不同基因型蕎麥遺傳轉(zhuǎn)化體系初探

王欣芳 馮晉芳 侯思宇 馮晉華 杜偉 馮紅梅 韓淵懷

摘要：本研究旨在利用遺傳轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)，打破蕎麥雜交困難、種質(zhì)創(chuàng)新難的瓶頸，提升蕎麥研究水平。本試驗(yàn)以甜蕎‘PI647061’和苦蕎‘ZNQ152’為材料，設(shè)置正交實(shí)驗(yàn)對下胚軸進(jìn)行組織培養(yǎng)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染愈傷組織，用組織化學(xué)染色觀察GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明：MS+2.0 mg/L 2，4-D+ 1.0 mg/L 6-BA可使下胚軸出愈率達(dá)90%以上。10種不同基因型蕎麥下胚軸在MS+0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA中分化率最高，再生率最高達(dá)52.6%。以攜帶遺傳轉(zhuǎn)化載體pRI201-AN-GUS的農(nóng)桿菌LBA4404侵染愈傷組織，經(jīng)選擇培養(yǎng)后獲得再生幼苗，進(jìn)而在葉片中成功觀察到GUS基因表達(dá)的藍(lán)色斑點(diǎn)，轉(zhuǎn)化陽性率為1.23%。本研究為探索關(guān)于蕎麥優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)化及建立有效的遺傳再生體系提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蕎麥；植物激素；愈傷組織；正交實(shí)驗(yàn)；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S517文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號：cjas20200200027

Genetic Transformation System of Different Genotypes of Buckwheat： A Preliminary Study Wang Xinfang1， Feng Jinfang1， Hou Siyu1， Feng Jinhua1， Du Wei1， Feng Hongmei1， Han Yuanhuai1，

Liu Longlong2， Ma Mingchuan2， Wang Junzhen3， Sun Zhaoxia1， Li Hongying1（1Agricultural College of Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China；

2Institute of Germplasm Resources， Shanxi Academy of Agriculture Science， Taiyuan 030031， Shanxi， China； 3Liangshan Xichang Institute of Agricultural Science， Xichang 615000， Sichuan， China）

Abstract： The aim is to utilize the basis of genetic transformation to break the bottleneck of buckwheat hybridization and germplasm innovation， and improve the research level of buckwheat. In this experiment， common buckwheat‘PI647061’and tartary buckwheat‘ZNQ152’were used as materials， and the hypocotyls were cultured by orthogonal experiment. The callus was infected by agrobacterium-mediated transformation， and the temporary expression of GUS gene was observed by histochemical staining. The results showed that MS+ 2.0 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L 6-BA could make the calli ratio of hypocotyls reach more than 90%. In MS + 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA， hypocotyls of ten species of buckwheat had the highest differentiation rates， and the highest regeneration rate was 52.6%. The calli were infected by agrobacterium tumefaciens LBA4404， which carried the genetic transformation vector pRI201- AN- GUS. And the regenerated seedlings were obtained after selective culture， and then the blue spots of GUS gene expression were successfully observed in the leaves. The positive rate of transformation was 1.23%. This study provides a theoretical and practical basis for the exploration of the transformation of buckwheat excellent genes and the establishment of an effective genetic regeneration system.

Keywords： Buckwheat； Plant Hormones； Callus； Orthogonal Experiment； Genetic Transformation

0引言

蕎麥（Fagopyrum spp.）是起源于中國的傳統(tǒng)作物[1]，有苦蕎（Fagopyrum tararicum Gaerth）和甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）兩個(gè)栽培種，以及被列為藥用植物的金蕎麥Fagopyrum dibotrys （D. Don） Hara）等十余個(gè)野生種[2]。蕎麥?zhǔn)且环N營養(yǎng)豐富的雜糧作物，其富含人體所需蛋白質(zhì)、必需氨基酸、黃酮類物質(zhì)（如蘆?。┖褪中约〈嫉萚3-4]，也是無麩質(zhì)健康食品，使其成為典型的“藥食同源”作物[5]。蕎麥以其對環(huán)境的強(qiáng)適應(yīng)性，成為高寒貧瘠及西部山區(qū)種植的重要作物[6]。山西省地理?xiàng)l件復(fù)雜，氣候條件差異較大，相比大規(guī)模的主糧種植，雜糧作物發(fā)展具有得天獨(dú)厚的地域優(yōu)勢[7]，因此大力發(fā)展蕎麥種植，不僅能提升蕎麥種質(zhì)資源利用，也為蕎麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及人民脫貧致富提供契機(jī)。

