擇

本文按照試驗(yàn)方法對維生素B1、B2、B6 和煙酰胺4種維生素含量進(jìn)行測定，Thermo Betasil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）通過對C18 的鍵位進(jìn)行特殊極性加工，可有效利用各維生素的疏水相互作用、極性相互作用等化學(xué)性質(zhì)差異，準(zhǔn)確的分離和高效的保留極性維生素化合物；260 nm檢測波長通過影響檢測試劑的信號產(chǎn)生及大小，可直接產(chǎn)生各維生素成分含量的色譜圖，具有基線穩(wěn)定，識別度高；0.05%甲酸＋10%甲醇提取溶劑（1:1，pH 3.2）在有效調(diào)節(jié)溶液酸度的同時(shí)，通過較大的極性萃取樣品中各維生素成分，且萃取含量極高［7］。

4.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

按照試驗(yàn)方法對混合供試品溶液和混合對照品溶液的色譜流動(dòng)相進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙腈-酸水體系在維生素B1、B2、B6 色譜分離中分離度良好，而煙酰胺分離中存在保留時(shí)間長、色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重等問題［8］。因此，可加入適量的甲醇溶液減少色譜分離中各成分的保留時(shí)間，抑制拖尾、裂峰現(xiàn)象，改善峰形。

4.3 樣品測定結(jié)果分析

本文對5 個(gè)批次復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿進(jìn)行多次試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，測得樣品中維生素B1、B2、B6 和煙酰胺的含量范圍分別為0.133 8～0.148 2，0.027 8～0.028 9，0.039 0～0.045 1 和0.138 6～0.143 1 mg/g，分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測得平均回收率取值范圍為97.45%～98.42%、97.71%～98.42%、96.69%～98.11%和96.21%～97.99%。

綜上所述，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法通過色譜柱、測定波長、提取溶劑的選擇和流動(dòng)相的優(yōu)化，操作簡便、精準(zhǔn)、重復(fù)性佳的完善了臨床對復(fù)方三維右旋泛酸鈣糖漿中四種維生素含量的測定，為該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，增加了質(zhì)量控制的科學(xué)性。