氣質聯(lián)用法快速測定肉制品中N-二甲基亞硝胺

侯靖，盧躍鵬，陳丹，王夢穎，涂鳳琴，劉夢婷

武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430012）

肉制品是中國人餐桌上廣受歡迎的美味，但是其可能存在的亞硝胺污染問題，成為消費者的一塊心病。亞硝胺類化合物中受關注最多的是N-二甲基亞硝胺，其為二甲胺和亞硝酸鹽作用形成的[1]，國際癌癥研究所（IARC）將其列為2A級致癌物，即對人類致癌性證據(jù)有限，對試驗動物致癌性證據(jù)充分的致癌物。GB 2762—2017規(guī)定肉制品中N-二甲基亞硝胺的限量為3.0 μg/kg。

無論是對肉制品中N-二甲基亞硝胺的污染情況調查，還是對N-二甲基亞硝胺控制方法的研究，均需要快速準確地對肉制品中N-二甲基亞硝胺含量進行檢測。常見N-二甲基亞硝胺檢測的前處理方法主要有水蒸氣蒸餾法[2]、直接溶劑提取法[3]和QuEChERS法[4-5]等。水蒸氣蒸餾法取樣量較大，操作復雜，且耗時較長，同時前處理過程中的液液萃取易造成待測物的損失，采用同位素稀釋的方法可以減少影響，增加定量的準確性[6]。因為同位素標樣價格較昂貴，如何減少樣品量，從而減少同位素標樣的使用，成為需要考慮的問題。直接使用二氯甲烷溶劑提取，方法較為簡便，前處理耗時短，且目標物損失少。但是對于含有脂肪的樣品，二氯甲烷會同時提取出大量的脂肪，影響檢測的準確性，并對儀器造成嚴重污染。N-二甲基亞硝胺的檢測可采用氣相色譜-熱能分析儀法[7]、氣相色譜-質譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[2,4-5]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[9]。氣相色譜-串聯(lián)質譜法因檢測靈敏度高、準確性好，成為N-二甲基亞硝胺檢測的主流方法。

試驗報道一種采用超純水提取、二氯甲烷反萃取的簡單前處理方法，結合氣相色譜-串聯(lián)質譜檢測，同位素稀釋法定量，用于肉制品中N-二甲基亞硝胺的快速檢測。方法準確、可靠，可為食品科學研究及食品安全監(jiān)管提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7890B-7010氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex-Genie 2渦旋混勻器（美國Scientific Industries公司）；Direct 8超純水機（德國Merck公司）；超聲波清洗機（英國Prima公司）。

N-二甲基亞硝胺（1 000 mg/L，美國O2si公司）；N-二甲基亞硝胺-D6（1 000 mg/L，美國O2si公司）；二氯甲烷（色譜純，德國Merck公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

將N-二甲基亞硝胺與N-二甲基亞硝胺-D6標準溶液用二氯甲烷分別稀釋至100和1 000 ng/mL，得到N-二甲基亞硝胺與N-二甲基亞硝胺-D6標準工作溶液。

1.2.2 標準系列溶液的配制

分別吸取5，10，20，50，100，200和500 μL質量濃度100 ng/mL的N-二甲基亞硝胺標準工作溶液，加入5 μL質量濃度1 000 ng/mL的N-二甲基亞硝胺-D6標準工作溶液，定容至1.00 mL，得到質量濃度范圍為0.5～50 ng/mL標準系列溶液。

1.2.3 樣品處理

稱取10 g粉碎后的樣品于旋蓋離心管中，加入100 μL質量濃度1 000 ng/mL的N-二甲基亞硝胺-D6標準工作溶液，加入20 mL超純水，旋緊管蓋后渦旋，超聲提取30 min，冷卻至室溫后以4 000 r/min離心5 min。吸取2 mL水提取液，注意避免吸到沉淀的樣品和水表層的油脂。提取液置于10 mL離心管內，加入2 mL有機溶液，充分渦旋混勻，以4 000 r/min離心5 min，移取有機溶液至進樣小瓶中，進行分析。

1.3 儀器分析條件

色譜條件：進樣口溫度280 ℃；進樣模式，不分流進樣；進樣量2 μL；色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣，氦氣（純度＞99.999%）；載氣流量1.0 mL/min；接口溫度250 ℃；程序升溫，50℃保持1 min，以10 ℃/min升至110 ℃，保持3 min，以40 ℃/min升至230 ℃，保持1 min。質譜條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；碰撞能量70 eV；化合物離子對見表1。

