超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定塑料食品接觸材料中9種熒光增白劑

張麗妮，鄒 孝，余文琴，但家宇，唐加利，高亞凱

（1.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶 401121；2.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331）

近年來，食品接觸材料遷移帶入的食品安全問題已經(jīng)引起了食品安全監(jiān)管部門的注意。這些食品接觸材料常使用的一些化學(xué)染料，如熒光增白劑，它在塑料材料中大量使用，是一種容易殘留并遷移到食品中的有毒有害物質(zhì)。據(jù)醫(yī)學(xué)實驗報道，熒光增白劑可使細胞產(chǎn)生變異，會通過與接觸的食品遷移進入人體或直接與人體表面皮膚接觸[1]。雖然食品接觸材料中批準使用的適量熒光增白劑屬低毒風(fēng)險，但違規(guī)添加及過量使用則會對人體健康構(gòu)成威脅，同時也是潛在的致癌因素之一[2-3]。我國GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》標準，歐盟2002/72/EC號指令及美國聯(lián)邦法規(guī)21CFR178.3297均制定了允許用于生產(chǎn)食品接觸材料和制品的熒光增白劑清單，同時還規(guī)定了最大使用量和特定遷移限量，如熒光增白劑FWA184，我國標準和歐盟標準一致，均規(guī)定其特定遷移限量為0.6 mg/kg，美國聯(lián)邦法規(guī)則規(guī)定其加入量不得超過0.015%[4-7]。

目前，關(guān)于洗滌用品、紡織用品、塑料制品中熒光增白劑的檢測技術(shù)多有報道[8-9]，國內(nèi)外學(xué)者針對熒光增白劑的研究主要有紫外分光光度法[10]、熒光光度法[11-12]、高效液相色譜法和超高效液相色譜法[13-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-29]等。紫外分光光度法和熒光分光光度法設(shè)備簡單、操作易行、檢測速率較快，但是干擾因素多、靈敏度不高，只能測定單一熒光增白劑或熒光增白劑總量，無法分析具體種類，而且環(huán)境因素對結(jié)果有影響；高效液相色譜法是目前技術(shù)相對成熟的一種檢測手段，對于較為復(fù)雜的基質(zhì)易受雜質(zhì)干擾，檢測結(jié)果準確性難以保證，且在分析多化合物時，不易分離或者分析時間過長；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法則是結(jié)合了液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點，通過保留時間與特征離子對目標物進行定性與定量分析，具有其他分析方法無可比擬的優(yōu)勢，對于復(fù)雜化合物的定性定量更為準確，因此，近些年學(xué)者開始研究開發(fā)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品接觸材料多種熒光增白劑的檢測方法。如呂水源等[30]建立了高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜同時測定塑料食品接觸材料中OB、OB-1、EBF、KCB 4 種熒光增白劑含量的檢測方法；許健等[31]建立了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定發(fā)泡聚苯乙烯餐具中FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 8 種熒光增白劑的含量。

雖然超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定塑料食品接觸材料中熒光增白劑已有報道，但目前仍沒有超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定塑料食品接觸材料中熒光增白劑的檢測標準，前人在研究時存在一些不足，一是研究選擇的材質(zhì)比較單一，二是對于多種熒光增白劑同時檢測的論述較少。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，以市場上常見的食品接觸材料為對象，在提取溶劑選擇和色譜條件優(yōu)化方面進行了大量的工作，以期建立一種適合多種塑料食品接觸材料材質(zhì)中9 種熒光增白劑同時檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，為市場監(jiān)管部門調(diào)查食品接觸材料中的熒光增白劑含量提供技術(shù)支持，同時也為相關(guān)標準的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塑料食品接觸材料樣本購自本地超市、甜品店、飯店；FWA199、FWA135、FWA378標準品（純度＞98%） 上海安譜實驗科技股份有限公司；FWA184、FWA52、FWA393 標準品（純度＞98%） 北京百靈威科技有限公司；FWA367標準品（純度＞98%） 英國Fluorochem化學(xué)有限公司；FWA185、FWA368對照品（純度＞95%） 濟南塑邦精細化工有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 成都科隆化學(xué)品有限公司；乙酸銨（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；三氯甲烷（分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC 1290/API 4000型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）） 美國Agilent公司/美國Sciex公司；Quintix224-1CN電子天平 德國Sartorius公司；PP020XXM1&PF2XXXXM1超純水機 英國Elga公司；VORTEX3旋渦混合器 德國IKA公司；3K15離心機德國Sigma公司；KH5200DE超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；MD200-2氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACOUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相；A為0.1%甲酸-乙腈溶液，B為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；碰撞氣（N2）壓力6 psi；氣簾氣（N2）壓力30 psi；霧化氣（N2）壓力60 psi；輔助加熱氣（N2）壓力60 psi；碰撞室出口電壓14 eV。監(jiān)測離子對、定量離子、去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2 9 種熒光增白劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for nine fluorescent whiteners

