氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食品中9種膽固醇氧化物

楊俊，吳軒民，侯璐，張協(xié)光，李忠，盧燦鑫

1. 深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東）（深圳 518109）；2. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（南京 211166）

膽固醇氧化物（Cholesterol Oxidation Products，COPs）是膽固醇的氧化產(chǎn)物，普遍存在于肉制品、乳制品、蛋制品和動(dòng)物脂肪中[1]。在食品制作工藝流程和處理過程中，膽固醇通過光、氧及高溫等作用容易發(fā)生自身氧化反應(yīng)，進(jìn)而衍生成膽固醇氧化產(chǎn)物[2]。膽固醇氧化物對(duì)健康存在一定損害，醫(yī)學(xué)研究已指出膽固醇氧化物與人體動(dòng)脈硬化[3]、基因突變[4]以及致癌[5]有直接關(guān)系。

目前，膽固醇氧化物的檢測(cè)方法有氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]等。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合了氣相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，其利用毛細(xì)管柱和單重四極桿檢測(cè)器，可以克服基質(zhì)干擾，有更好的分辨率、更高的靈敏度，具有很強(qiáng)的定性定量能力[10]。

此次試驗(yàn)依據(jù)傳統(tǒng)Folch提取法[11]，并作了一定改進(jìn)；探討了固相萃取柱對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，優(yōu)化了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的分離條件。同時(shí)，為了避免提取過程中可能會(huì)出現(xiàn)待測(cè)物的損失，影響試驗(yàn)結(jié)果，選擇19-羥基膽固醇作為試驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物[12]，以提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。以市面上的常見動(dòng)物源性的食品如魚肉、豬肉和牛肉為研究對(duì)象，對(duì)其COPs含量進(jìn)行檢測(cè)。分析新鮮肉制品和腌制處理過的肉制品中9種膽固醇氧化物含量差異情況，為食品中膽固醇氧化物檢測(cè)的提供了技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977B氣相質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；全自動(dòng)氮吹儀（上海安譜 EFAA-DC24）；超聲儀（予皓 YH-200DH）；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)（法國 Millipore）；電子天平（萬分之一，中國賽多利斯）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；SPE硅膠柱/氨基柱（500 mg/3 mL，美國Supelco公司）。

5β，6β-環(huán)氧化膽固醇（99%）、7α-羥基膽固醇（98%）、20α-羥基膽固醇（97%）、7β-羥基膽固醇（96.7%）、5α，6α-環(huán)膽固醇氧化物（92%）、3β，5α，6β-膽甾烷三醇（97%）、25-羥基膽固醇（98%）、7-酮基膽固醇（98%）、27-羥基膽固醇（97%）、19-羥基膽固醇（98%）：TRC公司；N, O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酞胺（BSTFA，含1%三甲基氯硅烷，Sigma-Aldrich公司）；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、丙酮（色譜純，Merck公司）；實(shí)驗(yàn)室用水（超純水）。試驗(yàn)中的魚肉、豬肉和牛肉等樣品（市售）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱，DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫升溫程序，初始溫度150 ℃（保持2 min）→20℃/min升溫至300 ℃（保持20 min）；進(jìn)樣口溫度，280 ℃；進(jìn)樣模式，不分流；進(jìn)樣量，1.0 μL；載氣，氦氣（He，純度＞99.999%）。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度，230 ℃；四極桿溫度，150 ℃；傳輸線溫度，250 ℃；電離方式，電子轟擊（EI）離子源；電子能量，70 eV；電子倍增器電壓，1 632 V；采集模式，離子掃描模式（SIM）；掃描質(zhì)量范圍，m/z50～550；溶劑延遲，8 min。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取0.005 0 g 10種膽固醇氧化物標(biāo)準(zhǔn)品，使用色譜純的正己烷定容至5.00 mL，超聲混合均勻，配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的膽固醇氧化物標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液。用正己烷逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，得到0.2，0.5，1.0，5.0和10.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，并且使得系列工作液中19-羥基膽固醇內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度均為0.2 μg/mL，放置于棕色瓶中。于4 ℃避光保存，保存期為1個(gè)月。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品脂類提取

準(zhǔn)確稱取2.0 g均質(zhì)粉碎的樣品于三角瓶中，加入2 μg 19-羥基膽固醇作為內(nèi)標(biāo)物。加入150 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）提取劑，充分振蕩2 min，然后超聲30 min；置于4 ℃環(huán)境中過夜，靜置分層，再用濾紙過濾，獲得濾液，氮?dú)獯蹈?，得到脂類物質(zhì)。

1.3.2 皂化

向1.3.1小節(jié)中得到的脂類提取物中加入10 mL 1 mol/L KOH溶液和10 mL甲醇，充分振蕩，超聲5 min，使樣品混合。室溫下靜置皂化10 h，然后用10 mL去離子水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯重復(fù)萃取3次。移取上層溶液，再用10 mL去離子水沖洗萃取液。用無水硫酸鈉過濾除水，獲得濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干。

