與狂犬病病毒P 蛋白互作宿主蛋白的篩選與鑒定

陳貝貝，馬 海，童劍軍,2，茍 濤，何川川,2，張雪萍，高 娜,2，楊勇飛,2，李有文,2*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染引起的急性、直接接觸性傳染病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到侵害為本病最主要的特征，人與幾乎所有溫血動物均易感，多因攜帶RV 的犬貓咬傷或舔舐傷口而感染。臨床上有狂躁型或抑郁型兩種，特有的臨床癥狀表現(xiàn)為恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣等，最終因身體部分或全身癱瘓、呼吸衰竭而死，病死率幾乎100%。具有非化膿性腦炎的特征性病變，鏡下可見神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)基氏小體（Negri bodies），可作為診斷該病的重要依據(jù)[1]。狂犬病分布范圍廣泛，世界每年約6 萬人死于狂犬病，我國是第二個狂犬病高發(fā)國[2-4]，加強(qiáng)對該病防治意義重大。

RV 屬于彈狀病毒科狂犬病病毒屬，是一種有囊膜、不分節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA 病毒，主要編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）等5 個重要的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。P 蛋白是多功能蛋白，被認(rèn)為是RV 的“外交官”[6]。一方面，P 蛋白可以與病毒的多種蛋白相互作用，保證病毒正常復(fù)制。例如：P 蛋白可以自身相互作用形成二聚體[7]；也可與L 蛋白結(jié)合對病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制起至關(guān)重要的作用[8]；還可以與N-RNA 復(fù)合體結(jié)合參與病毒的轉(zhuǎn)錄[9]；作為N 蛋白的分子伴侶引導(dǎo)N蛋白正確折疊[10]。另一方面，P 蛋白又可以與宿主細(xì)胞的多種蛋白相互作用，抵抗宿主的免疫防御。例如：P 蛋白可以與干擾素通路相關(guān)蛋白PML、STAT 相互作用阻止干擾素對病毒復(fù)制的抑制作用[11]；還可以與宿主動力蛋白輕鏈LC8 相互作用，促進(jìn)病毒增殖[12]。因此，對P 蛋白的研究有利于對RV 致病機(jī)理的了解和認(rèn)識。

噬菌體展示技術(shù)（Phage display technology）是一種研究蛋白互作的傳統(tǒng)方法，該方法先將組織細(xì)胞基因克隆到噬菌體中，構(gòu)建噬菌體文庫，并使基因編碼的蛋白表達(dá)在噬菌體表面，與目的蛋白結(jié)合，通過洗脫篩選和測序得到與宿主互作蛋白的基因信息[13]。為了獲得更多與RV P 蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白，本研究經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)了P 蛋白，并利用噬菌體展示技術(shù)從人腦組織cDNA 噬菌體文庫中篩選與P 蛋白互作的蛋白，為進(jìn)一步研究P 蛋白、了解RV 的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料RV SAD-L16 株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；含RV P 基因的質(zhì)粒pEGF-P 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)彭貴青教授惠贈；人腦組織T7 噬菌體cDNA 文庫、噬菌體宿主菌5403購自Novagen 公司；大腸桿菌DH5α、BL21、宿主菌、原核表達(dá)載體pET42b 均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa 公司；Nde I、Xho I 購自Ther?mo 公司；DNA 純化試劑盒購自美國Omega 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）公司；30%丙烯酰胺、顯色劑A/B 購自碧云天公司；蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；T7 噬菌體抗體購自Novagen 公司；P 蛋白單克隆抗體（MAb）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙凌教授惠贈；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體購自博士德生物有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)RV SAD-L16 株的P基 因 序 列（EU182347）， 設(shè) 計(jì) 引 物SADL16-P1/SADL16-P2 PCR 擴(kuò)增P 基因，并在其上下游引物的5'端分別引入Nde I 和Xho I 酶切位點(diǎn)；根據(jù)T7 噬菌體文庫載體序列，設(shè)計(jì)T7 10-3b 株引物T7 10-3b P1/T7 10-3b P2，以擴(kuò)增篩選出的互作蛋白基因（表1）。引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司合成。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定以pEGFP-P 質(zhì)粒為模板，利用SAD-L16-P1/P2 引物PCR 擴(kuò)增P 基因，經(jīng)Nde I 和Xho I 雙酶切后插入pET42b 質(zhì)粒構(gòu)建P 基因的原核表達(dá)載體，載體經(jīng)Nde I 和Xho I 雙酶切和測序鑒定，正確的表達(dá)載體命名為pET42b-P。根據(jù)測序結(jié)果利用軟件DNAMAN 和DNAStar 對P 蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 P 蛋白的原核表達(dá)、鑒定及純化pET42b-P 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600nm為0.6 時，加終濃度為1 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h～6 h 后，離心棄上清收集菌體，超聲破碎，離心后取上清和沉淀分別經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳檢測P 蛋白的表達(dá)，以P 蛋白MAb（1∶1 000）為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體（1∶1 000）為二抗，經(jīng)western blot 鑒定。表達(dá)蛋白經(jīng)蛋白純化試劑盒純化（按試劑盒說明書操作）后通過SDS-PAGE 檢測純化效果，并利用核酸蛋白儀測定其濃度。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 噬菌體展示技術(shù)篩選與P 蛋白互作的宿主蛋白參考文獻(xiàn)[14]篩選與P 蛋白互作的宿主蛋白：首先取純化的P 蛋白（10 mg/L）包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，并用5%的脫脂奶粉封閉；然后用T7 噬菌體宿主菌5403 培養(yǎng)擴(kuò)增人腦組織T7 噬菌體cDNA 文庫后，將文庫加入包被了P 蛋白的微量反應(yīng)板，常溫放置2 h 后棄去文庫并徹底清洗反應(yīng)孔以除去沒有作用的噬菌體，用解析緩沖液洗脫并收集洗脫液為第1 輪篩選文庫。取部分文庫采用涂板計(jì)數(shù)噬菌斑的方法測定其庫容量，剩余文庫接種5403 宿主菌培養(yǎng)擴(kuò)增。取第1 輪篩選文庫加入包被P 蛋白的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，同前法進(jìn)行第2 輪篩選。如此經(jīng)5 輪篩選后挑取全部噬斑分別作為模板，利用引物T7 10-3b P1/P2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測序。測定序列用NCBI 中BLAST 軟件進(jìn)行相應(yīng)基因序列對比分析，確定可能與P 蛋白互作的候選宿主蛋白。

