濃香型白酒窖泥產(chǎn)酸菌協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

衛(wèi)春會(huì)，張?zhí)m蘭，羅惠波，劉淼，張宿義，黃治國，鄧杰

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

（2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

中國白酒是一種具有悠久歷史的蒸餾酒，很多重要的場合都離不開白酒的身影，白酒已成為我國文化的一部分[1,2]。濃香型白酒由于其與眾不同的發(fā)酵工藝和獨(dú)特的風(fēng)味特征，其生產(chǎn)及銷售比例占白酒總量的70%以上，在行業(yè)中占有重要地位[3-6]。濃香型白酒窖香濃郁，其香氣主要來源于發(fā)酵、蒸餾和陳釀過程，其風(fēng)味物質(zhì)絕大部分是在發(fā)酵階段產(chǎn)生，是發(fā)酵過程中原料在窖池和酒曲微生物及酶作用下的分解產(chǎn)物、微生物的代謝產(chǎn)物、代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化[7-11]。窖泥中微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性對(duì)白酒品質(zhì)具有重要影響[12,13]。長期的工藝操作使窖泥富集了種類繁多、功能各異的益于釀酒的微生物菌群[14-17]。產(chǎn)酸菌是最重要的窖泥功能菌之一，如己酸菌和丁酸菌，其數(shù)量的多少及功能強(qiáng)弱直接影響著濃香型大曲酒中特征風(fēng)味物質(zhì)的形成[18]。但在以往的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合功能微生物菌群從香味成分、酒質(zhì)都明顯優(yōu)于純功能菌株發(fā)酵，如張健等[19]以復(fù)合功能菌、純種己酸菌液、混合培養(yǎng)菌液分別培養(yǎng)人工窖泥，發(fā)現(xiàn)在微生物數(shù)量及感官評(píng)價(jià)上，復(fù)合功能菌液及混合培養(yǎng)菌液的人工窖泥優(yōu)于純種己酸菌培養(yǎng)的人工窖泥。萬朕[20]從優(yōu)質(zhì)窖泥篩選，2株產(chǎn)酸功能菌，己酸菌BLT-B03產(chǎn)酸量2.50 g/L、丁酸菌BLT-B02產(chǎn)酸量3 g/L，將其與酵母復(fù)配得到復(fù)合菌液應(yīng)用于新窖池的強(qiáng)化，經(jīng)過強(qiáng)化后，新窖池的生產(chǎn)能力已接近 10年窖齡的老窖池水平。任劍波等[21]將優(yōu)良窖泥功能菌株制成復(fù)合功能菌液，并用不同培養(yǎng)配方來培養(yǎng)復(fù)合功能菌液，通過對(duì)復(fù)合功能菌液的外觀特征、微生物指標(biāo)及微量成分分析表明，培養(yǎng)配方對(duì)菌液微生物生長、風(fēng)味物質(zhì)含量的影響是很明顯的。因此，將純菌種功能菌進(jìn)行復(fù)配，并對(duì)其培養(yǎng)配方進(jìn)行優(yōu)化研究是很有必要的，有利于改善和提高濃香型白酒的質(zhì)量。

菌的特性和發(fā)酵條件（包括培養(yǎng)基）影響著微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平，微生物的發(fā)酵產(chǎn)物的形成很大程度上受發(fā)酵條件的影響，每一種代謝產(chǎn)物都有其最適培養(yǎng)基配比和生產(chǎn)條件[22,23]。目前對(duì)窖泥中功能菌的研究主要集中進(jìn)行分離篩選及應(yīng)用于窖泥養(yǎng)護(hù)，對(duì)功能菌與其它菌種進(jìn)行復(fù)配及培養(yǎng)工藝優(yōu)化的研究相對(duì)較少。本研究在已選育的優(yōu)良產(chǎn)酸功能菌株的基礎(chǔ)上，將其進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，采用Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面試驗(yàn)確定其產(chǎn)己酸和丁酸協(xié)同效果的最優(yōu)組合，并進(jìn)行培養(yǎng)條件及培養(yǎng)配方優(yōu)化。通過不同產(chǎn)酸菌株的協(xié)同發(fā)酵，以制備產(chǎn)酸復(fù)合菌液，強(qiáng)化其發(fā)酵代謝產(chǎn)白酒風(fēng)味物質(zhì)的含量，從而提高己酸和丁酸產(chǎn)量，為功能菌應(yīng)用于窖池保養(yǎng)、人工窖泥培養(yǎng)及制作酯化液方面提供理論指導(dǎo)，可有效改善窖泥微生態(tài)環(huán)境，從而提高濃香型白酒的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis，SJ-1）、空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius，SJ-3）、丁酸梭菌亞種（Clostridium butyricum subsp，SJ-8），由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從濃香型白酒窖泥中分離篩選并保藏。

