利用CRISPRi 技術(shù)構(gòu)建乙醛酸生物合成Corynebacterium glutamicum工 程菌

梁詠思，沈凱佳，范許云，韓武洋,2，李天明,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司，北京 100000）

乙醛酸是醛酸家族中分子質(zhì)量最小的物質(zhì)，是生物體三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)和乙醛酸循環(huán)中重要的有機(jī)酸，影響生物體的代謝平衡，其衍生品多達(dá)數(shù)十種，其中典型的有香蘭素、乙基香蘭素、尿囊素、對羥基苯丙氨酸、對羥基苯乙酰胺等[1]。這些衍生物被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、糕點(diǎn)、糖果、烘烤食品、煙酒、香料、化妝品以及醫(yī)藥等行業(yè)[2-3]。隨著乙醛酸需求量的增加，化學(xué)法生產(chǎn)乙醛酸帶來的污染日益嚴(yán)重，因此，利用生物法合成乙醛酸成為重要途徑。

圖1 C. glutamicum ATCC 13032代謝途徑Fig. 1 C. glutamicum ATCC 13032 metabolic pathways

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）作為食品安全級的微生物，具有易培養(yǎng)、不產(chǎn)孢子、產(chǎn)率高、生物安全[4]等優(yōu)點(diǎn)。隨著C. glutamicumATCC 13032全基因組測序的完成[5]和組學(xué)數(shù)據(jù)的積累[6]，對其進(jìn)行工程化改造得以實(shí)現(xiàn)[7-8]。在C. glutamicum糖酵解途徑和TCA循環(huán)過程中，丙酮酸、乳酸、檸檬酸、異檸檬酸、乙醛酸和蘋果酸之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其代謝途徑如圖1所示，它們錯(cuò)綜復(fù)雜并且相互關(guān)聯(lián)[9]，研究人員對其進(jìn)行定向改造，使之具有更高的生產(chǎn)效率。常規(guī)的代謝工程技術(shù)一般是加強(qiáng)合成代謝途徑，阻斷競爭代謝途徑及支流代謝途徑，從而提高產(chǎn)品合成效率，但是敲除一些競爭途徑的關(guān)鍵基因常常會影響細(xì)胞生長[10-11]。基于RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶II型規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統(tǒng)的CRISPRi技術(shù)，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，提高合成效率。Cleto等[12]應(yīng)用CRISPRi技術(shù)，對C. glutamicum中pgi、pck、pyk三個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)控，使pgi、pck的表達(dá)強(qiáng)度下調(diào)97%，pyk基因的表達(dá)強(qiáng)度下調(diào)98%，發(fā)酵后得到的代謝產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸和L-谷氨酸的產(chǎn)量與基因敲除時(shí)的水平相當(dāng)。劉旭峰等[13]應(yīng)用CRISPRi技術(shù)對大腸桿菌（Escherichia coli）中3 個(gè)關(guān)鍵基因zwf、pfkA、gltA的表達(dá)強(qiáng)度分別進(jìn)行下調(diào)，最終使蘇氨酸產(chǎn)率均提升了約15%，而菌體的生長并沒有受到顯著影響。CRISPRi體系由失去核酸內(nèi)切酶活性的dCas9蛋白和sgRNA兩個(gè)組件構(gòu)成[14]，其中sgRNA由3 部分組成：20 nt目標(biāo)基因特定核苷酸區(qū)域的識別序列、42 nt dCas9蛋白結(jié)合序列以及40 nt轉(zhuǎn)錄終止子序列[15-17]。CRISPRi工作機(jī)制為sgRNA引導(dǎo)dCas9蛋白結(jié)合在DNA的特定位置時(shí)，三者形成的復(fù)合物能夠形成空間位阻，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的目的。CRISPRi技術(shù)具有靈活高效的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代謝工程和合成生物學(xué)等領(lǐng)域[18-24]，現(xiàn)如今，CRISPRi已被證明能在多個(gè)物種間發(fā)揮抑制作用，例如大腸桿菌、分歧桿菌、釀酒酵母以及動植物細(xì)胞等[25-27]。

