蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

方建軍，張旭*，黃華*，王健，郭浩煒，毛小紅

1. 衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院（衢州 324000）；2. 浙江江山健康蜂業(yè)有限公司（江山 324100）

蜂王漿又名王漿、蜂皇漿、皇漿、蜂乳，是由適齡工蜂的舌腺和上顎腺所分泌的物質(zhì)，顏色為白色或淡黃色，味道酸且略帶辛辣、澀，被用作蜂王和蜜蜂幼蟲(chóng)的主要食物[1-3]。蜂王漿富含氨基酸、糖類(lèi)、有機(jī)酸等多種活性成分[4]，是集營(yíng)養(yǎng)、食療及保健多位一體的天然物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及護(hù)膚美容等其他多方面生理作用，被譽(yù)為“生命青春之源”[5]。中國(guó)是蜂王漿生產(chǎn)和出口第一大國(guó)，世界上90%以上的蜂王漿產(chǎn)自中國(guó)[6]，主要出口日本、歐盟和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和經(jīng)濟(jì)體[7]。隨著對(duì)蜂王漿的研究日益深入，其應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。

農(nóng)藥在防治農(nóng)作物、蔬菜、水果及除雜草等方面發(fā)揮重要作用，而蜜蜂通過(guò)采集花蜜過(guò)程間接將農(nóng)藥帶入產(chǎn)出的蜂王漿中，影響蜂王漿的食用安全[8-9]。

隨著蜂王漿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值認(rèn)可度的不斷提高，人們對(duì)其消費(fèi)需求不斷增長(zhǎng)，對(duì)其品質(zhì)要求也越來(lái)越高，農(nóng)藥殘留成為衡量蜂王漿產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)?！?/p>

1 蜂王漿農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀

國(guó)內(nèi)外的蜂王漿農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀并不樂(lè)觀，有機(jī)磷、有機(jī)氯、除草劑、殺螨劑、新煙堿類(lèi)等農(nóng)藥的廣泛使用，給蜂王漿產(chǎn)品的品質(zhì)安全帶來(lái)極大隱患[10-13]。自2001年以來(lái)，以蜂蜜和蜂王漿為代表的蜂產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留問(wèn)題受到關(guān)注，農(nóng)殘限度升級(jí)為出口蜂產(chǎn)品的常規(guī)品質(zhì)要求，也成為蜂產(chǎn)品出口貿(mào)易的綠色壁壘[14]。2019年，日本、歐盟對(duì)蜂王漿農(nóng)藥殘留限量要求提高，中國(guó)需要研究突破日本、歐盟技術(shù)壁壘的農(nóng)藥殘留檢測(cè)的法定標(biāo)準(zhǔn)，從而解決農(nóng)藥殘留問(wèn)題。以日本客戶(hù)需求為例，進(jìn)口的蜂王漿需要檢測(cè)多菌靈、克螨特、苯菌靈、蠅毒磷、氟胺氰菊酯、三唑醇、毒死蜱、吡氟氯禾靈、甲基硫菌靈、乙基硫菌靈、草甘膦、雙甲脒、雙甲脒代謝物2, 4-DMA、雙甲脒代謝物DMF、雙甲脒代謝物DMPF、雙甲脒代謝物總殘留量、氯苯胺靈等17種高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留。為保證國(guó)內(nèi)消費(fèi)市場(chǎng)和進(jìn)出口市場(chǎng)蜂王漿產(chǎn)品的品質(zhì)，針對(duì)中國(guó)蜂王漿農(nóng)殘檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)現(xiàn)狀和進(jìn)出口格局，加強(qiáng)對(duì)蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)刻不容緩。

2 蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法

蜂王漿基質(zhì)復(fù)雜、黏度大，在提取的時(shí)候雜質(zhì)多，易乳化，因此在對(duì)其進(jìn)行前處理的過(guò)程中，若提取試劑和方法不當(dāng)，則不利于目標(biāo)物的提取和分離。在國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)報(bào)道中，固相萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理。固相萃取技術(shù)利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的，具有操作簡(jiǎn)單、除雜效果好、待測(cè)組分回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