試劑：MES和 L-半胱氨酸鹽酸鹽、瓊脂糖（生化試劑），均購自Solarbio；氯化鈉、酵母粉、酵母膏、葡萄糖、硫酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂粉、MgSO4·7H2O、乙酸鈉（分析純），均購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇（色譜純），成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；己酸、丁酸（色譜純），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 RCM培養(yǎng)基（g/L）[24]

蛋白胨10.00、牛肉粉10.00、酵母粉3.00、葡萄糖5.00、可溶性淀粉1.00、氯化鈉3.00、乙酸鈉3.00、L-半胱胺酸鹽0.50、瓊脂0.50，pH 6.8，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

MES 0.50、磷酸二氫鉀0.50、硫酸鈉0.50、氯化鈉 1.00、MgCl2·6H2O 0.40、碳酸氫鈉 0.30、CaCl2·2H2O 0.15、酵母浸粉1.00、蛋白胨1.50、葡萄糖0.50、乙酸鈉3.00、可溶性淀粉5.00、丁酸鈉3.00、L-半胱氨酸鹽酸0.25，pH 6.8，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.3 富集培養(yǎng)基（g/L）

K2HPO40.40、無水乙醇20.00、酵母膏1.00、乙酸鈉5.00、MgSO4·7H2O 0.20、硫酸銨 0.50、黃水0.10，pH 6.8，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌15 min。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（LRH-250），上海一恒科技有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（HVE），Hirayama；厭氧工作站（AW200SG），金壇市科技分析儀器有限公司；厭氧罐（GM-300），Retsch；氮?dú)獯禎饪s儀（BF-2000M），北京八方世紀(jì)科技；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 GC-MS（7890A-5975B），安捷倫公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株活化

將保藏菌株SJ-1、SJ-3和SJ-8分別接種于RCM液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，于34 ℃厭氧培養(yǎng)10 d；將窖泥按3%接種于富集培養(yǎng)基中，于34 ℃厭氧條件下培養(yǎng)10 d，制成富集菌液。

1.4.2 菌株復(fù)配

將活化后的菌株SJ-1、SJ-3和SJ-8分別制成105個(gè)/mL的種子液，于80 ℃水浴處理10 min，分別按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵，于34 ℃厭氧培養(yǎng)10 d，通過GC-MS檢測己酸和丁酸的產(chǎn)量；選擇產(chǎn)酸能力效果較好SJ-1、SJ-3和SJ-8的作為復(fù)配優(yōu)勢菌株，與富集菌液分別按5%接種量接種，制成混菌種子液YY-SJ接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，于34 ℃厭氧培養(yǎng)10 d，并分析發(fā)酵液中己酸和丁酸的含量。

1.4.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別對(duì)接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。將活化的混菌種子液YY-SJ于80 ℃水浴處理10 min，選擇YY-SJ種子液的接種量分別為 1%、3%、5%、7%、9%、11%；發(fā)酵溫度分別為24、28、32、36、40、44 ℃；發(fā)酵時(shí)間分別為4、6、8、10、12、14 d，在厭氧條件下發(fā)酵，以己酸和丁酸含量為考察指標(biāo)并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，確定各因素的最佳發(fā)酵條件。

1.4.4 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗(yàn)設(shè)計(jì)[25-27]

1.4.4.1 部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用部分因子試驗(yàn)研究影響己酸和丁酸產(chǎn)量的 5個(gè)培養(yǎng)營養(yǎng)因子：初始pH（A）、乙醇（B）、蛋白胨（C）、乙酸鈉（D）和丁酸鈉（E）。每個(gè)因素都設(shè)高（+l）、中（0）、低（-1）三個(gè)水平，以己酸和丁酸的綜合值Y作為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及編碼見表1所示。