本研究以C. glutamicumATCC 13032為出發(fā)菌株，敲除其支流代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，并建立CRISPRi調(diào)控體系，利用該體系下調(diào)C. glutamicum支流代謝中的關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶合成基因icd和蘋果酸合成酶合成基因ms的表達(dá)強(qiáng)度，同時(shí)過表達(dá)異檸檬酸裂合酶合成基因icl，使乙醛酸得到積累，減少副產(chǎn)物的生成，以期為C. glutamicum工業(yè)生產(chǎn)乙醛酸研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株、質(zhì)粒Table 1 Information about the strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

High-Fidelity DNA聚合酶 北京全式金生物制品公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 NEB（北京）有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒、超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

T100 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀、Gel DOC XR全自動凝膠成像儀、Centrifuge 5418R高速冷凍離心機(jī) 美國伯樂公司；PowerWave XS2酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；1200 Infinity高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；MiniSpin臺式高速離心機(jī) 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基

E. coli培養(yǎng)條件：LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，氨芐青霉素工作質(zhì)量濃度為100 μg/L，卡那霉素工作質(zhì)量濃度為50 μg/L；C. glutamicumATCC 13032培養(yǎng)條件：37 ℃培養(yǎng)，卡那霉素工作質(zhì)量濃度為30 μg/L。

LB培養(yǎng)基配方：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，調(diào)pH 7左右；固體培養(yǎng)基則添加瓊脂粉20 g/L。孵育培養(yǎng)基配方：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，1 g/L乙酸鈉，調(diào)pH 7左右。種子培養(yǎng)基配方：10 g/L玉米漿，25 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：50 g/L葡萄糖，5 g/L乙酸鈉，0.1 g/L NH4NO3，1.5 g/L KH2PO4，0.3 g/L CaCl2，0.25 g/L MgSO4，5 g/L (NH4)2SO4。

1.3.2 打靶質(zhì)粒的構(gòu)建

dCas9基因打靶質(zhì)粒的構(gòu)建：為將dCas9基因整合到基因組上，選擇C. glutamicum支流代謝中乙醛脫氫酶合成基因aldh作為其替代基因，將dCas9替換到aldh基因的相應(yīng)位置，以C. glutamicum基因組為模板，分別擴(kuò)增出aldh基因上下同源臂片段、啟動子sod基因片段，以實(shí)驗(yàn)室保存的dCas9-Peasy質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出dCas9基因片段，通過融合PCR技術(shù)將其搭接，獲得的搭接片段與空質(zhì)粒pK18mobsacB用NheI和XhoI進(jìn)行雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物純化，經(jīng)T4連接酶于16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至E. coli TransT1感受態(tài)細(xì)胞中，獲得打靶質(zhì)粒dCas9-pK18mobsacB。

icd基因和ms基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元打靶質(zhì)粒的構(gòu)建：為敲除C. glutamicum支流代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，同時(shí)也為將icd和ms基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元整合到染色體上，因此選取lldh基因的相應(yīng)位置作為目的位置，將sgRNA轉(zhuǎn)錄單元替換掉lldh基因。其中，icd基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件包括啟動子sod基因序列、20 bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域基因序列以及終止子rrnB基因序列；ms基因的sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組件包括啟動子tuf基因序列、20 bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)域基因序列以及終止子rrnB基因序列。以C. glutamicum基因組為模板擴(kuò)增出lldh基因的上、下同源臂片段，通過延長引物，利用2 次PCR擴(kuò)增出icd基因和ms基因的sgRNA組件，利用Golden Gate方法構(gòu)建出打靶質(zhì)粒icd-ms-pK18mobsacB。

icl基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：以C. glutamicum基因組為模板擴(kuò)增出啟動子sod基因片段、icl基因片段及終止子rrnB基因片段并搭接。將搭接片段與pXMJ19GZ質(zhì)粒利用HindIII和BamHI進(jìn)行雙酶切，按照上述方法構(gòu)建獲得打靶質(zhì)粒icl-pXMJ19GZ。