有關(guān)蕎麥育種的研究，目前多集中在如何提高其產(chǎn)量[8-11]，營養(yǎng)品質(zhì)[11-12]和加工特性[13]方面，但在分子生物學(xué)的研究尤其是轉(zhuǎn)基因及分子育種研究上仍然難有突破，究其原因是蕎麥離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究有限。隨著甜蕎和苦蕎基因組的陸續(xù)公布[14-15]，大規(guī)?；驍?shù)據(jù)公布，這為蕎麥基因功能的研究開拓了方向，同時(shí)也使得高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究成為了蕎麥研究最為迫切的需求。前期有關(guān)蕎麥離體再生的研究主要有Hou等[16]以蕎麥下胚軸為外植體，‘溫莎甜蕎’和‘九江苦蕎’在MS+3.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上出愈率均在80%～90%；‘平蕎2號’在MS+ 2.0 mg/L 2， 4-D+1.0-2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%[17]；當(dāng)2，4- D濃度為1.5 mg/L，6- BA為0.6 mg/L時(shí)‘西農(nóng)9976’獲得了較高的出愈率[18]；‘邵通苦蕎’和‘黑水苦蕎’在MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上出愈率可高達(dá)86.62%[19]；Shao等[20]發(fā)現(xiàn)，KT也是愈傷組織誘導(dǎo)有效的激素，如‘園子蕎’和‘西昌苦蕎’在MS+2.0 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L KT培養(yǎng)基上出愈率可達(dá)98.96%。對于外植體再生或分化研究，陳利紅等[17]和吳崇明等[20]發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在MS+ 0.1 mg/L IAA+ 2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LKT的培養(yǎng)基上分化率為73.6%；在MS+0.1 mg/L IAA+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0 .5 mg/L TDZ培養(yǎng)基上分化率可達(dá)9.52%。在遺傳轉(zhuǎn)化研究中，陸小平[21]以蕎麥幼苗階段的莖尖組織作為受體材料，建立了發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的金蕎麥高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系。Jovanka等[22]利用蕎麥子葉與根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過對DNA分析證實(shí)了根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，得出在T1代180粒種子有3/4帶有卡那霉素抗性，進(jìn)一步為蕎麥的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。潘燦飛等[23]利用農(nóng)桿菌R1601感染了金蕎麥的不同外植體（葉片、葉柄、愈傷組織），將R1601菌株中Ri質(zhì)粒的T-DNA整合到金蕎麥基因組中，并建立發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的金蕎麥高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系。豐明等[24]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將來源于干旱誘導(dǎo)下擬南芥的干旱調(diào)控基因DREB2A導(dǎo)入‘遼蕎5號’中，以提高其耐旱性。陳利紅等[25]將擬南芥液泡膜Na～+/H～+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到蕎麥中，利用基因工程手段提高作物對鹽脅迫耐受能力。上述研究均為蕎麥遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)施提供了借鑒，但仍難以突破轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定，受基因型影響較大的瓶頸。