夏廣輝等[15]將蜂王漿樣品用乙腈-水（體積比1∶1）溶解提取，提取液用C18柱凈化，殺蟲(chóng)劑的平均加標(biāo)回收率在79.7%～82.5%。侯建波等[7]將蜂王漿樣品用氨水-乙腈（體積比5∶95）渦旋混勻，提取液經(jīng)過(guò)中性Al2O3固相萃取柱凈化，雙甲脒及其代謝物的平均加標(biāo)回收率在80%～110%。Gerardo等[16]將蜂王漿樣品經(jīng)過(guò)超純水初步溶解后，用1%乙腈-乙酸（V/V）振蕩提取后離心取上清液，用%乙腈-甲酸（V/V）振蕩提取后離心取上清液，提取液經(jīng)過(guò)C18、硅藻土和氧化鋅填充柱凈化后檢測(cè)，殺菌劑的平均回收率在70%～120%。李櫻紅等[14]將蜂王漿樣品經(jīng)過(guò)氨水溶解后，加入乙腈-水（體積比1∶1）渦旋振蕩提取，離心后上清液用HLB固相萃取小柱凈化后檢測(cè)，氟胺氰菊酯等7種高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥的平均回收率是81%～101%。周萍等[17]在堿性條件下用乙腈萃取，經(jīng)HLB柱凈化后檢測(cè)蜂王漿中的三唑醇、蠅毒磷和氟胺氰菊酯，平均回收率在78.9%～102.1%。GB 23200.101—2016[18]中將蜂王漿樣品先用水溶解后，加入正己烷-丙酮（1∶1）渦旋振蕩提取，離心后上清液濃縮經(jīng)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后檢測(cè)，殺螨劑的平均回收率在71%～115%。

3 蜂王漿中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法

對(duì)于蜂王漿中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行分析，由于復(fù)雜的混合物中的待測(cè)組分一般是mg/kg等級(jí)，屬于痕量分析[19]，為測(cè)得樣品中農(nóng)藥的準(zhǔn)確含量，使測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到相關(guān)規(guī)定，必須采用高靈敏度的痕量分析技術(shù)。針對(duì)蜂王漿中農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，主要有氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法和氣質(zhì)聯(lián)用法[20]。

3.1 高效氣相色譜法

氣相色譜法具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、選擇性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是分析有機(jī)化合物必不可少的一種手段，在化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等各大領(lǐng)域均有應(yīng)用[21]。Emmanouel等[11]將樣品經(jīng)過(guò)乙腈等溶劑振蕩提取和C18固相萃取技術(shù)凈化處理，利用氣相色譜法檢測(cè)蜂王漿中的有機(jī)氯和有機(jī)磷。譚韓英等[12]將樣品經(jīng)過(guò)乙腈、正己烷等有機(jī)溶劑溶解提取和Florisil固相萃取技術(shù)凈化處理，利用氣相色譜法測(cè)定蜂王漿中氟胺氰菊酯殘留量。GB 23200.100—2016[22]中將蜂王漿樣品用水溶解，加正己烷、丙酮、乙醚等溶劑處理后，經(jīng)過(guò)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，氣相色譜檢測(cè)菊酯類(lèi)農(nóng)藥。王祥云等[23]將蜂王漿樣品用水溶解，再加正己烷、丙酮、乙醚等溶劑處理后，經(jīng)過(guò)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，氣相色譜檢測(cè)氟胺氰菊酯農(nóng)藥。

3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法對(duì)于分析沸點(diǎn)高不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性不強(qiáng)和相對(duì)分子質(zhì)量大的有機(jī)化合物，可以較準(zhǔn)確地定性和定量。國(guó)內(nèi)外關(guān)于高效液相色譜法檢測(cè)蜂王漿中農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)資料不多，董盛月[24]用正己烷、二氯甲烷等溶劑提取后，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化處理，用超高效液相色譜梯度洗脫與紫外檢測(cè)器檢測(cè)蜂王漿中的氟氯苯氰菊酯與氟胺氰菊酯殘留。