1.3.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

C. glutamicum感受態(tài)細(xì)胞制備參考Jang等[28]方法，將過夜培養(yǎng)的菌株按照10%接種量接種于種子培養(yǎng)基中搖瓶振蕩培養(yǎng)，使用PowerWave XS2酶標(biāo)儀測定OD值，當(dāng)OD600nm達(dá)到0.5～0.7時(shí)，4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，棄掉上清液后加入10%甘油輕輕洗滌2 次。吸取10 μL打靶質(zhì)粒和40 μL的C. glutamicum感受態(tài)細(xì)胞于1.5 mL離心管中輕彈混合，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯，靜置5 min后開始電擊，電擊條件為電壓2.5 kV/m、電阻250 Ω、電容25 μF。電擊完成后立即向電擊杯中加入1 000 μL預(yù)熱的孵育培養(yǎng)基，重懸混合后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，在恒溫加熱器中于48 ℃加熱6 min，之后30 ℃、180 r/min培養(yǎng)4 h。離心棄上清液后將菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。

1.3.4 工程菌的篩選及鑒定

C. glutamicum工程菌利用蔗糖致死基因sacB反向篩選技術(shù)，通過2 次同源重組方法進(jìn)行基因敲除，其原理如圖2所示。

圖2 同源重組原理示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the homologous recombination principle

以突變菌株C. glutamicum/dCas9Δaldh為例，其構(gòu)建及篩選過程如下：將打靶質(zhì)粒dCas9-pK18mobsacB利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到野生型C. glutamicumATCC 13032菌株，48～72 h后，對在含卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長的單菌落進(jìn)行分子驗(yàn)證，確定打靶質(zhì)粒發(fā)生第1次同源重組，已整合到染色體上。選取驗(yàn)證正確的陽性單菌落轉(zhuǎn)接到孵育培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，讓其在無抗生素條件下自由生長，使其發(fā)生第2次同源重組。將菌液稀釋涂布在含10%蔗糖的LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃過夜培養(yǎng)。將長出的轉(zhuǎn)化子一一對應(yīng)擴(kuò)培到含10%蔗糖和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。在含蔗糖培養(yǎng)基上生長而在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不生長的單菌落即為發(fā)生第2次同源重組的菌株，進(jìn)一步通過菌液PCR驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子。按照此方法，將質(zhì)粒icd-ms-pK18mobsacB轉(zhuǎn)入到C. glutamicum/dCas9Δaldh中，獲得陽性工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh。將icl基因過表達(dá)質(zhì)粒iclpXMJ19GZ轉(zhuǎn)入到C. glutamicum/icd-msΔlldh中，獲得陽性工程菌C. glutamicum/icl。

1.3.5 乙醛酸檢測方法的建立

將獲得的工程菌C. glutamicum/icl與野生菌分別接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖瓶振蕩過夜培養(yǎng)，分別以等OD值接種到含5%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同的條件下?lián)u瓶振蕩培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣，并測定菌體生長濃度，同時(shí)調(diào)節(jié)pH值，使之維持在7.0左右。將留存待測的樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min后，吸取上清液用0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾并稀釋，利用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中乙醛酸的含量。檢測條件為：Agilent 1200高效液相色譜儀，紫外檢測器，BDS HYPERSIL C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相為20 mmol/L KH2PO4（pH 2.8）和乙腈混合液，檢測波長210 nm，柱溫29 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

凝膠成像圖利用Visio軟件與PowerPoint處理并標(biāo)注，生長曲線圖利用Origin 8制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 dCas9表達(dá)盒基因置換aldh基因工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證

選取2 個(gè)轉(zhuǎn)化子對獲得的重組質(zhì)粒dCas 9-pK18mobsacB進(jìn)行PCR驗(yàn)證。如圖3所示，dCas9表達(dá)盒基因與陽性對照條帶大小一致，說明打靶質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 質(zhì)粒dCas9-pK18mobsacB PCR驗(yàn)證Fig. 3 PCR verification of plasmid dCas9-pK18mobsacB

將打靶質(zhì)粒dCas9-pK18mobsacB利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到野生型C. glutamicumATCC 13032菌株，選取4 個(gè)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。如圖4所示，aldh基因未能擴(kuò)增出，而dCas9基因與陽性對照條帶大小一致，從而說明dCas9表達(dá)盒基因置換了aldh基因的工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh構(gòu)建成功。

圖4 工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh菌液PCR驗(yàn)證Fig. 4 PCR verification of C. glutamicum/dCas9Δaldh