本實(shí)驗(yàn)以10種蕎麥為試驗(yàn)材料，充分利用現(xiàn)階段所擁有的技術(shù)條件對蕎麥的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，摸索最適激素配比，深入探究蕎麥再生體系的影響因素。在此基礎(chǔ)上，以期建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為蕎麥種質(zhì)資源創(chuàng)新研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料：苦蕎‘ZNQ152’、‘ZNQ185’、‘ZNQ175’、‘ZNQ179’、‘ZNQ169’、‘甜蕎PI647061’、‘PI890988’、‘PI647597’、‘晉蕎1號’和‘溫莎甜蕎’由美國種質(zhì)資源信息網(wǎng)絡(luò)（GRIN），中國農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺（CGRIS）和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）農(nóng)作物品種資源研究所提供；含有表達(dá)載體（pRI201-AN-GUS）的農(nóng)桿菌LBA4404由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物工程研究所提供；GUS染色試劑盒SL7160購于北京酷來博科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)大樓組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，于2019年2月—2020年1月份進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1下胚軸離體材料獲取取健康飽滿的蕎麥種子放入0.1%的Tween 20溶液中浸泡20 min后依次用20%次氯酸鈉溶液和0.1%氯化汞溶液振蕩5 min，滅菌水沖洗5次以上（每次2～3 min）進(jìn)行消毒，晾干后將種子接種于MS基本培養(yǎng)基上（圖1A），（25±1）℃，暗培養(yǎng)4～ 6天。待無菌苗胚根、胚芽、下胚軸發(fā)育完全，下胚軸伸長至2.0 cm時(shí)（圖1B），用手術(shù)刀切成0.5 cm左右的小段，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以MS為基本培養(yǎng)基，對下胚軸設(shè)置2，4-D和6-BA激素濃度配比誘導(dǎo)愈傷組織的正交實(shí)驗(yàn)方案，設(shè)置3因素3水平[26]（表1），統(tǒng)計(jì)出愈率并用SPSS進(jìn)行方差分析。將下胚軸接種于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入10個(gè)外植體，設(shè)置5次重復(fù)，暗培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)至光下（3000Lux，周期為16 h的光照和8h的黑暗）培養(yǎng)15天，（25±1）℃，觀察下胚軸愈傷組織的狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)下胚軸的出愈率并進(jìn)行分析，篩選出最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3不同基因型蕎麥下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化試驗(yàn)將10個(gè)蕎麥品種分別接種在1.2.2中最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)出愈率。隨后將愈傷組織切割成0.5cm×0.5cm，轉(zhuǎn)接到以不同濃度配比的NAA（1.0mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L）和6-BA（0.5mg/L、1.0mg/L）的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)（表2），每2周繼代1次，統(tǒng)計(jì)分化率。

1.2.4外植體侵染及GUS染色試驗(yàn)侵染步驟參考張寧等[27]將農(nóng)桿菌菌株LBA4404的侵染液培養(yǎng)至OD600= 0.6～0.7時(shí)可用于侵染愈傷組織，不同的是LB液體培養(yǎng)基含有50 mg/L Kan+（卡那霉素），混濁后轉(zhuǎn)至相同LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.8～1.1，重新懸浮菌體的MS液體培養(yǎng)基含有250μmol/LAS（乙酰丁香酮）。愈傷組織侵染40 min，期間要經(jīng)?；蝿悠矫?，之后轉(zhuǎn)接至鋪有滅菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基（滴入3～4 mL MS+ 250μmol/LAS）中暗培養(yǎng)3天；再轉(zhuǎn)接至MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/LNAA+200 mg/LKan+培養(yǎng)基中篩選20～ 25天；挑選綠色葉片，浸泡在GUS染色液（5mLGUS緩沖液+0.1mLGUS濃縮液）中，于（25±2）℃保溫至過夜。染色完成后，將材料轉(zhuǎn)入70%乙醇脫色3次，至陰性對照材料為白色，將材料放置在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Design-Expert.V8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，用Duncan新復(fù)極差法分析。

2結(jié)果與分析

2.1蕎麥愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

將甜蕎‘PI647061’和苦蕎‘ZNQ152’下胚軸接種至9種愈傷組織培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21天后，觀察愈傷組織出愈情況，發(fā)現(xiàn)在2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)，僅有少量愈傷組織出現(xiàn)，出愈率較低（30.7%～49.4%）；當(dāng)2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，出愈率提高到50.8%～69.1%，且愈傷組織顏色偏白，結(jié)構(gòu)疏松；而當(dāng)2，4-D達(dá)到2.0 mg/L時(shí)愈傷組織生長快，顏色嫩綠，外周可見球狀突起，結(jié)構(gòu)疏松（圖1C-D）。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，‘PI647061’和‘ZNQ152’下胚軸出愈率會隨著2，4-D濃度的升高而提高；而6-BA對出愈率的影響是伴隨著2，4-D濃度升高而變化。由此得到甜蕎和苦蕎愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+ 2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，出愈率分別可達(dá)94.5%和92.6%（表3）。