3.3 氣相色譜-質(zhì)譜法

GC-MS技術(shù)是利用氣相色譜的高分離性結(jié)合質(zhì)譜能辨別出待測(cè)物的結(jié)構(gòu)，以達(dá)到待測(cè)物的定性定量檢測(cè)。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，其具有GC的高分辨率和MS的高靈敏度，是樣品中藥物與代謝物定性定量的有效工具。Gerardo等[25]將樣品用水溶解后，使用正己烷和乙酸乙酯提取，經(jīng)C18固相萃取柱凈化后GC-MS檢測(cè)蜂王漿中的多種農(nóng)藥殘留。周召千等[26]將樣品溶解后沉淀蛋白，在堿性條件下用正己烷、丙酮提取，用GC-MS檢測(cè)蜂王漿中的雙甲脒殘留量。GB 23200.103—2016[27]方法將樣品用鹽酸溶液溶解，用正己烷、乙醚、丙酮等溶劑提取凈化，得到的樣液用GC-MS檢測(cè)蜂王漿中的雙甲脒及其代謝物殘留量。GB 23200.103—2016[28]方法將樣品用水溶解，用正己烷、乙醚、丙酮等溶劑提取，經(jīng)弗羅里硅藻土固相萃取柱凈化后，得到的樣液用GC-MS檢測(cè)蜂王漿中多種殺螨劑殘留量。

3.4 液相色譜-質(zhì)譜法

LC-MS/MS技術(shù)利用液相色譜分離待測(cè)物與干擾物，通過(guò)質(zhì)譜對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)分析。該技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，被越來(lái)越廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域。侯建波等[29]將樣品用水溶解后，加入甲醇沉淀蛋白并提取，以PSA、C18和無(wú)水MgSO4為分散劑進(jìn)行QuEChERS凈化，采用LC-MS/MS檢測(cè)蜂王漿中多種新型煙堿類(lèi)藥物及其代謝物殘留量。Giroud等[10]將蜂王漿樣品用水溶解后，加乙腈、醋酸鹽緩沖液提取后經(jīng)-18 ℃冷凍存放15 h，離心分層取上清液，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥后加H2O/MeOH（80/20，V/V）復(fù)溶上LC-MS/MS檢測(cè)多種新型煙堿類(lèi)藥物及其代謝物殘留量。GB 23200.99—2016[30]將樣品加水溶解后，經(jīng)乙腈、氯化鈉、丙酮和乙醚處理后，用中性氧化鋁固相萃取柱凈化上LC-MS/MS檢測(cè)8種氨基甲酸類(lèi)農(nóng)藥殘留。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，飲食的安全與健康越來(lái)越受到重視，對(duì)于保健品的需求也不斷增加。蜂王漿是上等的具有多種保健功能的理想食品，因此需要有先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，保障其品質(zhì)安全。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂王漿的研究不斷增多，相關(guān)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)也不少，但是方法涉及的農(nóng)殘品種偏少，類(lèi)別單一，前處理過(guò)程和檢測(cè)手段不同且繁瑣，顯著增加企業(yè)日常品質(zhì)控制成本。同時(shí)隨著國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)提高，現(xiàn)有的法定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)不到檢測(cè)要求，以草甘膦為例，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道，無(wú)法滿(mǎn)足蜂王漿出口企業(yè)的實(shí)際需求。

針對(duì)中國(guó)蜂王漿農(nóng)殘檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)現(xiàn)狀和出口格局，以破解日本（我國(guó)蜂王漿最大出口國(guó)）技術(shù)壁壘為突破口，建立規(guī)范統(tǒng)一有效的多種高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法。方法的建立可供國(guó)內(nèi)乃至國(guó)外企業(yè)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)使用，避免重復(fù)建設(shè)，同時(shí)可以滿(mǎn)足日本客戶(hù)的需求，解決中國(guó)大部分蜂產(chǎn)品的技術(shù)壁壘問(wèn)題，因此研究科學(xué)合理的蜂王漿中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法具有迫切而深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。