1.3.3 標準曲線的繪制

精密稱取各標準品25 mg，分別置于25 mL棕色容量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標儲備溶液，-18 ℃保存；將FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA367配成混合標準中間溶液，用甲醇逐級稀釋為線性范圍0.5～100 ng/mL，將FWA199、FWA368、FWA378、FWA393配成混和標準中間液，用甲醇逐級稀釋為線性范圍5～1 000 ng/mL。以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標，以定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 樣品處理

選取食品接觸類塑料包裝，如：飲用水瓶（聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET））、密胺餐具（密胺樹脂（melamine resin，MF））、一次性餐盒（聚丙烯（polypropylene，PP））、方便面桶（聚乙烯（polyethylene，PE）內(nèi)膜）、復(fù)合膜包裝袋（雙向拉伸尼龍/低密度聚乙烯（biaxially oriented polyamide(nylon) film/low-density polyethylene，BOPA/LDPE）復(fù)合）、鍍層塑料包裝（CPP鍍鋁膜）6 種材質(zhì)17 個代表性樣品，剪成小于5 mm×5 mm的碎片，混勻后分別裝入潔凈容器作為試樣，密封并做標識。

樣品前處理：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）已混勻的樣品于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入10 mL三氯甲烷，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至氮吹管中，繼續(xù)加入10 mL甲醇至比色管中，渦旋0.5 min，于40 ℃超聲提取30 min，以6 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移并合并2 次提取的上清液，于40 ℃氮吹至近干，殘渣用1.0 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm微孔有機濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定。

加標樣品制備：稱取0.5 g（精確至0.1 mg）經(jīng)前期檢測為陰性的試樣于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入適量混合標準溶液，室溫放置，待樣品吸收標液至干后，按上述步驟進行前處理。

1.3.5 提取溶劑選擇

本實驗以提取回收率為指標，以6 種材質(zhì)為基質(zhì)，對甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）溶劑進行比較研究，并確定合適的提取溶劑。

1.3.6 檢出限與定量限

按照1.3.4節(jié)樣品提取條件，以經(jīng)前期測試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，用陰性樣品加標實驗，以3 倍信噪比計算檢出限，以10 倍信噪比計算定量限。1.3.7 回收率與精密度

按照1.3.4節(jié)樣品提取條件，以經(jīng)前期測試不含本研究9 種熒光增白劑的樣品為本底，取樣品0.5 g，分別添加定量限的1、2 倍和10 倍3 個水平進行回收率實驗和精密度實驗，每個添加量進行6 次平行實驗，同時做空白實驗，均扣除本底值后計算加標回收率和相對標準偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果統(tǒng)計分析采用WPS 2019表格，圖像處理方法采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