1.6 候選互作宿主蛋白的ELISA 驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的互作蛋白及其與P 蛋白作用的強(qiáng)弱，將純化的P 蛋白（10 mg/L）包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板，分別以100 μL/孔加入1∶10 的候選互作宿主蛋白噬菌體文庫為一抗，同時設(shè)PBS、T7 噬菌體原庫及宿主菌5403 為對照。以100 μL/孔T7 噬菌體抗體（1∶10 000）為二抗，通過ELISA 檢測與P 蛋白互作的候選宿主蛋白，及其與P 蛋白的反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果構(gòu)建的P 基因原核表達(dá)載體經(jīng)Nde I/Xho I 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示得到了與預(yù)期相符的載體和目的基因兩條片段（圖1）；測序結(jié)果表明P 基因全長894 bp，與參考株ERN.NS P 基因的同源性達(dá)99.44%，表明pET42b-P表達(dá)載體構(gòu)建正確。

圖1 表達(dá)載體pET42b-P 的雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of pET42b-P by endonuclease digestion

2.2 P 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析通過DNAStar 軟件預(yù)測，RV SAD-L16 株P(guān) 蛋白由297 個氨基酸構(gòu)成，其二級結(jié)構(gòu)以α 螺旋結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲交錯形成，β轉(zhuǎn)角較少，P 蛋白親水性很強(qiáng)，柔韌性和抗原性均較好（圖2）。

圖2 P 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 2 Secondary structure prediction of P protein

2.3 P 蛋白的表達(dá)與鑒定將表達(dá)載體pET42b-P轉(zhuǎn)化BL21 并經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在上清和沉淀中均有大小約為38 ku 的目的條帶，均與理論P(yáng) 蛋白大小相符，且上清中蛋白的量更多。進(jìn)一步利用P 蛋白MAb 經(jīng)western blot 檢測，結(jié)果顯示，在約38 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖3A）。表明經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)了P 蛋白且P 蛋白以可溶形式表達(dá)。將表達(dá)的P 蛋白利用鎳層析法純化，經(jīng)SDSPAGE 檢測結(jié)果顯示，蛋白純化效果較好（圖3B）。利用核酸蛋白測定儀測定蛋白含量為230 mg/L。

圖3 P 蛋白表達(dá)的western blot（A）及其純化效果的SDS-PAGE（B）鑒定結(jié)果Fig. 3 Identification of P protein expression by western blot (A) and its purification by SDS-PAGE(B)

2.4 與P 蛋白互作宿主蛋白的篩選結(jié)果采用噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過5 輪篩選共挑取噬斑31 個，并以其為模板，采用引物T7 10-3b P1/P2 經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，得到24 種擴(kuò)增產(chǎn)物（圖4），全部測序后經(jīng)NCBI 的BlAST 比對，經(jīng)DNAMAN 軟件分析合并相同基因序列后共得到18 種候選蛋白。根據(jù)噬菌體文庫的載體序列，并且利用DNAstar 分析篩選出的蛋白基因序列的表達(dá)框是否與載體的表達(dá)框相匹配，最終確定能正確表達(dá)的候選互作蛋白有5 種（表2）。

圖4 篩選的與P 蛋白互作蛋白基因的PCR 鑒定結(jié)果Fig. 4 Identification of the selected interacting protein gene by PCR

