早發(fā)性脊柱側(cè)凸肺發(fā)育與相關(guān)機械力的刺激

羅興鵬 王迎松 解京明 張穎 施志約 楊桂然

肺泡生長速度最快的時期是在 2 歲以前[1]，2～4 歲時，肺泡細胞數(shù)量達到成年人水平 ( 3 億～6 億個 )，這之后肺泡的數(shù)量、大小和復(fù)雜程度可能還會繼續(xù)緩慢增加，直至青春期甚至成年期[2-3]。越早發(fā)生在胸段的脊柱畸形，對胸廓的形態(tài)、活動度、容積影響就越大，同時產(chǎn)生的異常機械應(yīng)力對肺細胞生長發(fā)育、組織分化的影響就越大。關(guān)于機械應(yīng)力如何影響肺形態(tài)發(fā)生、功能和新陳代謝的機制，在細胞和分子水平上已取得了重大進展，例如，血流動力作用下內(nèi)皮基因表達調(diào)控[4]、血管平滑肌[5]、骨和內(nèi)皮細胞[6]中的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)、異常應(yīng)力與機械通氣肺損傷分子機制[7]等。

肺受到多種復(fù)雜的應(yīng)力作用，包括呼吸、肺血流和表面張力。呼吸是肺的一個獨特功能，早在妊娠 10 周時，B 超就可以觀察到胎肺的“呼吸運動”。出生后，肺接受與整個體循環(huán)相同的血流量。這使得肺組織既承受氣體、液體流動產(chǎn)生的剪切力，又承受氣體膨脹、血流流動及呼吸運動產(chǎn)生的壓力拉伸。這些機械應(yīng)力作用于多種肺細胞，包括肺泡上皮細胞、成纖維細胞、氣道上皮細胞、肺內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及間皮細胞。研究細胞如何感知機械應(yīng)力刺激，細胞內(nèi)和細胞間信號傳遞，以及在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上的基因表達調(diào)控，可增加對機械應(yīng)力與肺細胞相互之間關(guān)系的理解，有助于在細胞和分子水平上理解肺生理學(xué)和病理生理學(xué)，以及異常機械應(yīng)力導(dǎo)致的多種肺疾病的病理生理情況。從而有助于設(shè)計預(yù)防和治療異常機械應(yīng)力相關(guān)疾病的策略，如肺發(fā)育不良、脊柱畸形相關(guān)的肺生長受限、機械通氣創(chuàng)傷等。

一、體外模擬對肺細胞施加的各種應(yīng)力及模型

除了機械拉伸，大量的空氣和血液流動還會產(chǎn)生流經(jīng)氣道和血管壁的剪切應(yīng)力。目前已有幾種裝置來模擬對肺細胞的這幾種類型的機械應(yīng)力刺激。根據(jù)它們的主要物理特征可分為：靜態(tài)拉伸、循環(huán)拉伸、二維拉伸與三維拉伸、剪切應(yīng)力作用、觸碰、扭曲等。

1. 靜態(tài)拉伸：在呼吸運動中肺受到氣流和血流的周期性拉伸，常用的靜態(tài)拉伸實驗裝置原理為通過工具垂直單向正壓推動，將培養(yǎng)在彈性膜上的細胞施加垂直雙向應(yīng)力[8]( 圖 1a )，或者水平推動培養(yǎng)在彈性膜上的細胞[9]。單一的靜態(tài)拉伸裝置可以比較直觀地在顯微鏡下觀察及檢測細胞形態(tài)、細胞內(nèi) Ca2+和其它信號的變化。

2. 循環(huán)拉伸：常見的為 Flexercell 應(yīng)變單元，用于在細胞上施加循環(huán)拉伸應(yīng)力。該設(shè)備使用真空泵將覆蓋有細胞的彈性膜循環(huán)向下拖動 ( 圖 1b )。通過該裝置可以預(yù)測彈性膜內(nèi)的任何位置的細胞應(yīng)變分布[10]。

3. 三維培養(yǎng)基中拉伸細胞：在體外維持肺泡上皮細胞的表型是非常困難的，因為在一般的培養(yǎng)基中，肺細胞是分散培養(yǎng)的，當(dāng)基質(zhì)密度低時，Ⅱ 型細胞迅速變扁，失去產(chǎn)生表面活性物質(zhì)的能力。但是用膠原蛋白海綿在三維環(huán)境中培養(yǎng)胎肺細胞卻可以維持肺泡細胞形態(tài)和表型[11]。這是因為膠原蛋白海綿被用作細胞黏附的底物時，分散的胎肺細胞聚集在海綿中，海綿周圍被間充質(zhì)細胞包圍[12]，創(chuàng)造了一個高度組織化的“肺泡樣結(jié)構(gòu)”( 圖 1c )。