表1 部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of fractional factorial design

1.4.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)上一步部分因子試驗(yàn)回歸方程中各因素的系數(shù)確定最陡爬坡試驗(yàn)的步長和爬坡方向，以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的最大響應(yīng)值作為Box-Behnken試驗(yàn)分析的中心點(diǎn)[28]。

1.4.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由最陡爬坡試驗(yàn)確定了蛋白胨、乙酸鈉、丁酸鈉3個(gè)因素取值的中心點(diǎn)，在優(yōu)化的發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert.V 8.0.6軟件和Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，分別以蛋白胨、乙酸鈉和丁酸鈉添加量作為變量，并選取適當(dāng)?shù)乃?，以己酸和丁酸的綜合值Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及編碼值見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.4.5 樣品處理方法

取10 mL發(fā)酵液，酸化處理調(diào)節(jié)pH至4，添加15%的無水乙醚作為萃取溶劑，充分震蕩15 min，靜置分層2 h，再次震蕩10 min，使有機(jī)相充分溶于萃取試劑中，再靜置8 h分層。吸取上層有機(jī)相于離心管中，以6000 r/min離心10 min，吸取上清液，氮吹濃縮0.5 mL于進(jìn)樣瓶中，加入一定量的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)混勻，進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.6 丁酸和己酸定性和定量分析方法[29]

氣相色譜（GC）條件：DB-WAX（60 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱；載氣為高純He，流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度為60 ℃保持1 min，然后以8 ℃/min的升溫速率升至180 ℃保持2 min，再以15 ℃/min到230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜（MS）條件：電子離子源（EI），70 eV電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20 u～550 u，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃。

定性方法：將所得質(zhì)譜圖與NIST05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)，選擇匹配度大于80（最大值為100）特征離子進(jìn)行定性分析。

定量方法：內(nèi)標(biāo)法。以30 mg/100 mL的2-辛醇為標(biāo)準(zhǔn)物，根據(jù)公式1得出丁酸和己酸的含量。

式中，i：相對(duì)校正因子，其中i(己酸)=0.98，i(丁酸)=1.12；As：待測物峰面積；Ci：標(biāo)準(zhǔn)物濃度（mg/100 mL）；Ai：標(biāo)準(zhǔn)物峰面積；Cs：待測物濃度（mg/100 mL）。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.V 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重比較與q檢驗(yàn)。重復(fù)3次。

在響應(yīng)面分析中，對(duì)己酸和丁酸的檢測指標(biāo)采用Hassan方法，將各指標(biāo)均歸一化為0～1之間的值。如公式2：

式中：di：每組試驗(yàn)所測得的真實(shí)值；dmax：試驗(yàn)組中的最高值；dmin：試驗(yàn)組中的最低值。

考慮到己酸和丁酸均是濃香型白酒的主要風(fēng)味物質(zhì)前體。因此，將己酸和丁酸的權(quán)重值分別設(shè)為0.5，得到己酸和丁酸的綜合值Y，如公式3：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株協(xié)同發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果分析

圖1 不同菌株協(xié)同發(fā)酵對(duì)產(chǎn)物揮發(fā)性化合物含量的影響Fig.1 Effects of different bacterial strains on the volatile compounds content of the products by collaborative fermentation

在前期單菌發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì)檢測的研究結(jié)果表明，SJ-1、SJ-3和SJ-8的風(fēng)味物質(zhì)較好，且具有產(chǎn)酸功能，其對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)。其中SJ-1、SJ-8產(chǎn)丁酸，且SJ-8丁酸產(chǎn)量為378.63 mg/100 mL，SJ-3產(chǎn)己酸乙酯和丁酸乙酯分別為36.73 mg/100 mL、34.63 mg/100 mL；將菌株SJ-1、SJ-3、SJ-8作為優(yōu)勢菌株與富集菌液協(xié)同發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物揮發(fā)性總化合物、己酸和丁酸含量顯著高于其他各菌株協(xié)同發(fā)酵及富集液單獨(dú)發(fā)酵（p＜0.05），此結(jié)果與楊愛華[30]、陳新杰[31]、曹新志[32]等研究關(guān)于多種產(chǎn)酸菌混合培養(yǎng)產(chǎn)酸量優(yōu)于單一產(chǎn)酸菌培養(yǎng)相似。將兩種或兩種以上菌種混合培養(yǎng)可形成“互補(bǔ)”作用，不同菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物、代謝酶系等物質(zhì)能互為利用，從而有利于產(chǎn)物的積累[32,33]。不同菌株組合的協(xié)同發(fā)酵代謝產(chǎn)物試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