將正交試驗(yàn)獲得的出愈率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，獲得以下結(jié)果分析（表4），回歸模型達(dá)到極顯著水平（P<0.01），失擬項(xiàng)P=0.4416>0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9501，校正決定系數(shù)R2Adj= 0.9001，說明試驗(yàn)結(jié)果有90.01%與響應(yīng)變量有關(guān)，模型與實(shí)際擬合度好，試驗(yàn)誤差小，可解釋大部分響應(yīng)值的變化，因此，可用此模型對蕎麥愈傷組織進(jìn)行分析和預(yù)測?；貧w模型ANOVA分析中通過F值可知，各個(gè)因素對下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織影響的主次順序?yàn)椋?，4-D（B）>6-BA（C）>品種/個(gè)（A）。其中，模型中一次項(xiàng)B和C對蕎麥愈傷誘導(dǎo)有極顯著影響（P<0.01），說明在不同激素濃度配比組合中，2，4-D和6-BA濃度變化對下胚軸愈傷組織的形成有極顯著的影響，特別是2，4-D濃度的變化。

2.2不同基因型蕎麥下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)及分化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1不同基因型蕎麥下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果將苦蕎‘ZNQ152’、‘ZNQ185’、‘ZNQ175’、‘ZNQ179’、‘ZNQ169’；甜蕎‘PI647061’、‘PI890988’、‘PI647597’、‘晉蕎1號’和‘溫莎甜蕎’十個(gè)蕎麥品種分別在含有MS+ 2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。結(jié)果表明：愈傷組織的誘導(dǎo)率整體在70%～ 90%之間，其中，‘PI647061’出愈率為93.42%，相較于其他品種的甜蕎出愈率達(dá)到了差異顯著水平，‘ZNQ152’出愈率為93.04%，與其他品種的苦蕎出愈率相比達(dá)到了差異極顯著水平，愈傷組織在3周后呈啞鈴型，膨大明顯，顏色以黃綠色為主，且后續(xù)的分化效率較高?！甈I647061’和‘ZNQ152’與其他8個(gè)品種相比達(dá)到了差異顯著水平。‘ZNQ169’出愈率為68.65%，誘導(dǎo)過程中愈傷組織生長較慢。說明不同基因型蕎麥對激素的敏感性有明顯不同。甜蕎的平均出愈率82.25%高于苦蕎的平均出愈率77.20%，說明甜蕎的基因型相較于苦蕎的基因型更有利于建立再生體系（表5）。

2.2.2不同基因型蕎麥愈傷組織分化結(jié)果將愈傷組織轉(zhuǎn)接到不同濃度配比的NAA（1.0 mg/L、0.5 mg/L和0.25 mg/L）和6-BA（0.5 mg/L和1.0 mg/L）分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)5周后（期間每2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)），統(tǒng)計(jì)分化率。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)15天后，愈傷組織的分化速度明顯較快，在進(jìn)入21天時(shí)，愈傷組織周圍的芽開始分化（圖1E-F）。在分化階段，應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，否則芽分化速率會有所降低，時(shí)間過長愈傷出現(xiàn)褐化。在MS+1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，分化過程中根毛的量在增加，這不利于后期芽的分化；在MS+0.25 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基中，愈傷組織的分化率有所升高；在MS+ 0.5 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中分化率最高（63.1%），愈傷在分化期間產(chǎn)生少量根毛，芽分化也較快。當(dāng)NAA：6-BA=1時(shí)，根毛大量產(chǎn)生，芽分化受到抑制。而當(dāng)NAA：6-BA=0.5時(shí)，愈傷組織分化能力較強(qiáng)，表明生長素（NAA）與細(xì)胞分裂素（6-BA）的不同比例能控制愈傷組織的分化程度。統(tǒng)計(jì)10種蕎麥愈傷組織轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基MS + 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA中的分化率（表6），‘PI647061’和‘ZNQ152’的分化率和再生率最高，這與前期愈傷組織長勢好有關(guān)。接著將分化的不定芽放置在1/2MS+ 0.5 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