表1 N-二甲基亞硝胺的保留時間和質譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 儀器方法的優(yōu)化

對于氣相色譜，色譜柱的選擇與升溫程序的優(yōu)化是獲得良好色譜分離的關鍵。色譜柱選擇方法，考察常用的弱極性色譜柱HP-5MS毛細管柱與極性的HP-INNOWAX毛細管色譜柱。試驗表明，N-二甲基亞硝胺采用HP-5MS毛細管色譜柱分離時，色譜峰拖尾嚴重，采用HP-INNOWAX毛細管色譜柱分離時，峰型較好，且峰面積明顯大于同等濃度試樣在HP-5MS毛細管色譜柱分離時的峰面積，即具有更高的分析靈敏度。因此，選擇HP-INNOWAX毛細管色譜柱作為試驗用色譜組。對升溫程序的優(yōu)化，使N-二甲基亞硝胺在色譜柱上獲得更好的保留，以獲得更好的分離效果。質譜參數(shù)方面，對N-二甲基亞硝胺及N-二甲基亞硝胺-D6進行全掃描，獲得母離子信息，并在不同碰撞能量條件下進行二級質譜掃描，獲得子離子信息。選擇豐度高、干擾少的子離子，確定N-二甲基亞硝胺及N-二甲基亞硝胺-D6的定量與定性離子對，并對碰撞能量做進一步優(yōu)化?？瞻讟悠放c10 μg/kg加標樣品N-二甲基亞硝胺定量離子對色譜圖見圖1。

肉制品基質復雜，蛋白質、脂肪含量高，給前處理帶來極大困難。由于N-二甲基亞硝胺極性較大，選擇超純水進行提取，盡可能避免脂肪等非極性物質的干擾。對獲得的水提取液，采用等體積的有機溶劑進行反萃取，試驗考察乙酸乙酯、二氯甲烷和乙腈反萃取的效果。結果表明，采用乙酸乙酯反萃取時，N-二甲基亞硝胺的絕對回收率較低；使用乙腈反萃取時，N-二甲基亞硝胺的絕對回收率最好，但是干擾物峰也更多，同時使用乙腈反萃取時需要增加鹽析的步驟，增加前處理的復雜性。使用二氯甲烷反萃取的回收率也較好，干擾相對較少，故最終選擇二氯甲烷進行反萃取。

2.2 線性范圍與定量限

將N-二甲基亞硝胺及其同位素內標的標準系列溶液標準溶液進樣檢測，在0.5～50 ng/mL質量濃度范圍內，以N-二甲基亞硝胺與其同位素內標的相對峰面積y和性對濃度x進行線性回歸計算。線性方程為y=0.660 5x-0.029 3，相關系數(shù)R2=0.999 8，線性良好。在空白肉制品中添加不同量的N-二甲基亞硝胺，按該方法進行處理，以定量離子對性噪比不小于10計算，方法的定量限為1.0 μg/kg。

2.3 回收率與重復性

通過向空白肉制品基質中添加不同量的N-二甲基亞硝胺，分別制備低（1.0 ng/kg）、中（3.0 ng/kg）、高（10 ng/kg）3個濃度水平的空白加標樣品，進行回收率試驗，結果見表2。結果表明，N-二甲基亞硝胺在3個濃度水平下的平均回收率分別為120.9%，106.6%和97.5%，對應的相對標準偏差分別為5.90%，0.76%和1.51%。方法準確度和精密度良好，符合相關標準要求。

圖1 空白樣品（a）與10 μg/kg加標樣品（b）N-二甲基亞硝胺定量離子對色譜圖

表2 N-二甲基亞硝胺回收率及精密度（n=6）

2.4 實際樣品檢測

采用該方法對20批次市售肉制品進行N-二甲基亞硝胺含量測定，全部前處理過程耗時不超過2 h。結果顯示全部樣品均無高出定量限的N-二甲基亞硝胺被檢出。

3 結論

建立一種基于同位素稀釋-氣相色譜-串聯(lián)質譜測定肉制品中N-二甲基亞硝胺的方法，采用超純水對樣品進行提取，離心分離出水提取液后，用二氯甲烷進行反萃取，有機溶液進樣檢測。N-二甲基亞硝胺在1.0，3.0和10 μg/kg水平的加標回收率為97.5%～120.9%，相對標準偏差為0.76%～5.90%。相較GB 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》，方法前處理簡單快速，有機溶劑消耗量只有國家標準的1/125，準確度與精密度良好，是一種高效環(huán)保的肉制品中N-二甲基亞硝胺檢測方法。