4. 剪切應(yīng)力：在流固界面上施加在流動方向上的單位表面積的摩擦力稱為剪切應(yīng)力。具有代表性的模型為：Aparallel-plate 流動通道，它通過流體對單層培養(yǎng)的細胞施加剪切應(yīng)力[13]( 圖 1d )。為了模擬微循環(huán)中的剪切應(yīng)力，有學(xué)者還設(shè)計了玻璃微吸管灌注系統(tǒng)，在 20～50 μm的分支管中培養(yǎng)兔肺微血管內(nèi)皮細胞，通過灌流施加剪切應(yīng)力[14]。

5. 剪切應(yīng)力和機械拉伸：氣道、肺血管和胸膜間隙不僅受剪切應(yīng)力的影響，還受機械拉伸的影響。出生后的肺在呼吸運動膨脹收縮的同時還接受相當(dāng)于整個體循環(huán)的血流量，且血管阻力較低。因此，流體剪切應(yīng)力和機械拉伸對肺動脈內(nèi)皮細胞的影響都是舉足輕重的。為了確定這兩個分量的相對貢獻，有學(xué)者開發(fā)了可以選擇性地控制剪切應(yīng)力和機械拉伸的裝置[15]，以及跨毛細血管灌流培養(yǎng)系統(tǒng)[16]。

6. “觸碰”和“扭曲”設(shè)備：該設(shè)備通過選擇性地向單個細胞施壓，來模擬研究肺氣道上皮細胞所受的應(yīng)力作用[16]。通過計算機顯微操作將尖端直徑為 1 μm 的玻璃移液管放置在單個細胞的頂膜附近。移液管由計算機控制向下接觸細胞，使細胞膜瞬間受到觸碰變形 ( 圖 1e )。另一種裝置讓細胞結(jié)合涂有特定受體配體的球形磁微珠。通過在一個方向上磁化這些珠子，然后施加第二個方向為 90°的較弱磁場，通過旋轉(zhuǎn)磁珠，從而在細胞表面上施加可控的剪切應(yīng)力[17]( 圖 1f )。

二、不同的肺細胞在應(yīng)力刺激下的反應(yīng)

機械應(yīng)力對肺不同細胞的增殖和分化有不同的影響，循環(huán)拉伸應(yīng)力可刺激胎兒肺細胞增殖；在體外受循環(huán)拉伸機械應(yīng)力作用下培養(yǎng)氣道平滑肌細胞可觀察到細胞數(shù)量和DNA 合成均有增加；循環(huán)拉伸應(yīng)力還可下調(diào)前列腺素的生成，但是剪切應(yīng)力作用卻相反。機械應(yīng)力作用下細胞外基質(zhì)的成分也會改變；剪切應(yīng)力還能改變細胞的通透性。但是異常機械應(yīng)力作用下則會引起促炎細胞因子和趨化因子的表達增加。

1. 胎兒肺細胞：胎兒呼吸運動所產(chǎn)生的循環(huán)拉伸是胎兒肺生長的重要刺激因素，模擬體外培養(yǎng)大鼠胚胎肺細胞并施加間歇性機械拉伸應(yīng)力 ( 海綿伸長 5%，60 個周期 / min，15 min / h ) 該方案與報道的正常人類胎兒呼吸運動的頻率、幅度和周期性相似[18]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠第 19 天( 對應(yīng)人肺發(fā)育的小管期 ) 胎兒大鼠肺細胞的 DNA 合成和細胞分裂增加[19]。這說明環(huán)拉伸應(yīng)力刺激胎肺細胞的生長。

2. 氣道平滑肌細胞：氣道平滑肌細胞增生和肥大是哮喘、慢性阻塞性肺疾病和其它氣道阻力增高的慢性疾病的常見表現(xiàn)。犬氣道平滑肌細胞，用 Flexercell 應(yīng)變單位進行循環(huán)應(yīng)力拉伸體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)后 5 天或 14 天，細胞數(shù)量和 DNA 合成均有增加。細胞總蛋白含量，特別是肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈激酶和結(jié)蛋白等收縮蛋白的含量比靜態(tài)培養(yǎng)細胞明顯增加[20]。這些結(jié)果表明過多的機械應(yīng)力刺激會導(dǎo)致氣道平滑肌向病態(tài)方向發(fā)展。

