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    亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

    2021-01-20 01:46:06吳志殿謝承志黎金國吳維雄
    關(guān)鍵詞:氯丙嗪造模腦缺血

    吳志殿,謝承志,黎金國,吳維雄,于 航

    腦缺血一定時間再恢復(fù)血供,其功能不僅未恢復(fù),同時出現(xiàn)嚴重功能障礙,臨床稱為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI),隨著動脈溶栓技術(shù)在急性腦梗死治療中的廣泛開展,CIRI的有效防治是決定急性腦梗死病人預(yù)后的關(guān)鍵因素[1]。腦缺血發(fā)生后,亞低溫通過多種途徑發(fā)揮腦保護作用[2],氯丙嗪屬于吩噻嗪類抗精神病藥物,可阻斷大腦皮層多巴胺受體,抑制體溫調(diào)節(jié)中樞,降低體溫,阻斷外周α-腎上腺素受體,擴張血管[3];有研究顯示,亞低溫聯(lián)合吩噻嗪類藥物治療急性腦缺血可獲得顯著療效[4]。本研究觀察亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對CIRI大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及神經(jīng)保護作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠,體重250~300 g,購自海南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心,實驗動物許可證號:SCXK(瓊)2018-0012。溫度22℃,濕度56%,自由飲水,進食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

    1.2 實驗試劑與儀器 氯丙嗪購自常州康普藥業(yè)有限公司,神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、S-100β蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司,NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶(HO-1)、β-actin抗體購自美國proteintech公司,蛋白裂解液購自北京普利萊公司,Super ECL Plus超敏發(fā)光液購自美國Thermo pierce公司,電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一儀器廠,數(shù)位溫度表購自中國臺灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司,大鼠肛溫溫度計購自北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司,MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購自北航公司。

    1.3 動物分組和造模 將75只SD大鼠采用數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、CIRI組、亞低溫組、氯丙嗪組和亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組,每組15只。參照涂獻坤等[5]報道的方法制作CIRI模型,假手術(shù)組只暴露頸總動脈,不進行阻斷處理;CIRI組暴露頸總動脈后,使用動脈夾關(guān)閉頸總動脈90 min后松開,觀察恢復(fù)血供后縫合皮膚;亞低溫組先給予冰袋誘導(dǎo)低溫,之后再進行CIRI造模,造模過程中大鼠肛溫(肛溫溫度計插入大鼠肛門測定)應(yīng)降至(33±1)℃、鼓膜溫度降至(31±1)℃,持續(xù)亞低溫12h;氯丙嗪組先給予氯丙嗪(生理鹽水稀釋0.25 mg/mL,1.0 mg/kg)尾靜脈注射,之后再進行CIRI造模;亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組先給予亞低溫處理和靜脈注射氯丙嗪,之后再進行CIRI造模。24 h后進行相關(guān)功能和實驗室檢查。

    1.4 神經(jīng)功能檢查 使用神經(jīng)功能損傷評分(neuro-logical deficit scoring,NDS)評價各組大鼠神經(jīng)功能變化,0分為無神經(jīng)功能缺損,1分為前肢無法伸展,2分為前肢無法承受身體重量,3分為肢體無自發(fā)活動,4分無意識。

    1.5 實驗室檢查 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測NSE和S-100β蛋白表達水平,化學(xué)比色法檢測SOD,硫代巴比妥酸比色法檢測MDA。24 h后斷頭處死大鼠,取缺血區(qū)腦組織,加入1mL生理鹽水置于冰上勻漿,以1 500 r/min離心10 min,取上清液待測,嚴格按照試劑盒說明書操作,加入相關(guān)試劑,根據(jù)吸光度值,對應(yīng)標準品計算各指標樣品的表達水平。

    1.6 Western Blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白 缺血區(qū)腦組織加入1 mL生理鹽水置于冰上勻漿,以1 500 r/min離心10 min,取50 mg沉淀加入蛋白裂解液,提取細胞總蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜,5%脫脂奶粉封膜后加入Nrf2(1∶1000稀釋)、HO-1(1∶1000稀釋)或β-actin(1∶5000稀釋)一抗孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育2 h,Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯示條帶,應(yīng)用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)掃描條帶并計算各蛋白相對灰度值。