1.3.3 凈化濃縮

向1.3.2小節(jié)中得到的皂化后的提取物中加入3 mL正己烷，充分振蕩溶解，然后緩慢加入到已活化的NH2-SPE中，依次用10 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5，V/V）、10 mL正己烷-乙酸乙酯（90∶10，V/V）洗柱，棄掉廢液，最后用5 mL丙酮洗柱，收集濾液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.4 衍生化

加入100 μL N, O-雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺BSTFA衍生試劑，在60 ℃下衍生40 min，衍生結(jié)束后，用氮?dú)獯蹈?，?.0 mL正己烷溶解，上機(jī)測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

固相萃取是利用柱填料對(duì)不同極性物質(zhì)的選擇性吸附與選擇性洗脫，從而實(shí)現(xiàn)樣品的凈化和濃縮。在提取的脂質(zhì)中，膽固醇脂類和三油甘脂極性最弱，磷脂類極性最強(qiáng)，而膽固醇和膽固醇氧化物具有中等極性[13]。因此，可以選擇極性的固相萃取柱，再用不同組分的極性溶劑洗脫，從而實(shí)現(xiàn)凈化和濃縮COPs。

此次試驗(yàn)選取2種常見的固相萃取柱（NH2-SPE和Si-SPE），先用5 mL正己烷活化，加入樣品后，按照?qǐng)D1的洗脫步驟，探討不同固相萃取柱對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用NH2-SPE具有更高的回收率（見圖2），因此試驗(yàn)選擇NH2-SPE進(jìn)行凈化濃縮操作。

圖1 不同SPE洗脫步驟示意圖

圖2 不同SPE類型的影響

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

考慮到COPs結(jié)構(gòu)相近，具有中等極性，試驗(yàn)選擇非極性柱DB-5ms毛細(xì)管色譜柱，并對(duì)10種COPs的色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定的柱溫箱升溫程序?yàn)椋撼跏贾鶞叵錅囟?50 ℃（保持2 min）→20 ℃/min升溫至300 ℃（保持20 min）。按照柱溫箱的優(yōu)化條件，確定質(zhì)譜端選擇電子轟擊離子源，能量設(shè)置為70 eV，電子倍增器電壓設(shè)置為1 632 V；采集模式為SIM模式，掃描質(zhì)量范圍為m/z50～550。氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖如圖3所示，在最佳的色譜分離條件下，10種COPs在24 min內(nèi)能實(shí)現(xiàn)基線分離，分離效果良好；并且19-羥基膽固醇保留時(shí)間為16.8 min，位于保留時(shí)間中前段，與其他9種COPs沒有干擾，結(jié)果表明19-羥基膽固醇可以作為此次試驗(yàn)的內(nèi)標(biāo)物。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取膽固醇氧化物系列混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按1.3.4小節(jié)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，利用已建立的色譜分離條件，進(jìn)行測(cè)定分析。以9種COPs的定量離子峰面積與19-羥基膽固醇的定量離子峰面積的比值作Y軸，以9種COPs工作液濃度與19-羥基膽固醇濃度的比值作X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算即可得到9種膽固醇氧化物的含量。如表1所示，在0.2～10 μg/mL線性范圍內(nèi)，9種COPs的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，方法檢出限低于0.000 15 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

選取新鮮魚肉、豬肉和牛肉等樣品，分別均質(zhì)粉碎，作為空白樣品。添加高、中、低3個(gè)水平濃度的COPs系列混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按照1.3小節(jié)處理，進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3次（n=3）。如表2所示，9種COPs的加標(biāo)回收率在79.6%～101%之間，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于5%，表明該方法滿足魚肉、豬肉和牛肉等樣品中9種COPs含量的分析檢測(cè)。

圖3 10種COPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 μg/mL）的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖

表1 9種COPs的檢出限、線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）

表2 空白樣品中9種COPs的回收率和精密度（n=3）

接表2

2.3.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)上選取新鮮魚肉、新鮮豬肉、新鮮牛肉、腌制魚肉、腌制豬肉、腌制牛肉作為試驗(yàn)樣品，利用所建立的分析方法檢測(cè)COPs含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定兩次，取平均值，結(jié)果如表3所示。新鮮魚肉、豬肉和牛肉中COPs總量為未檢出，而腌制魚肉中COPs總量為4.55 mg/kg；腌制豬肉中COPs總量為5.91 mg/kg；腌制牛肉中COPs總量為6.43 mg/kg。腌制過的肉類食品中COPs含量顯著高于新鮮的同類食品，這表明在食品腌制處理過程中，膽固醇氧化產(chǎn)物在光、氧等作用下反應(yīng)產(chǎn)生。

表3 肉類樣品中9種COPs的含量（n=2）

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定食品中9種COPs含量的檢測(cè)方法。采用19-羥基膽固醇作為內(nèi)標(biāo)物，以提高檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。改進(jìn)了前處理方法，優(yōu)化了皂化條件、固相萃取柱以及氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀的分離條件，該方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度均能夠滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。通過對(duì)市售食品中COPs的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腌制過的肉類食品中COPs含量顯著高于新鮮的同類食品。此次試驗(yàn)為食品中膽固醇氧化物的檢測(cè)提供技術(shù)支持。