圖 1 體外模擬對肺細胞施加的各種應(yīng)力模型 a：細胞培養(yǎng)在彈性膜上，彈性膜由物體向上推動 ( 箭頭 )，產(chǎn)生拉伸應(yīng)力；b：培養(yǎng)在彈性膜上的細胞被循環(huán)負壓向下拉 ( 向下箭頭 ) 產(chǎn)生循環(huán)拉伸應(yīng)力；c：細胞培養(yǎng)在明膠海綿上，海綿的一端粘在培養(yǎng)皿的底部，另一端粘在金屬棒上，通過計算機控制的螺線管 ( 箭頭 )產(chǎn)生的磁力作用在金屬棒上，對海綿上的細胞施加應(yīng)變；d：平行板流道對單層培養(yǎng)的細胞施加流體剪切應(yīng)力；e：微吸管觸碰單個細胞的頂膜，使細胞膜變形；f：細胞表面受體鏈接磁珠上的配體，磁珠一個方向上磁化后，第二個較弱的磁場方向為90°“扭曲”，使珠子的剪切應(yīng)力可控Fig.1 Simulations of various stress models applied to lung cells in vitro a: The cells were cultured on an elastic membrane, which was pushed upward by the object ( arrow ) to produce tensile stress; b: The cells cultured on the elastic membrane were pulled down by cyclic negative pressure ( downward arrow ) to produce cyclic tensile stress;c: The cells were cultured on a gelatin sponge; one end of the sponge was attached to the bottom of the culture dish, and the other end was attached to a metal bar; the magnetic force generated by a computercontrolled solenoid ( arrow ) acted on the metal bar and exerted strain on the cells on the sponge; d: Parallel plate exerted fluid shear stress on monolayer cultured cells; e: The micropipette touched the top membrane of a single cell, deforming the cell membrane; f: Receptors on the cell surface were connected to ligands on magnetic beads;After magnetization in one direction, the second weak magnetic field direction was “twisted” at 90°, so that the shear stress of the beads could be controlled

3. 細胞外基質(zhì)：間歇拉伸誘導(dǎo) Ⅳ 型膠原和肌原蛋白穩(wěn)態(tài) mRNA 水平升高。機械拉伸應(yīng)力還通過上調(diào)纖維連接蛋白的合成和分泌來增加纖維連接蛋白的產(chǎn)生[21]，使得細胞之間緊密連接更穩(wěn)固。循環(huán)拉伸應(yīng)力最初導(dǎo)致牛肺動脈內(nèi)皮細胞減少纖維連接蛋白的釋放，但是隨著拉伸時間的延長，培養(yǎng)基中的纖連蛋白開始接近非應(yīng)力對照組，而細胞層相關(guān)纖連蛋白也顯著增加[22]，這些結(jié)果表明，肺動脈內(nèi)皮細胞通過增強與細胞黏附相關(guān)的分子成分來響應(yīng)循環(huán)拉伸應(yīng)力。

4. 炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和細胞損傷：機械通氣是治療呼吸衰竭不可缺少的治療方式，但同時也會誘導(dǎo)或加重潛在的肺損傷。模擬機械通氣離體大鼠肺模型中收集的灌洗液中：包括巨噬細胞炎癥蛋白-2、干擾素-γ、細胞因子[ 腫瘤壞死因子 ( tumor necrosis factor，TNF )-α、白介素( interleukin，IL ) 如 IL-1、IL-6、IL-10 ]增加[23]。肺機械通氣過程中產(chǎn)生的炎癥細胞因子可能導(dǎo)致急性肺損傷和多器官功能障礙綜合征的發(fā)展。機械拉伸應(yīng)力，可增加人肺泡上皮細胞分泌 IL-8，但是過多增加拉伸程度 ( 10% 伸長率 ) 或連續(xù)拉伸應(yīng)力，則可誘導(dǎo)胚胎肺細胞的損傷，這與促炎細胞因子和趨化因子的表達增加有關(guān)[24]。

5. 前列腺素的合成：由氣道上皮細胞合成的具有生物活性的二十烷類物質(zhì)有助于調(diào)節(jié)氣道平滑肌張力和炎癥反應(yīng)。在機械通氣中，氣道進行循環(huán)伸展，循環(huán)拉伸應(yīng)力可下調(diào)人氣道上皮細胞中前列腺素 ( prostaglandin，PGs ) 的合成，包括 PGE2、PGI2 和血栓素 A2[25]，相反，剪切應(yīng)力可增加肺內(nèi)皮細胞釋放前列腺素。

6. 通透性：當(dāng)牛肺泡表面細胞培養(yǎng)基流速增加即產(chǎn)生剪切應(yīng)力增加時，細胞的通透性也增加[26]，肺胸膜表面的間皮細胞是肺表面和胸膜間隙之間的界面，在肺和周圍液體和組織之間提供屏障。由于肺的呼吸運動，這些細胞暴露在高水平的機械刺激下。當(dāng)肺擴張和收縮時，間皮細胞被周期性地拉伸、收縮。在肺擴張時，肺胸膜的一些區(qū)域相對于胸壁胸膜滑動，因此受到流體剪切應(yīng)力。在細胞流體剪切力研究模型中，這些細胞的通透性可被流體剪切應(yīng)力可逆地改變，這表明間皮細胞的屏障功能隨著流體剪切力的變化而變化。