2.5 候選互作宿主蛋白的ELISA 驗(yàn)證結(jié)果篩選的5 種候選互作宿主蛋白經(jīng)ELISA 檢測結(jié)果顯示，篩選蛋白的噬菌體文庫的OD630nm值均高于0.7，甚至超過1.0，而PBS、空宿主菌、未經(jīng)篩選的噬菌體文庫等陰性對照的OD630nm值均在0.1 以下（OD630nm值≥0.4 表示候選宿主蛋白與RV P 蛋白存在相互作用，圖5）。表明5 個篩選的候選互作宿主蛋白均有可能與P 蛋白相互作用，其中以泛素特異性肽酶54 和核糖體蛋白L15 的作用更強(qiáng)，作為與P 蛋白互作蛋白的可能性較大。

表2 最終篩選的與P 蛋白互作的5 種候選宿主蛋白信息Table 2 Selected candidates proteins interacting with P protein

3 討 論

RV P 蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的增殖和感染宿主過程中起著重要的輔助作用，其功能非常活躍。但P 蛋白很多功能還未被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)還未被解析，狂犬病的致病機(jī)制也不十分清楚，因此對P 蛋白進(jìn)行深入研究，尋找與P 蛋白互作的宿主蛋白以及這種互作對病毒復(fù)制的影響機(jī)制，將有助于抗病毒新靶標(biāo)藥物的研發(fā)。

本研究利用pET42b 原核表達(dá)載體經(jīng)PCR 擴(kuò)增了RVSAD-L16 株的P 基因并測序，序列分析發(fā)現(xiàn)其由894 個核苷酸組成，與RVERN.NS 參考株P(guān) 基因的同源性為99.44%。P 基因比對結(jié)果顯示，張強(qiáng)等對我國不同地區(qū)不同年代分離的4 株RV 與參考株同源性最低為83.6%，最高為99.8%[15]，表明P 基因變異較大。利用DNAStar 軟件預(yù)測P 基因編碼297 個氨基酸，分子量大小約35.6 ku，但本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的P 蛋白經(jīng)SDS-PAGE 結(jié)果顯示其約為38 ku，與預(yù)測有差異，但與李有文等表達(dá)的P 蛋白的結(jié)果一致[16]。根據(jù)章正瑛等分析，由于凝膠特性與蛋白帶電等多種因素的影響，SDS-PAGE 電泳結(jié)果與預(yù)測可能會有1 ku～5 ku 的差異，屬正?，F(xiàn)象[17]。對其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測并分析發(fā)現(xiàn)其親水性非常強(qiáng)，也具有較好的柔性。

圖5 與P 蛋白互作宿主蛋白的ELISA 驗(yàn)證結(jié)果Fig. 5 ELISA results of five candidate proteins interacting with P proteins

噬菌體展示技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用的傳統(tǒng)手段，其以成本低、操作簡單而廣泛應(yīng)用于治療性MAb 的開發(fā)[18]、多肽類藥物研究[19-20]、疫苗研發(fā)[21]以及食品安全分析[22]。目前主要有絲狀噬菌體、T7 噬菌體、T4 噬菌體與λ 噬菌體等展示系統(tǒng)，其中絲狀噬菌體展示系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛[23]。從理論上講，只要是與病毒靶蛋白存在可能互作的宿主蛋白，利用噬菌體展示技術(shù)就可以將其篩選出來，不會被遺漏，但實(shí)際操作中可能會受多種因素的限制而不能將其全部篩選出來。本研究利用原核系統(tǒng)表達(dá)并純化獲得RV P 蛋白，并利用噬菌體展示技術(shù)從商品化的人腦組織T7 噬菌體文庫經(jīng)5 輪篩選獲得的全部噬斑經(jīng)PCR 鑒定、測序分析和BLAST 比對后，篩選出18 種與P 蛋白存在相互作用的候選宿主蛋白。進(jìn)一步將各候選蛋白的基因序列與噬菌體載體的表達(dá)框?qū)Ρ确治鲆源_定其是否正確表達(dá)，最終確定能正確表達(dá)的候選互作宿主蛋白只有5 種。

利用噬菌體展示技術(shù)篩選與病毒蛋白互作的宿主蛋白，其結(jié)果存在一定的假陽性或假陰性[24-25]，因此，篩選出來的宿主蛋白是否是真正的互作蛋白還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。常用的驗(yàn)證方法有熒光定量PCR、Co-IP、Pull-down、細(xì)胞共定位和ELISA等[13]。本研究采用ELISA 方法檢測經(jīng)篩選得到的5種候選宿主蛋白與P 蛋白的相互作用，反向證明候選宿主蛋白是否與P 蛋白存在相互作用，結(jié)果表明泛素特異性肽酶54 和核糖體蛋白L15 與P 蛋白互作的可能性更大。根據(jù)這兩種蛋白可能的生物學(xué)功能，推測P 蛋白與泛素特異性肽酶54 互作可能會影響宿主蛋白的去泛素化，從而影響細(xì)胞的正常代謝、免疫調(diào)節(jié)而利于病毒感染；P 蛋白與核糖體蛋白L15 的互作可能會引起宿主蛋白的合成異常，從而有益于病毒復(fù)制而致病等。

本研究利用噬菌體展示技術(shù)從人腦組織T7 噬菌體文庫中篩選與RV P 蛋白互作的宿主蛋白，不僅為進(jìn)一步了解P 蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為RV 其他蛋白生物學(xué)特性的研究提供思路。