2.3農(nóng)桿菌侵染及GUS染色結(jié)果分析

試驗(yàn)著手于確定未侵染愈傷組織對不同Kan+濃度的抗性，設(shè)置濃度為50、150、200 mg/L，黃化率分別為48%、63.16%、80%，最終將選擇培養(yǎng)基中的Kan+濃度設(shè)置為200 mg/L Kan+。關(guān)于侵染時(shí)間對侵染效果的影響，當(dāng)侵染液OD600=0.6～0.7的情況下，設(shè)置時(shí)間為15、30、45、60 min，在侵染15 min和30 min情況下，愈傷組織在選擇培養(yǎng)基中不再分化出葉片，后期愈傷組織褐化嚴(yán)重，侵染60 min時(shí)，污染情況嚴(yán)重，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在此基礎(chǔ)上選取‘PI647061’和‘ZNQ152’下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放入培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA）中預(yù)培養(yǎng)2天，將愈傷組織置于侵染液中浸泡45min左右，經(jīng)過共培養(yǎng)3天和篩選培養(yǎng)25天后，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織侵染后能觀察到新葉片。選擇綠色葉片進(jìn)行GUS染色，脫色，至陰性對照為白色（圖2），在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在‘PI647061’葉片處和‘ZNQ152’葉柄處觀察到藍(lán)色GUS基因表達(dá)位點(diǎn)，并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化陽性率為1.23%（轉(zhuǎn)基因幼苗數(shù)/用于侵染的愈傷組織數(shù)）。此處的轉(zhuǎn)基因幼苗所用的侵染條件：侵染時(shí)間40 min，OD600=0.634。通過對愈傷組織數(shù)、分化數(shù)和黃化數(shù)的統(tǒng)計(jì)得到以下結(jié)果：分化率為43.21%（分化數(shù)/愈傷組織數(shù)），黃化率為68.57%（黃化數(shù)/分化數(shù)），這里的黃化率低于200 mg/L Kan+濃度下未侵染愈傷組織再生苗的黃化率（80%），說明侵染試驗(yàn)中存在轉(zhuǎn)基因成功的幼苗。

3討論與結(jié)論

近年來，人們在植物組織培養(yǎng)技術(shù)方面取得了顯著進(jìn)步，其成果也廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和生活中。外植體的選擇是進(jìn)行植物組織培養(yǎng)、構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)選擇了較為常用、取材容易的下胚軸，這與王成龍[28]實(shí)驗(yàn)中蕎麥下胚軸再生能力最好的結(jié)論相符。