三、展望

早發(fā)性脊柱側(cè)凸 ( early onset scoliosis，EOS ) 會影響胸廓及心肺的發(fā)育，主要表現(xiàn)在對肺形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響。側(cè)凸累及的椎體、肋骨越多，胸段、胸腰段側(cè)凸Cobb’s 角越大，患者的肺功能越差。當(dāng)胸廓畸形復(fù)雜程度超過了呼吸肌的代償，可出現(xiàn)限制性通氣功能障礙為主的肺功能損傷，表現(xiàn)為以肺活量 ( vital capacity，VC )、用力肺活量 ( forced vital capacity，F(xiàn)VC )、最大自主通氣量( maximal voluntary ventilation，MVV ) 的顯著降低和 1 秒量( forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1 ) 的增加或正常為特征，也可出現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙以及混合型通氣功能障礙。頸胸彎、胸彎角度過大時可出現(xiàn)支氣管走形迂曲移位，血管彎曲，肋間隙變窄，壓縮側(cè)肺不張，膨脹側(cè)肺氣腫，V / Q 異常，肺內(nèi)氣體交換面積減少，彌散功能下降，長期低氧血癥，肺血管收縮，此時肺動脈高壓有可能進展為肺心病，加之支氣管的迂曲移位狹窄，排痰困難，肺反復(fù)感染，進一步造成缺氧及二氧化碳潴留的惡性循環(huán)。

許多研究集中在機械應(yīng)力對肺細胞生理功能的影響上。關(guān)于機械應(yīng)力因素在 EOS 導(dǎo)致的胸廓、肺生長受限、肺細胞結(jié)構(gòu)及功能受損等機制的報道較少。有幾種策略可用于研究物理因素在 EOS 中的作用：可以從動物模型或患者身上收集細胞，然后在體外研究它們對機械應(yīng)力刺激的反應(yīng)。另外，如果異常物理影響因素的性質(zhì)被很好模擬的話，可以用各種設(shè)備來模擬這些條件。例如，可以模擬 EOS 的胸廓條件比較拉伸受限、正常拉伸和過度拉伸對細胞的影響；可用不同振幅、頻率和拉伸 - 松弛比干預(yù)細胞；在存在其它有害物理因素時，如高氧、缺氧和缺血再灌注時，應(yīng)用機械應(yīng)力刺激；或存在其它治療條件時，如由拉伸受限變?yōu)檎＠?( 模擬胸廓成形后的肺組織空間改善 )；在胸廓成形后對原生長受限的肺組織實施間充質(zhì)干細胞的干預(yù)、生長因子的干預(yù)、激素的干預(yù)等；從而探索因脊柱側(cè)凸造成的肺功能受損患者的治療方法。還可以通過多種組合干預(yù)措施研究機械應(yīng)力刺激與其它混雜因素之間的相互作用。例如，胎兒肺的成熟受機械應(yīng)力因素和激素因素的控制。在良好的培養(yǎng)條件下，在限制的條件下，這些因素的作用和相互作用的研究。同樣，EOS應(yīng)力失調(diào)與細菌產(chǎn)物、細胞因子、趨化因子和其它有害因子的相互作用可以同時在培養(yǎng)細胞上檢測。

機械力如何被細胞感知并轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生化信號以及各信號通路在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達調(diào)控中發(fā)揮的作用尚不清楚。由于器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、細胞類型的多樣性以及細胞在體內(nèi)所受應(yīng)力的多樣性，不同細胞感知機械刺激的機制可能會有所不同。主要的應(yīng)力相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制有，牽張 - 活化離子通道、細胞外基質(zhì) - 整合素 - 細胞骨架途徑 ( ECM-integrin-cell keleton pathway )、細胞 - 細胞黏附體連接和縫隙連接途徑[27]。在模擬 EOS 異常機械應(yīng)力刺激引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否有不同的表現(xiàn)形式，在有其它刺激 ( 治療或有害 ) 的情況下會發(fā)生怎樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，仍需進一步研究。一個特定基因的表達通常由其啟動子和增強子中的幾個轉(zhuǎn)錄因子控制。應(yīng)力和其它因素可能會選擇性地影響其活動。此外，從基因轉(zhuǎn)錄和翻譯到翻譯后修飾的多個步驟也可能受到異常應(yīng)力和其它信號的不同調(diào)控。