一般對照非抑制蛋白5參與調(diào)控牙髓干細胞成牙本質(zhì)分化

肖靜雯，殷巍巍，施素萍*

（1.海門市人民醫(yī)院口腔科，江蘇 海門 226100；2.南通市口腔醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

牙髓干細胞（DPSCs）是一種容易獲取、來源廣泛的間充質(zhì)干細胞，其擁有獨特的生物學特性如具有高度可塑性，能長期自我更新，并且能分泌各種生物活性分子和多向分化成為其他組織的潛能。由于牙髓具有能形成修復性牙本質(zhì)的獨特特性，牙髓中的DPSCs的成牙本質(zhì)分化潛能在臨床中受到越來越多的關(guān)注。

GCN5是一種組蛋白乙?；福℉AT），也稱為賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶2A（KAT2A），可作為主要轉(zhuǎn)錄激活因子在多種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和細胞增殖的控制中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，HAT可調(diào)節(jié)組蛋白乙?；娜旧|(zhì)程序，并與正常胚胎發(fā)生所需的基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)聯(lián)[1]。HAT既可以進行全局和特定位點的組蛋白乙酰化，也可以對非組蛋白進行乙?；?，同時HAT還可以作為轉(zhuǎn)錄的共激活子，在基因激活中起重要作用[2]。然而，GCN5對間充質(zhì)干細胞來源的DPSCs的成牙本質(zhì)分化的作用原理目前還尚不清楚。

本文主要對GCN5參與調(diào)控DPSCs成牙本質(zhì)分化能力進行研究。這將從基因?qū)用娣治龀隹烧{(diào)控DPSCs的成牙本質(zhì)分化能力的因素，有利于提高DPSCs在牙本質(zhì)再生、牙體牙髓疾病及其他疾病等方面的治療使用，增加其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集海門市人民醫(yī)院口腔門診健康人（18～25歲）的第三磨牙牙髓組織。受試者沒有齲病和口腔感染性疾病。研究中的所有方法均按照批準的倫理指南進行。DPSCs的分離與培養(yǎng)見先前研究[3, 4]，使用第三代DPSCs進行后續(xù)實驗。

1.2 方法

1.2.1 分組

Control組：DPSCs培養(yǎng)基中未加入任何分化誘導物

OD組：DPSCs培養(yǎng)基中加入成牙本質(zhì)分化誘導物

OD+siGCN5組：siGCN5轉(zhuǎn)染的DPSCs培養(yǎng)基中加入誘導成牙本質(zhì)分化

1.2.2 DPSCs成牙本質(zhì)分化誘導

成牙本質(zhì)誘導培養(yǎng)基的組成成分：每100 mL DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、0.1 U/L青霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松、2 mmol/L谷氨酰胺和50 mg/L抗壞血酸，每隔3天換一次培養(yǎng)液。

1.2.3 siGCN5的構(gòu)建

s i R N A 轉(zhuǎn)染是利用市場上現(xiàn)有的試劑盒（GENECHEM）實現(xiàn)的。DPSCs生長到培養(yǎng)皿80%時血清饑餓12h。用Lipo2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）以50 nmol/L的最終濃度轉(zhuǎn)染到細胞中。siRNA對人GCN5（siGCN5）靶序列為CCATTCCCTGGCATAA，隨后去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。

1.2.4 成牙本質(zhì)分化能力檢測

運用Western blot 檢測三組中牙本質(zhì)分化標記物DMP-1和DSPP表達的變化。

1.2.5 牙髓干細胞增殖能力檢測

用MTT法評估細胞的增殖。以4×103細胞/孔的濃度將DPSCs接種于24孔板中，用PBS清洗細胞，每孔加入20毫升MTT（5 g/L；Beyotime，中國上海）。在37℃條件下孵育4h后，用二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）提取沉淀，在490nm波長處測定光密度（OD）。MTT法分別檢測三組中細胞增殖數(shù)量，每組取6個平行樣本進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組計量資料采用T檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 siGCN5對DPSCs的增殖沒有影響