2.2 菌株協(xié)同發(fā)酵條件及驗(yàn)證

圖2 接種量（a）、發(fā)酵溫度（b）、發(fā)酵時(shí)間（c）對(duì)己酸和丁酸含量的影響Fig.2 Effects of inoculation amount (a), fermentation temperature (b) and fermentation time (c) on the production of hexanoic acid and butyric acid

接種量的多少影響菌種在發(fā)酵過程中的生長速度，從而直接影響發(fā)酵周期[34]。由圖 2a可知，己酸含量隨接種量的增加呈上升后下降趨勢，且在接種量為3%時(shí)，己酸量達(dá)到最大值，為658.13 mg/100 mL，產(chǎn)己酸量顯著高于其它接種量（p＜0.05）；丁酸含量隨接種量增加呈上升后趨于穩(wěn)定趨勢，在接種量為 3%時(shí)，丁酸量為871.96 mg/100 mL，丁酸含量變化穩(wěn)定無顯著差異（p＞0.05）。這說明在菌株接種量為3%時(shí)，產(chǎn)酸細(xì)菌活力強(qiáng)，協(xié)同作用達(dá)到了最優(yōu)值，故選擇接種量為3%。

由圖2b可知，發(fā)酵溫度對(duì)己酸的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，己酸和丁酸產(chǎn)量都達(dá)最高，分別為692.09 mg/100 mL、933.34 mg/100 mL，產(chǎn)己酸量顯著高于其它發(fā)酵溫度（p＜0.05）；丁酸含量隨發(fā)酵溫度的增長呈上升后趨于穩(wěn)定（p＞0.05）。濃香型白酒糟醅發(fā)酵溫度一般不高于35 ℃左右，適當(dāng)?shù)臏囟葘?duì)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸和產(chǎn)酯有積極影響，有利于功能菌快速被激活、繁殖及代謝，從而提高白酒質(zhì)量[35,36]，這說明該結(jié)果符合實(shí)際生產(chǎn)的需求。故選擇發(fā)酵溫度為28 ℃。

由圖2c可知，在發(fā)酵4～10 d時(shí)，己酸和丁酸量隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢（p＜0.05）；在12～14 d時(shí)，己酸和丁酸含量趨于穩(wěn)定且顯著高于4～10 d的產(chǎn)量（p＞0.05），在發(fā)酵時(shí)間為12 d，己酸和丁酸產(chǎn)量均達(dá)到最高，分別為593.68 mg/100 mL、937.35 mg/100 mL。這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)減少，且菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物過多可能抑制了菌株的協(xié)同發(fā)酵作用[34]。故選擇發(fā)酵時(shí)間為12 d。通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵條件最優(yōu)因素水平組合的丁酸和己酸都含量顯著高于各對(duì)照組（p＜0.05），如圖3所示。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 部分因子試驗(yàn)

通過選用N=5、試驗(yàn)組數(shù)為16次的部分因子試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基的主要影響因子，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測定結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3和表4可知，蛋白胨（C）對(duì)綜合值Y的具有極顯著影響（p＜0.0001），pH（A）、乙醇（B）、乙酸鈉（D）和丁酸鈉（E）對(duì)綜合值 Y具有顯著影響（p＜0.01）；模型中的交互項(xiàng)AE和BD對(duì)綜合值Y具有極顯著影響（p＜0.0001）；對(duì)部分因子試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，模型的決定系數(shù)R2=0.988，表明回歸方程模型有效；根據(jù)效應(yīng)系數(shù)，乙酸鈉、丁酸鈉對(duì)綜合值Y為正影響，pH、乙醇、蛋白胨對(duì)綜合值Y為負(fù)影響。

表3 部分因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測定結(jié)果Table 3 Results of factor test design and measurement

