蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)中產(chǎn)量及質(zhì)量的影響因素分析

陳思羽

（中南林業(yè)科技大學，湖南長沙 410000）

酶是一類具有生物催化活性的生物大分子物質(zhì)，可以分為蛋白質(zhì)酶和RNA 酶兩大類。酶可以在特定條件下催化生化反應，與無酶催化的化學反應相比，具有反應效率高、條件溫和等特點，而且酶通常具有很強的專一性，可以催化所需的特定反應，避免副反應發(fā)生，大大提高了原料的利用率。因此，酶在許多領(lǐng)域如化工、輕工、紡織、醫(yī)藥、食品等都有廣泛的應用。酶工程就是酶的生產(chǎn)、改性和應用的技術(shù)過程。

工業(yè)中應用的酶主要來源于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。與動植物源相比，微生物源酶具有來源廣泛、易分離、易大規(guī)模生產(chǎn)、不受季節(jié)、環(huán)境、倫理問題影響等諸多優(yōu)勢，微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是酶工程的基礎(chǔ)[1]。在應用酶的工業(yè)領(lǐng)域中，蛋白酶的應用最為廣泛，蛋白酶商業(yè)銷售額約占全球酶銷售總額的60%。因此，以蛋白酶為例，從菌種選育、酶學性質(zhì)、產(chǎn)酶條件3 個方面初步分析提高酶產(chǎn)量和質(zhì)量的方法，為生物酶制劑更廣泛的工業(yè)化提供思路[2-3]。

1 菌種選育

微生物類群所具有的生物多樣性是開發(fā)新蛋白酶和新產(chǎn)酶菌株的基礎(chǔ)。產(chǎn)酶菌種本身所具有的生理生化性質(zhì)是影響酶產(chǎn)量和質(zhì)量的最重要的因素之一?，F(xiàn)有常用產(chǎn)蛋白酶菌株包括細菌中的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、變形桿菌屬，霉菌中的曲霉、毛霉，放線菌中的諾卡氏菌和高溫放線菌等[4]。其中最主要的是芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[5]。

自然界中的野生型產(chǎn)酶菌株往往不能達到工業(yè)生產(chǎn)及商品化的要求，為了提高工業(yè)產(chǎn)酶的產(chǎn)量和質(zhì)量，通常會利用誘變育種、基因重組、原生質(zhì)體融合等遺傳學技術(shù)原理對野生型菌株進行適應性改造。

1.1 誘變育種

按誘變手段可將誘變育種分為物理誘變、化學誘變和生物誘變?nèi)箢?。常用的物理誘變因素包括紫外線、快中子、X 射線、γ 射線等，化學誘變因素包括堿基類似物如5-BU 和烷化劑等。王金才等[6]通過紫外誘變育得比出發(fā)菌株地衣芽孢桿菌HL-3酶活提高34.26%的菌株A2；王茜[7]以枯草芽孢桿菌AS1.398 為出發(fā)菌株，以等離子體和鈷60 伽馬射線處理誘變得到一株高產(chǎn)lCo16 號誘變菌株；馬宏宇等[8]以枯草芽孢桿菌Z5 為出發(fā)菌株，通過硫酸二乙酯誘變得到一株產(chǎn)新型蛋白酶的突變株Z5-14。

為了得到較好的誘變效果、提高誘變效率，育種工作中也常常采用復合誘變的方法。陳蘢[9]以野生型解淀粉芽孢桿菌CL-10 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和硫酸二乙酯復合誘變育得一株較出發(fā)菌株產(chǎn)量提高14.03%的突變株CL-10-1；黃子凌等[10]以枯草芽孢桿菌WT 為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和氯化鋰復合誘變得到一株產(chǎn)量提升44.2%的突變菌株UL-191；胡悅等[11]以地衣芽孢桿菌E-417 為出發(fā)菌株經(jīng)氯化鋰和等離子體復合誘變育得一株高產(chǎn)突變菌株F-3，產(chǎn)量提高75%。

1.2 基因重組育種

基因重組育種是指利用基因重組相關(guān)的原理和技術(shù)對微生物細胞進行改造。廣義上的基因重組分為3 個層面：個體水平，如生物個體間的雜交；細胞水平，如細胞融合和原生質(zhì)體融合；分子水平，如DNA雜交。對于微生物的雜交育種，由于其條件苛刻，要求進行雜交的兩親本菌必須具有有性生殖循環(huán)或準性生殖循環(huán)，且重組頻率極低，僅能達到10-7左右，因此應用較為困難，相關(guān)報道較少。

1976 年，F(xiàn)odor 等人[12]和Schaeffer 等人[13]最先發(fā)表了關(guān)于微生物原生質(zhì)體融合育種的報道，成功進行了巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的種內(nèi)原生質(zhì)體融合。該技術(shù)打破了遺傳物質(zhì)交流的最大障礙——細胞壁，有望實現(xiàn)跨種、屬等的遠緣雜交，因而倍受關(guān)注，并于20世紀70年代以來發(fā)展迅速。韓志雙等[14]以產(chǎn)酸性蛋白酶的米曲霉菌株Y-9 和F-5 為出發(fā)菌株，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)進行基因改組，育得產(chǎn)量較雙親本株分別提高253.37%和276.25%的重組米曲霉G11；朱振華[15]以黑曲霉UV-11 和枯草芽孢桿菌MC7 為雙親本經(jīng)原生質(zhì)體融合育得一株能產(chǎn)糖化酶和蛋白酶的融合子4-5#，蛋白酶產(chǎn)量較親本MC7提高7.8%。