我們使用MTT法檢測來檢測siGCN5對DPSCs增殖的影響，結(jié)果顯示：DPSCs在體外培養(yǎng)24h,48h,72h時，siGCN5對DPSCs的增殖能力的差異無統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 MTT法檢siGCN5對DPSCs增殖的影響。

2.2 siGCN5抑制DPSCs中成牙本質(zhì)分化標記基因的表達

我們使用Western blot檢測siGCN5對DPSCs中成牙本質(zhì)分化相關(guān)標記基因表達的影響，結(jié)果顯示：OD組中成牙本質(zhì)分化標記物DMP-1和DSPP明顯高于對照組，而OD+siGCN5組中DMP-1和DSPP水平顯著低于成牙本質(zhì)分化組（P ＜0.05）(圖2)，說明了抑制GCN5基因的表達會抑制DPSCs的成牙本質(zhì)分化。

圖2 siGCN5抑制DPSCs中成牙本質(zhì)分化標記基因的表達

（A）Western blot檢測分析轉(zhuǎn)染siGCN5后DMP-1和DSPP的表達情況；（B）定量分析DMP-1和DSPP的蛋白表達水平；所有結(jié)果取平均值，n=3（*P ＜0.05）。

3 討 論

GCN5是一種典型的組蛋白乙酰化酶，已有研究表明HAT的上調(diào)可以促進成骨分化，并可調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞的骨組織形成，同時GCN5有助于Hox基因的調(diào)節(jié)，通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路促進小鼠骨骼發(fā)育[6]。有報道表明HAT抑制劑誘導干細胞遷移，促進牙源性基因表達，增加礦化和牙髓修復能力。但很少有研究GCN5如何影響骨和牙組織的形成，以及這種組蛋白乙酰化是否與最常見的骨纖維皮質(zhì)缺損有關(guān)。

間充質(zhì)干細胞是一種具有分化為成骨細胞并維持骨穩(wěn)態(tài)平衡的細胞。DPSCs是一組源自牙髓組織的特異性間充質(zhì)干細胞，可維持牙髓組織的穩(wěn)態(tài)平衡。在齲齒和牙齒損傷的過程中，牙髓中的干細胞具有再生牙本質(zhì)的能力?，F(xiàn)階段齲病在治療只能通過去除牙體的腐壞組織，進行樹脂等充填治療，而我們是否能夠利用牙齒中牙髓的成牙本質(zhì)分化的特性來促使其自身修復成為目前研究的新穎點。在我們的既往研究中已經(jīng)表明DPSCs是一組來源于牙髓的間充質(zhì)干細胞，并且其具有多向分化潛能，其中包括成骨分化、脂肪生成和軟骨生成等等，并且和骨髓間充質(zhì)干細胞相比，DPSCs具有更高克隆能力、增殖能力和多向分化能力[4]。DPSCs的這些獨特的生物學特性為我們在治療和修復牙本質(zhì)缺損時提供了一種新的思路，也成為了誘導牙本質(zhì)分化中的重要細胞。

而GCN5和DPSCs之間的關(guān)系還沒有被完全了解。為了研究GCN5的潛在功能，我們建立了GCN5穩(wěn)定敲除的牙髓干細胞，并檢測了siGCN5對牙髓干細胞成牙分化能力的影響。GCN5作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在細胞分化過程中具有重要作用。我們的結(jié)果首次證明了GCN5基因的敲除可抑制了DPSCs的成牙本質(zhì)分化標記物DMP-1和DSPP的表達，初步證明了GCN5與牙髓干細胞分化相關(guān)。GCN5對 DPSCs的分化具有重要的調(diào)控作用，這將有望成為促進 DPSCs在牙組織分化工程中應用的治療基因靶點，但其具體分子機制還需要進一步的研究來闡明?；谀壳暗陌l(fā)現(xiàn)，我們提出了GCN5在牙體缺損或者齲病發(fā)展中的新作用。GCN5的這一新功能可能為調(diào)控DPSCs成牙本質(zhì)分化提供有價值的知識。