表4 部分因子試驗(yàn)方差分析Table 4 Factor test analysis of variance

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只在接近最佳值考察區(qū)域才近似真實(shí)情況，為了建立有效的響應(yīng)面擬合方程則需逼近此區(qū)域，常用最陡爬坡法快速逼近最佳值區(qū)域[37]。因此為了最大限度接近丁酸和己酸產(chǎn)量的真實(shí)值，選擇pH、乙酸鈉、丁酸鈉和蛋白胨作為無乙醇條件下的變量，適當(dāng)降低蛋白胨用量、pH值，增加乙酸鈉和丁酸鈉的用量。結(jié)果見表5。

己酸和丁酸的綜合值Y隨培養(yǎng)基中各組分含量的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。第4組、5組試驗(yàn)中己酸、丁酸的含量分別達(dá)到最大值，其中第4組試驗(yàn)中綜合值Y為0.960，達(dá)到最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果，表明各顯著影響因素在培養(yǎng)基中各組分的含量已接近最佳濃度范圍。即pH為6.4，蛋白胨為5.4 g/L、乙酸鈉為4.8 g/L、丁酸鈉為 4.2 g/L，以此濃度為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步Box-Behnken 試驗(yàn)分析。

2.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件進(jìn)行BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，以Y綜合值為響應(yīng)值，析因部分試驗(yàn) 12次，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)為 5次。BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。全變量編碼水平的二次回歸方程如下：

Y=0.86-0.044A+0.19B+0.21C-0.056AB-0.12AC-0.056BC- 0.29A2-0.21B2-0.17C2

由表7方差分析可知：該二次回歸模型p＜0.01，達(dá)到極顯著水平；模型中失擬項(xiàng)p=0.0654＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢韵鄬?duì)客觀良好反應(yīng)各個(gè)因素與Y綜合值之間的關(guān)系；回歸方程決定系數(shù)R2=0.8992，確定因素R2adj=0.7697，說明該模型可解釋90%響應(yīng)值變化，即Y綜合值的變化有90%來自所取自變量因素蛋白胨、乙酸鈉、丁酸鈉3項(xiàng)條件的變化。該二階回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，說明試驗(yàn)方法的可靠性比較高，可用發(fā)酵產(chǎn)己酸和丁酸對(duì)試驗(yàn)綜合評(píng)分值的理論預(yù)測?；貧w方程中C、A2對(duì)綜合評(píng)分值極顯著（p＜0.01），B、B2對(duì)綜合評(píng)分值影響顯著（p＜0.05），A、AB、AC、BC、C2不顯著（p＞0.05）。由此可知，各因素對(duì)己酸和丁酸產(chǎn)量綜合值Y的影響程度主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，即丁酸鈉＞乙酸鈉＞蛋白胨。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimengal design and results of steepest ascent path

表6 BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken design and corresponding results

14 3 5.4 4.8 4.2 1167.28 2359.74 0.902 17 4 5.4 4.8 4.2 1108.17 2302.58 0.736 4 5 6.6 5.4 4.2 996.00 2313.76 0.557 2 6 6.6 4.2 4.2 908.32 1996.76 0.048 3 7 4.2 5.4 4.2 1147.56 2289.45 0.788 5 8 4.2 4.8 3.8 957.28 1956.87 0.086 9 9 5.4 4.2 3.8 942.43 2054.54 0.172 1 10 4.2 4.2 4.2 906.79 2004.22 0.054 10 11 5.4 5.4 3.8 1002.57 2167.20 0.402 8 12 6.6 4.8 4.6 1024.20 2191.02 0.466 11 13 5.4 4.2 4.6 1099.54 2253.93 0.666 16 14 5.4 4.8 4.2 1162.57 2267.23 0.789 15 15 5.4 4.8 4.2 1199.74 2339.32 0.934 7 16 4.2 4.8 4.6 1123.67 2307.87 0.768 13 17 5.4 4.8 4.2 1152.15 2397.62 0.919

表7 BBD試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 The results of anova analysis of Box-Behnken design

2.3.4 顯著因素水平的優(yōu)化

為了更直觀反映蛋白胨(A)、乙酸鈉(B)和丁酸鈉(C)添加量之間的交互作用對(duì)綜合值 Y的影響，利用Design-Expert軟件繪制出各因素與響應(yīng)值之間三維空間曲線圖和等高線圖，如圖 4。響應(yīng)面圖形的響應(yīng)值是實(shí)驗(yàn)中各試驗(yàn)因子A、B和C兩兩交互作用，及最佳參數(shù)和各參數(shù)之間的相互作用所構(gòu)成的曲面圖；曲面越陡峭，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響就越顯著；同一等高線上的每個(gè)點(diǎn)代表的數(shù)值相同，而等高線的形狀可反映各因素之間交互作用的顯著性，等高線為橢圓形，則試驗(yàn)因子兩兩交互作用差異性顯著，若為圓形則差異性不顯著[38-40]。