據(jù)文獻報道，液相色譜-質(zhì)譜法檢測熒光增白劑主要使用的流動相通常為0.1%甲酸-乙腈（A）和水（B）[21]；0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸（B）[30]；乙腈（A）和乙酸銨緩沖溶液（B）[31]。實驗在借鑒前人使用流動相的基礎(chǔ)上對色譜條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)對本實驗的9 種目標熒光增白劑的分離效果不佳，峰形差。為了達到良好的分離效果和峰形，從流動相pH值穩(wěn)定性和離子強度進行改進。對比研究0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸溶液（B）、0.1%甲酸-乙腈（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）、0.1%甲酸-甲醇（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液（B）4 種流動相組合。首先使用0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸（B）和0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸（B）作為流動相時，分離度因個別峰的峰形寬及拖尾嚴重造成總離子流圖分離效果不佳，而后考慮加入5 mmol/L乙酸銨緩沖鹽使流動相保持一定的離子強度以改善峰形，使用0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相時效果明顯，分離效果好、峰形好、響應(yīng)高，但檢測時間稍長，考慮到這9 種熒光增白劑的極性偏弱，選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相時，洗脫能力增強，9 種熒光增白劑的保留時間減少，經(jīng)過梯度程序優(yōu)化，同樣能達到很好的分離效果，響應(yīng)更高，尤其是FWA378、FWA367、FWA184，比0.1%甲酸-甲醇（A）-0.1%甲酸-乙酸銨（B）流動相體系高3～5 倍。最終選擇0.1%甲酸-乙腈（A）-0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨（B）溶液作為流動相，并優(yōu)化梯度洗脫程序。9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖見圖1。

圖1 9 種熒光增白劑色譜分離的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms for chromatographic separation of nine fluorescent whiteners

2.2 提取溶劑的選擇

考慮到本實驗的9 種目標熒光增白劑屬于脂溶性熒光增白劑，提取溶劑需選擇有機溶劑。在前人的研究中，劉杰等[13]研究了三氯甲烷和甲醇對脂溶性熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）能夠兼顧回收率和峰形，吳鐘玲等[32]研究了甲醇、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF對脂溶性熒光增白劑的提取效果，結(jié)果表明三氯甲烷是最佳提取劑。葉玲等[33]比較研究三氯甲烷、甲醇、乙腈對熒光增白劑的提取效果，結(jié)果顯示三氯甲烷為最佳提取劑。本實驗選取甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、DMF為提取劑，在相同條件下（室溫超聲提取30 min，料液比0.5 g/10 mL），對6 種不同材質(zhì)的自制陽性樣品進行測試，比較不同材質(zhì)食品接觸材料中熒光增白劑在不同提取溶劑中的提取效果，由圖2可以看出，和前人研究結(jié)果一致，三氯甲烷和甲醇對6 種材質(zhì)的食品接觸材料中熒光增白劑的提取效果均優(yōu)于其他試劑，但二者對不同的熒光增白劑有著不同提取效率，前人的研究以使用三氯甲烷為主，甲醇的作用多為沉淀高聚物以減少雜質(zhì)的干擾[31]，并沒有考慮甲醇對個別熒光增白劑的萃取作用。本實驗在探索過程中發(fā)現(xiàn)甲醇對FWA52、FWA185、FWA368、FWA378的提取效果優(yōu)于三氯甲烷，劉杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷和甲醇作為提取溶劑時，甲醇含量超過三氯甲烷的1/4會導(dǎo)致目標熒光增白劑和高聚物一起析出，影響回收率，因此本實驗嘗試采用前人未曾摸索的兩種溶劑分兩步提取法，先用三氯甲烷超聲提取30 min，再用甲醇超聲提取30 min，合并2 次提取溶液，氮吹至近干后用1 mL甲醇溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜，上機檢測，圖3表明，分2 次提取6 種材質(zhì)食品接觸材料中的9 種熒光增白劑，雖然FWA52回收率較甲醇單獨提取有所降低，但9 種熒光增白劑整體回收率明顯優(yōu)于甲醇和三氯甲烷單獨提取的效果，說明三氯甲烷和甲醇分別提取熒光增白劑能夠起到互補作用。

圖2 提取溶劑對6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on the recovery of nine fluorescent brighteners in six food contact materials