2.2 icd與ms基因sgRNA轉(zhuǎn)錄單元置換lldh基因工程菌構(gòu)建及驗(yàn)證

對獲得的打靶質(zhì)粒icd-ms-pK18mobsacB進(jìn)行酶切驗(yàn)證。如圖5所示，經(jīng)酶切后分別獲得5 400 bp和3 000 bp兩條片段，與pK18mobsacB質(zhì)粒和icd與ms基因sgRNA轉(zhuǎn)錄單元片段大小一致，說明打靶質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 質(zhì)粒icd-ms-pK18mobsacB酶切驗(yàn)證Fig. 5 Enzymatic digestion verification of icd-ms-pK18mobsacB

將打靶質(zhì)粒icd-ms-pK18mobsacB利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到已驗(yàn)證正確的工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh中，選取4 個(gè)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。如圖6所示，lldh基因未擴(kuò)增出條帶，而icd-sgRNA基因大小、ms-sgRNA基因大小均與陽性對照條帶大小一致，從而說明icd與ms基因sgRNA轉(zhuǎn)錄單元基因置換lldh基因的工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh構(gòu)建成功。

圖6 工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh菌液PCR驗(yàn)證Fig. 6 PCR verification of C. glutamicum/icd-msΔlldh

2.3 過表達(dá)icl基因的工程菌構(gòu)建及驗(yàn)證

對獲得的表達(dá)質(zhì)粒icl-pXMJ19GZ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。如圖7所示，經(jīng)酶切后獲得6 500 bp和1 600 bp兩條片段，與pXMJ19GZ質(zhì)粒和icl基因及啟動子sod基因搭接片段大小一致，說明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖7 質(zhì)粒icl- pXMJ19GZ酶切驗(yàn)證Fig. 7 Enzymatic digestion verification of icl-pXMJ19GZ

將表達(dá)質(zhì)粒icl-pXMJ19GZ利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到已驗(yàn)證正確的工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh，隨機(jī)挑取4 個(gè)單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證。如圖8所示，擴(kuò)增出的icl基因大小與陽性對照條帶大小一致，說明工程菌C. glutamicum/icl構(gòu)建成功。

圖8 工程菌C. glutamicum/icl菌液PCR驗(yàn)證Fig. 8 PCR verification of C. glutamicum/icl

2.4 工程菌生長狀況

工程菌與野生菌培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣，并測定菌體生長濃度。如圖9所示，野生菌和工程菌C. glutamicum/icl在0～24 h之間生長快速，24～48 h之間生長趨于平緩，二者生長趨勢幾近相同，說明敲除了aldh和lldh基因，同時(shí)沉默了icd和ms基因，并未影響菌株的糖酵解途徑和TCA循環(huán)，菌株能正常生長。

圖9 野生菌與工程菌的生長情況Fig. 9 Growth curves of wild-type and engineered bacteria

2.5 工程菌乙醛酸的發(fā)酵

為檢測工程菌發(fā)酵液中乙醛酸產(chǎn)量，將工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh、C. glutamicum/icl與野生菌C. glutamicumATCC 13032同時(shí)以5%葡萄糖作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，連續(xù)培養(yǎng)48 h，期間每12 h取樣待檢測，利用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中乙醛酸含量。經(jīng)計(jì)算達(dá)到48 h發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，野生菌發(fā)酵液中乙醛酸幾乎為0，工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh發(fā)酵液中乙醛酸質(zhì)量濃度僅為1.05 mg/mL，而最終工程菌C. glutamicum/icl發(fā)酵液中乙醛酸質(zhì)量濃度為5 mg/mL，實(shí)現(xiàn)了乙醛酸從無到有的過程。在最終工程菌C. glutamicum/icl的發(fā)酵過程中，0～36 h乙醛酸積累量很少，36 h后開始逐漸積累。野生菌C. glutamicumATCC 13032和最終工程菌C. glutamicum/icl發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)出峰結(jié)果如圖10所示。

圖10 野生菌與工程菌發(fā)酵液液相圖譜Fig. 10 Liquid chromatograms of fermentation broths of wild-type and engineered bacteria