回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)蛋白胨A、乙酸鈉B、丁酸鈉C的編碼值分別為5.10、5.04、4.45，此時(shí)Y綜合值為0.962，己酸和丁酸的產(chǎn)量分別為1184.21 mg/100 mL和2387.84 mg/100 mL。即當(dāng)?shù)鞍纂?、乙酸鈉和丁酸鈉的添加量分別為5.10、5.04和4.45 g/L時(shí)，該模型預(yù)測的最大Y綜合值為0.962，己酸和丁酸的產(chǎn)量最大估計(jì)值分別為 1184.21 mg/100 mL和 2387.84 mg/100 mL。

圖4 蛋白胨A、乙酸鈉B和丁酸鈉C添加量三因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分值的影響Fig.4 Effect of three factors of peptone sodium A, acetate B and butyrate C amount on the composite score value

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為表明響應(yīng)面模型的有效性，對(duì)其結(jié)果及其驗(yàn)證試驗(yàn)。利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基條件（蛋白胨5.10 g/L、乙酸鈉5.04 g/L、丁酸鈉4.55 g/L）進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，產(chǎn)己酸含量和丁酸含量分別為 1156.21、2345.84 mg/100 mL；以未優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，且試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值進(jìn)行對(duì)比，其結(jié)果見圖5所示，應(yīng)用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物己酸和丁酸含量都顯著高于優(yōu)化前（p＜0.05）（圖5a）；驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值差異不顯著（p＞0.05）（圖5b）。

圖5 營養(yǎng)因子優(yōu)化驗(yàn)證Fig.5 Nutrient factor optimization verification

3 結(jié)論

3.1 本研究通過對(duì)特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis，SJ-1）、空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius，SJ-3）、丁酸梭菌亞種（Clostridium butyricumsubsp，SJ-8）3株菌株與優(yōu)質(zhì)窖泥富集菌液分別按5%的接種量進(jìn)行復(fù)配；通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件：接種量 3%、培養(yǎng)溫度 28 ℃、發(fā)酵時(shí)間12 d、pH 6.4、蛋白胨5.10 g/L、乙酸鈉5.04 g/L和丁酸鈉4.45 g/L；丁酸鈉對(duì)己酸和丁酸的產(chǎn)量影響極顯著（p＜0.01），乙酸鈉影響顯著（p＜0.05），而蛋白胨不顯著（p＞0.05），但蛋白胨的二次項(xiàng)影響極顯著（p＜0.01）。在優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件下代謝產(chǎn)生的己酸和丁酸產(chǎn)量分別為1156.21、2345.84 mg/100 mL，相較于初始條件，優(yōu)化后的發(fā)酵條件使己酸含量和丁酸含量分別增加了3.32倍和3.22倍。結(jié)果表明：將不同產(chǎn)酸菌株進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵有利于提高己酸和丁酸的產(chǎn)量，其中特基拉芽孢桿菌SJ-1、空氣芽孢桿菌SJ-3、丁酸梭菌亞種 SJ-8和富集菌液協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)己酸和丁酸的量最佳；發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)因子影響己酸和丁酸的生成。

3.2 白酒釀造過程中，功能菌液的質(zhì)量影響著窖泥微生物生態(tài)功能，進(jìn)而影響白酒的質(zhì)量和風(fēng)格特征，通過厭氧梭菌和芽孢桿菌的復(fù)配工藝研究并優(yōu)化其產(chǎn)酸培養(yǎng)基，以此來強(qiáng)化其發(fā)酵代謝產(chǎn)白酒風(fēng)味物質(zhì)的含量，同時(shí)為功能菌在濃香型大曲酒的養(yǎng)窖、護(hù)窖、培養(yǎng)人工窖泥、制作酯化液等應(yīng)用方面提供理論參考，以改善和提高濃香型大曲酒的質(zhì)量。