在再生植株誘導(dǎo)過程中，劉擁海等[29]通過探索苦蕎愈傷組織的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不同激素組合條件下愈傷組織的誘導(dǎo)效果有明顯差異。吳崇明等[18]研究了苦蕎離體再生體系，在保持2，4-D濃度為2.0 mg/L的情況下，逐漸增加6-BA的濃度，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之增加。樸蓮玉等[30]在誘導(dǎo)玉米愈傷組織中發(fā)現(xiàn)2，4-D的成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA；加了細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率雖然高，但褐化嚴(yán)重。Han等[31]和王愛國等[32]對蕎麥愈傷組織誘導(dǎo)的研究中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)率的提升對2，4-D表現(xiàn)出了明顯的依賴性。本文中正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)6-BA的濃度為1.0 mg/L時(shí)，隨著2，4-D濃度的增加，誘導(dǎo)率也在逐步升高，當(dāng)培養(yǎng)基為MS + 2，4- D 2.0 mg/L + 6- BA 1.0 mg/L時(shí)，甜蕎‘PI647061’最高出愈率為94.5%，苦蕎‘ZNQ152’為92.6%。其結(jié)果符合陳佳[33]實(shí)驗(yàn)中甜蕎胚軸在MS+ 2 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中愈傷組織生長狀態(tài)最好，最適合后期的分化再生。雖然本步驟嚴(yán)格按照正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索，但并未驗(yàn)證2，4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)為誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基，需要探究在繼續(xù)增加2，4-D濃度的情況下，統(tǒng)計(jì)下胚軸出愈率進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中‘PI647061’和‘ZNQ152’的出愈率與其他8個(gè)品種相比達(dá)到了差異顯著水平，表明不同品種對激素的最適濃度要求不同。此結(jié)果類似于吳崇明等[34]通過對比韃靼蕎麥發(fā)現(xiàn)普通蕎麥最佳的培養(yǎng)基配方并非是最適合的，普通蕎麥與韃靼蕎麥雖同為蕎麥屬，但生理生化特點(diǎn)仍然存在較大差異，存在著種間的差異性。品種間的差異導(dǎo)致組織培養(yǎng)過程的復(fù)雜性，適合一種蕎麥的培養(yǎng)基配方并不能用于全部品種，需要從種質(zhì)資源中挑選適合此配方的品種，再做進(jìn)一步的探究。本試驗(yàn)從愈傷組織誘導(dǎo)和分化過程中可知細(xì)胞分裂素添加量比生長素濃度高時(shí)，有利于愈傷分化。當(dāng)生長素濃度比細(xì)胞分裂素過高時(shí)，有利于根的培養(yǎng)，與王茅雁[35]文章中只添加一定濃度的生長素可誘導(dǎo)蕎麥不定芽生根相似。

在農(nóng)桿菌侵染過程中，由于農(nóng)桿菌對酚類化合物具有趨化性，因此在蕎麥遺傳轉(zhuǎn)化中添加誘導(dǎo)性最好的酚類化合物AS，能在一定程度上提高轉(zhuǎn)化率[36]。武小霞等[37]表明外植體的共培養(yǎng)基中添加AS是農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化能夠成功的重要因素。本試驗(yàn)在重懸液和共培養(yǎng)液體中添加250μmol/LAS用于侵染，相比鄭麗紅等[38]人報(bào)道的侵染大豆用200μmol/L的濃度略高，這表明不同植物對AS的敏感程度不同，需要試驗(yàn)驗(yàn)證。除此之外，影響轉(zhuǎn)化效率的因素還包括侵染菌株毒力、侵染時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度等。趙蓋超等[39]將‘晉蕎一號’葉片誘導(dǎo)的愈傷組織浸沒在攜帶pBI121質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌懸浮液中侵染30 min，最終獲得陽性愈傷組織。王成龍等[28]以不同苦蕎品種為試驗(yàn)材料，探討不同濃度的A4侵染液對毛狀根的誘導(dǎo)效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌液濃度OD600=0.6時(shí)，毛狀根誘導(dǎo)率最高；考慮到下胚軸幼嫩脆弱，本試驗(yàn)中選用了弱毒性的LBA4404作為宿主，菌液濃度與前兩者相近，為了保證侵染效率，適當(dāng)延長了侵染時(shí)間至40 min，取得了較高的侵染率。這提示我們在選擇侵染條件時(shí)要綜合考慮多方面因素，以取得最佳的試驗(yàn)效果。李占旗等[40]選擇‘鳳凰苦蕎’下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌LBA404侵染后再接種至MS無激素固體培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，具有較高的轉(zhuǎn)化效率。而田菲菲等[41]探究固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基對百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的影響，操作方法與本試驗(yàn)一致。研究結(jié)果表明液體共培養(yǎng)能顯著提高百合愈傷組織的瞬時(shí)表達(dá)率，同時(shí)也說明了此方法的可行性和有效性。在再生幼苗葉片經(jīng)GUS染色后，于佳淼等[42]使用70%乙醇進(jìn)行脫色與本試驗(yàn)相同，同時(shí)也告訴我們在進(jìn)行觀察時(shí)需要在材料處滴加少量水分，用毛筆和鑷子將植物鋪平再進(jìn)行拍照。