分子層面的基因工程育種理論上是最易控制、成功率最高、真正能突破物種間障礙的實現(xiàn)幾乎所有生物間遠緣雜交的方法?；蚬こ痰闹饕襟E是：獲得目的基因；制備基因載體；連接目的基因與載體；將連接后的載體轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)，完成重組。感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法是最常見的將載體轉(zhuǎn)入的方法，周桂旭等[16]用Spizizen 低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pBE2R-AP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600 中育得可穩(wěn)定表達堿性蛋白酶的重組枯草芽孢桿菌工程菌；彭文堅等[17]將轉(zhuǎn)錄因子Aft1 轉(zhuǎn)入畢赤酵母Pichiapastoris GS115 中，得到SGT 胰蛋白酶較對照菌酶活提升19.71%的重組菌株P(guān)P-SGTm/Aft1；李怡欣等[18]將地衣芽孢桿菌subCopt基因與信號肽AmyE 連接，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌MA08 中，育得可分泌大量胞外酶且酶活提高73.4%的重組工程菌。

2 酶學性質(zhì)

在實際應用中，天然酶的特性往往也是限制其規(guī)?；褂玫囊蛩?，大多數(shù)天然酶的抗氧化能力較差，熱穩(wěn)定性、耐酸堿能力也往往不能達到工業(yè)要求。因此，為了適應工業(yè)化的大規(guī)模使用，天然結(jié)構(gòu)的酶通常需要用蛋白質(zhì)工程相關(guān)的原理和技術(shù)進行改造，通過替換基團、增減殘基、連接鍵等方式提高其抗氧化性、熱穩(wěn)定性、活性等。

Bassem 等[19]鑒定了對短小芽孢桿菌CBS 所產(chǎn)絲氨酸蛋白酶活性具有重要作用的5 個氨基酸殘基Leu31、Thr33、Asn99、Phe159 和Gly182，構(gòu) 建 了12 個突變體，其中突變體N99Y 熱半衰期在50 ℃和60 ℃分別提高了440 min 和215 min，最適溫度從65 ℃上升到75 ℃。周桂旭[20]對蛋白酶BAPB92 第188、239 和262 位氨基酸殘基進行定點突變，構(gòu)建的4 個突變體熱穩(wěn)定性相比天然酶均得到提高，其中單一突變188 位和239 位氨基酸和組合突變A188P/V262I 的耐堿性也得到提高。湯恒[21]通過對蛋白酶SES7 進行理性設(shè)計得到了底物選擇性和熱穩(wěn)定性均有所提高的突變體L2-5。

3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

微生物在自然條件下可產(chǎn)多種胞內(nèi)及胞外酶，但工業(yè)生產(chǎn)中其他雜酶往往會增加目標產(chǎn)物的分離難度。不同種類的微生物合成目標酶的代謝模式不同，最適條件也不同，有些酶的合成還受不同物質(zhì)的誘導或阻遏。而且合成酶的最適條件通常不是該微生物的最適生長條件，因此需要平衡產(chǎn)酶條件與生長條件，使產(chǎn)出最大化。工業(yè)生產(chǎn)中通過控制發(fā)酵產(chǎn)酶過程的工藝參數(shù)可以控制產(chǎn)酶微生物的代謝通路和合成模式，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，從而達到提高酶產(chǎn)量和質(zhì)量的目的。

耿靜等[22]從海水中篩得一株產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp. MK070915，以Gibbons 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)條件后，所產(chǎn)蛋白酶活性明顯提高。張秀江等[23]對菌株Bacillus subtilis YKM05 進行研究后發(fā)現(xiàn)其最適產(chǎn)酶誘導物為羽毛粉，Ca2+和Fe3+對產(chǎn)酶具有促進效果。優(yōu)化產(chǎn)酶條件后，酶產(chǎn)量最高達到650 U/mL。朱泓等[24]以枯草芽孢桿菌BY25 為材料，經(jīng)Box-Behnken 響應面實驗分析得到該菌最佳的產(chǎn)酶誘導物為豆制品廢渣，優(yōu)化培養(yǎng)條件后產(chǎn)酶活力從304 U/mL 提高至18 000 U/mL。喬傳麗等[25]從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離得到6 株產(chǎn)蛋白酶菌株，其中初始酶產(chǎn)量最高的庫德畢赤酵母D1-3經(jīng)優(yōu)化產(chǎn)酶條件后酶產(chǎn)量提高了37.98%。

4 結(jié)語

目前，工業(yè)應用領(lǐng)域的蛋白酶來源較為單一，因海洋微生物具有更強的抗逆性，所產(chǎn)蛋白酶具有更強的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性等，開發(fā)海洋來源的新蛋白酶具有較好的前景?？刂莆⑸锱囵B(yǎng)條件可以改變胞內(nèi)酶與胞外酶的分泌比例，極大地簡化后續(xù)的處理步驟。隨著對微生物源蛋白酶的更深入研究，酶工程將會在更多領(lǐng)域得到重視和應用。