圖3 甲醇、三氯甲烷、三氯甲烷和甲醇分2 次提取對6 種食品接觸材料中9 種熒光增白劑回收率的影響Fig. 3 Effects of individual and sequential extraction with chloroform and methanol on on the recovery of 9 fluorescent whitening agents in six food contact materials

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化通過在流動注射模式下對1.0 μg/mL的9 種熒光增白劑單獨進樣完成。根據(jù)9 種熒光增白劑的化合物結(jié)構(gòu)，選擇在正離子模式下進行優(yōu)化。采用一級質(zhì)譜對目標化合物進行母離子全掃描，分析得到[M+H]+分子離子峰；再采用二級質(zhì)譜，以分子離子為母離子，優(yōu)化去簇電壓、碰撞能量參數(shù)，對目標化合物的子離子進行全掃描，每種熒光增白劑選擇2 個信號穩(wěn)定且強度高的m/z為定性離子對，選著其中信號強度高且受基質(zhì)干擾小的m/z為定量離子對，結(jié)果見表2。9 種熒光增白劑提取離子色譜見圖4。

圖4 9 種熒光增白劑提取離子MRM色譜圖Fig. 4 Extracted ion MRM chromatograms of nine fluorescent whiteners

2.4 線性范圍、檢出限和定量限測定結(jié)果

根據(jù)1.3.3節(jié)方法配制混合標準系列，經(jīng)測試分析后得出標準曲線，用陰性樣品加標實驗，計算檢出限和定量限，結(jié)果見表3。9 種熒光增白劑在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9 9 9，檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，本方法線性范圍寬、靈敏度高。

表3 9 種熒光增白劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients,linear ranges, detection limits and quantitative limits for nine fluorescent brighteners

2.5 加標回收率和精密度實驗結(jié)果

如表4 可知，9 種熒光增白劑的平均回收率在76.11%～106.55%之間，相對標準偏差在1.97%～8.31%之間，表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實際樣品的檢測要求。

表4 9 種熒光增白劑的加標回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of nine fluorescent brighteners from spiked samples (n= 6)

2.6 實際樣品分析結(jié)果

采用最優(yōu)條件下的實驗方法對從超市、甜品店、飯店購買的17 個樣品進行測試，結(jié)果見表5，圖5為典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖和質(zhì)譜圖。由表5可看出，有15 個樣品檢出不同程度的熒光增白劑，主要集中在FWA135、FWA184、FWA378、FWA393，F(xiàn)WA393最高檢出含量1 380 μg/kg，而FWA135、FWA184、FWA378并不允許在食品接觸用塑料材料及制品中使用，由此可見，檢出樣品可能是由于污染帶入，或者是人為在塑料制品中違規(guī)使用禁用熒光增白劑，需要市場監(jiān)管部門加強監(jiān)督管理。同時本課題在接下來的研究中會對特定遷移量的模擬實驗進行研究。

表5 塑料食品接觸材料實際樣品中9 種熒光增白劑的含量Table 5 Contents of nine FWAs in actual samples of plastic food contact materials determined by the proposed method

圖5典型陽性樣品（YP-16）中檢出熒光增白劑（FWA393）的總離子流圖（A）和質(zhì)譜圖（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of fluorescent brightener (FWA393) in typical positive samples (YP-16)

3 結(jié) 論

本實驗建立了同時測定塑料食品接觸材料中FWA52、FWA135、FWA184、FWA185、FWA199、FWA367、FWA368、FWA378、FWA393 9 種熒光增白劑含量的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測方法。該方法條件下9 種熒光增白劑檢出限為0.05～3.2 μg/kg，定量限為0.2～10 μg/kg，在0.5～1 000 ng/mL范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9 9 9，加標回收率范圍為76.11%～106.55%，相對標準偏差（n=6）為1.97%～8.31%，均符合方法確認的要求，本方法成功應(yīng)用于塑料食品接觸材料中9 種熒光增白劑的快速定性定量分析，為檢測方法標準的制定提供依據(jù)，同時為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。