    2 結(jié) 果

    2.1 亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對CIRI大鼠神經(jīng)功能的影響 亞低溫組、氯丙嗪組和亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組NDS評分及NSE、S-100β蛋白表達水平均低于CIRI組(P<0.05或P<0.01);亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組NDS評分及NSE、S-100β蛋白表達水平均低于亞低溫組和氯丙嗪組(P<0.05)。詳見表1。

    表1 5組NDS評分和NSE、S-100β蛋白表達水平比較(±s)

    2.2 亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對CIRI大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 亞低溫組、氯丙嗪組和亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組SOD水平均高于CIRI組(P<0.05或P<0.01),MDA水平均低于CIRI組(P<0.05或P<0.01);亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組SOD水平均高于亞低溫組和氯丙嗪組(P<0.05),MDA水平均低于亞低溫組和氯丙嗪組(P<0.05)。詳見表2。

    表2 5組SOD和MDA水平比較(±s)

    2.3 亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對CIRI大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達的影響 亞低溫組、氯丙嗪組和亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組Nrf2和HO-1蛋白相對灰度值均高于CIRI組(P<0.01);亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組Nrf2和HO-1蛋白相對灰度值均高于亞低溫組和氯丙嗪組(P<0.01)。詳見表3、圖1。

    表3 5組Nrf2和HO-1蛋白相對灰度值比較(±s)

    圖1 5組Nrf2和HO-1蛋白表達的Western Blotting圖像

    3 討 論

    長期以來,物理低溫認為是一種有應(yīng)用前景的保護缺血性腦卒中神經(jīng)的治療方法[6],亞低溫對缺血再灌注的保護作用研究已有數(shù)十年[7]。李麗茹等[8]研究顯示,亞低溫可抑制腦缺血再灌注后自噬蛋白表達,改善模型大鼠認知障礙。劉劍等[9]研究顯示,亞低溫可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路保護肝臟缺血再灌注損傷。氯丙嗪是常用的吩噻嗪類抗精神病藥物,由于其高親脂性,易通過血腦屏障,產(chǎn)生人工冬眠的效果,氯丙嗪可促進血管舒張并抑制顫抖,從而平穩(wěn)快速地下降體溫,還可抑制缺血時線粒體通透性,減輕缺血損傷[10]。

    本研究使用亞低溫聯(lián)合氯丙嗪防治腦缺血再灌注損傷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組NDS評分低于亞低溫組和氯丙嗪組。NSE和S-100β蛋白是神經(jīng)元胞質(zhì)中的特異性蛋白,腦損傷時從細胞內(nèi)釋放到血液中,本研究結(jié)果顯示,亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組NSE和S-100β蛋白表達均低于亞低溫組和氯丙嗪組,說明聯(lián)合治療可降低CIRI大鼠腦損傷,并發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

    氧化應(yīng)激激活認為是缺血腦組織恢復(fù)血供后損傷的主要機制[11],MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的終末產(chǎn)物,SOD可參與氧自由基清除,拮抗氧化應(yīng)激[12]。本研究結(jié)果顯示,亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組SOD高于亞低溫組和氯丙嗪組,而MDA低于亞低溫組和氯丙嗪組組,說明亞低溫聯(lián)合氯丙嗪治療可減低缺血再灌注腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2/HO-1是人體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激調(diào)控通路,Nrf2調(diào)控下游靶基因HO-1表達,HO-1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用上調(diào)一些抗氧化基因[13],上調(diào)Nrf2/HO-1可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[14]。本研究結(jié)果顯示,亞低溫聯(lián)合氯丙嗪組Nrf2和HO-1蛋白表達高于亞低溫組和氯丙嗪組,說明亞低溫聯(lián)合氯丙嗪治療上調(diào)Nrf2/HO-1通路,可能是其發(fā)揮抗氧化的作用機制。

    綜上所述,亞低溫聯(lián)合氯丙嗪可上調(diào)Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化作用,進而對腦缺血再灌注大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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