3 討 論

乙醛酸的生物合成法是近年來研究的熱點(diǎn)。目前，生物法主要是通過酵母的靜息細(xì)胞進(jìn)行生物催化反應(yīng)，利用乙醇酸氧化酶將乙醇酸氧化為乙醛酸[29]，反應(yīng)中需要以石油的衍生物乙醇酸作為底物，同時(shí)加入過氧化氫酶和黃素單核苷酸，此方法不僅操作復(fù)雜，而且生產(chǎn)成本高，嚴(yán)重限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。與之相比基因工程菌發(fā)酵法更有利于可持續(xù)發(fā)展，但關(guān)于基因工程菌發(fā)酵法生產(chǎn)乙醛酸的報(bào)道卻很少。Yang Chao等[30]發(fā)現(xiàn)通過提高異檸檬酸裂合酶基因icl的活性，可以增加流向乙醛酸旁路代謝通量；Toyoda等[31]通過敲除乳酸脫氫酶基因lldh，阻斷了丙酮酸與乳酸的旁路代謝，使丙酮酸大量積累；Eikmanns等[32]發(fā)現(xiàn)，通過基因克隆敲除異檸檬酸脫氫酶基因icd后，α-酮戊二酸生成量大大減少，而乙醛酸含量增加，但是由于異檸檬酸脫氫酶是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶，阻斷后造成菌體生長受到較大影響。

為解決敲除必需基因后影響菌體生長的問題，本研究借助CRISPRi技術(shù)，能夠在不影響細(xì)胞生長的前提下，對目標(biāo)產(chǎn)品的代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。在CRISPRi體系中，sgRNA能否高效準(zhǔn)確表達(dá)，也關(guān)乎其能否正確引導(dǎo)Cas9蛋白對目的基因進(jìn)行靶向編輯，因此sgRNA組件中啟動子和終止子的選擇也至關(guān)重要。Cleto等[12]選用誘導(dǎo)型啟動子tac，構(gòu)建了一系列sgRNA載體應(yīng)用于C. glutamicum的CRISPRi體系，通過添加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)sgRNA表達(dá)；Liu Jiao等[33]選用C. glutamicum中組成型強(qiáng)啟動子cspB的人工合成衍生體p11F作為其sgRNA組件的啟動子，選用rrnB作為其sgRNA組件的終止子，并對其效率進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)脫靶率下降至（1.3±0.2）×10-2，并認(rèn)為其更適合C. glutamicum的CRISPR/Cas9系統(tǒng)；Jiang Yu等[34]構(gòu)建了C. glutamicum的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)，選用人工合成的組成型啟動子j23119作為sgRNA組件的啟動子，選用rrnB作為其sgRNA組件的終止子，利用該系統(tǒng)對γ-谷氨酰激酶G149處進(jìn)行密碼子飽和突變，使其減輕對L-脯氨酸的抑制作用。本研究sgRNA組件中所采用的啟動子sod、tuf和終止子rrnB是天然啟動子及終止子，由于其轉(zhuǎn)錄范圍較大，不能精確表達(dá)Cas9蛋白特定的識別序列，因而在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中可能影響到Cas9蛋白的對目標(biāo)位置的精準(zhǔn)切割，影響到CRISPRi體系對目標(biāo)基因的調(diào)控范圍和強(qiáng)度。但在本研究中，通過檢測工程菌發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)與野生菌相比乙醛酸得到了積累，由此可以推斷本研究所選用的天然啟動子及終止子能夠應(yīng)用于CRISPRi調(diào)控體系。為進(jìn)一步提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，選擇更為確切的人工合成啟動子作為CRISPRi體系中sgRNA的啟動子，是本實(shí)驗(yàn)室未來工作的重點(diǎn)。

本研究敲除C. glutamicum支流代謝關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，并建立CRISPRi調(diào)控體系，利用該體系下調(diào)異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸合酶的表達(dá)，同時(shí)強(qiáng)化異檸檬酸裂合酶，使得工程菌與野生型相比較生長速度基本相同，在不影響生長的情況下，達(dá)到生物合成乙醛酸的目的，經(jīng)檢測工程菌培養(yǎng)48 h后的發(fā)酵液中乙醛酸質(zhì)量濃度為5 mg/mL。由此獲得的遺傳資源將為乙醛酸生物合成生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，此技術(shù)方法也為其他代謝工程產(chǎn)品研究提供借鑒。