本研究以甜蕎‘PI647061’和苦蕎‘ZNQ152’下胚軸為外植體，設(shè)置正交實(shí)驗(yàn)分析出愈率發(fā)現(xiàn)下胚軸出愈率會隨著2，4-D濃度的升高而提高，而6-BA對出愈率的影響是伴隨著2，4-D濃度升高而變化，MS+ 2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA可使出愈率最高達(dá)94.5%。分析10種不同基因型蕎麥愈傷組織誘導(dǎo)后的分化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NAA：6-BA=0.5時(shí)，愈傷組織分化能力較強(qiáng)，說明生長素（NAA）與細(xì)胞分裂素（6-BA）的比例控制著愈傷組織的分化程度。用攜帶遺傳轉(zhuǎn)化載體pRI201-AN-GUS的農(nóng)桿菌LBA4404侵染愈傷組織，當(dāng)侵染時(shí)間為40 min，OD600=0.634時(shí)侵染效果較好，轉(zhuǎn)化陽性率為1.23%。

參考文獻(xiàn)

[1]史建強(qiáng)，李艷琴，張宗文，等.蕎麥及其野生種遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（3）：443-450.

[2]范昱，丁夢琦，張凱旋，等.蕎麥種質(zhì)資源概況[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2019，20（4）：813-828.

[3]尹禮國，鐘耕，劉雄，等.蕎麥營養(yǎng)特性、生理功能和藥用價(jià)值研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2002（5）：32-34.

[4]劉瑞敏.苦蕎降糖成分的提取與藥效初步研究[D].成都：四川師范大學(xué)，2012.

[5]雷建鑫，劉云梅，嚴(yán)柚芬，等.藥食同源作物蕎麥的營養(yǎng)保健價(jià)值及栽培技術(shù)[J].農(nóng)家參謀，2019（1）：58.

[6]桑滿杰，衛(wèi)海燕，毛亞娟.基于隨機(jī)森林的我國蕎麥適宜種植區(qū)劃及評價(jià)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（7）：46-52.

[7]梁宗棟.抓住育種源頭發(fā)展小雜糧產(chǎn)業(yè)[J].種子科技，2004，22（3）： 132-133.

[8]杜瑩.甜蕎不同花柱類型雜交后代遺傳表現(xiàn)及自交不親和性的SSR標(biāo)記分析[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[9]郭超.自花結(jié)實(shí)甜蕎雜交后代花柱類型、結(jié)實(shí)性分離及其SSR標(biāo)記[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[10]郭菊卉.普通蕎麥重組自交系群體SSR標(biāo)記遺傳作圖與重要農(nóng)藝性狀的QTL定位[D].貴陽：貴州師范大學(xué)，2014.

[11]楊麗娟.蕎麥種間雜種的細(xì)胞學(xué)觀察及不同環(huán)境對新類型苦蕎的產(chǎn)量與品質(zhì)的影響研究[D].貴陽：貴州師范大學(xué)，2019.

[12]賈彩鳳.藥用植物金蕎麥輻射誘變的早期選擇及分子標(biāo)記鑒定[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2008.

[13]陳慶富.蕎麥生產(chǎn)狀況及新類型栽培蕎麥育種研究的最新進(jìn)展[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)，2018，36（3）：1-7，131.

[14]Yasui Yasuo， Hirakawa Hideki， Ueno Mariko， et al. Assembly of the draft genome of buckwheat and its applications in identifying agronomically useful genes.[J]. DNAresearch，2016，23（3）.

[15]Zhang L J， Li X X， Ma B， et al. The Tartary Buckwheat Genome Provides Insights into Rutin Biosynthesis and Abiotic Stress Tolerance[J]. Molecular plant，2017，10（9）.

[16]Hou S， Sun Z， Linghu B， et al. Regeneration of buckwheat plantlets from hypocotyl and the influence of exogenous hormones on rutin content and rutin biosynthetic gene expression in vitro[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture 2015，120（3）：1159-1167.

[17]陳利紅，徐子勤.蕎麥組織培養(yǎng)及高頻植株再生體系的建立[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)，2006，39（5）：445-452.

[18]王鵬姬，高金鋒，蘇旺，等.培養(yǎng)條件對蕎麥愈傷組織生長及黃酮合成的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（5）：591-597.

[19]吳崇明，馬欣榮，楊宏.韃靼蕎麥離體再生體系的建立[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2009，15（6）：786-789.

[20]Shao J R， Zhou M L， Wu Y M， et al. Plantlet regeneration of Tartary buckwheat （Fagopyrum tataricum Gaertn.） in Vitro Tissue Cultures[J]. Protein & Peptide Letters， 2016， 23（5）： 68-77.

[21]陸小平，小島峰雄.整體植株轉(zhuǎn)化法在蕎麥上的應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào)， 2003（1）：159-160，164.

[22]Milju- Djuki J， NeKovi M， Ninkovi S， et al. Agrobacteriummediated transformation and plant regeneration of buckwheat（Fagopyrum esculentum Moench.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1992， 29（2）： 101-108.

[23]潘燦飛.Ri質(zhì)粒介導(dǎo)金蕎麥的遺傳轉(zhuǎn)化及毛狀根中類黃酮合成的調(diào)節(jié)[D].重慶：西南大學(xué)，2008.

[24]豐明，陳慶富，葛維德，薛仁風(fēng).抗旱調(diào)控基因DREB2A轉(zhuǎn)化遼蕎5號的研究[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，44（4）：29-36.

[25]陳利紅. AtNHX1基因?qū)κw麥的遺傳轉(zhuǎn)化及抗鹽再生植株的獲得[D].西安：西北大學(xué)，2007.

[26]蓋鈞鎰.試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[27]張寧，司懷軍，李學(xué)才，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].中國馬鈴薯，2004（3）：132-135.

[28]王成龍.苦蕎毛狀根的誘導(dǎo)及高頻再生體系的建立[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[29]劉擁海，俞樂，黃偉華，等.苦蕎種子萌發(fā)條件和愈傷組織的誘導(dǎo)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006（1）：12-14.

[30]樸蓮玉.玉米不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究[D].延邊：延邊大學(xué)，2013.

[31]Han， Myoung- Hae， Kamal， et al. Regeneration of plantlet via somatic embryogenesis from hypocotyls of Tartary Buckwheat（Fagopyrum tataricum）[J]. Australian Journal of Crop Science，2011， 5（7）.

[32]王愛國，張以忠，任翠娟，等.普通蕎麥愈傷組織誘導(dǎo)及其分化的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究[J].種子，2006（1）：7-10，13.

[33]陳佳.蕎麥無菌苗培養(yǎng)條件優(yōu)化及離體再生體系研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[34]王茅雁，錫建中，張晶，等.蕎麥愈傷組織的高頻率誘導(dǎo)和植株再生研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000（2）：41-44.

[35]劉香利，陳明利，趙惠賢.小麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及HMWGS1Bx14基因轉(zhuǎn)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，16（6）：25-31.

[36]鄧藝，曾炳山，趙思東，等.乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制及應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2229-2232.

[37]武小霞，李靜，王志坤，等.乙酰丁香酮濃度和共培養(yǎng)pH對大豆再生頻率的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（5）：1-4.

[38]鄭麗紅.大豆胚尖再生體系的優(yōu)化及EPSPS基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D].天津：天津大學(xué)，2012.

[39]趙蓋超，孫朝霞，令狐斌，等.甜蕎高效離體再生與GUS基因瞬時(shí)表達(dá)分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：1098-1101.

[40]李占旗.苦蕎離體再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].西安：西北大學(xué)，2007.

[41]田菲菲，劉雅莉，杜靈娟，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACO-RNAi載體對百合胚性愈傷的轉(zhuǎn)化[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，43（3）：105-112.

[42]于佳淼.大豆組織特異型啟動子表達(dá)特性分析[D].吉林：東北師范大學(xué)，2018.