黃秋葵多糖的提取純化及其噴霧干燥粉的開發(fā)

王坤立，傅嬈，李貝，倪元穎

1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）；2. 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心（北京 100083）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）別名秋葵、羊角豆、洋辣椒，屬于錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（AbelmoschusMedic），為一年生草本植物[1]。黃秋葵在中國種植面積逐漸擴大，是一種有較大經(jīng)濟潛力的新型蔬菜。研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵嫩莢中含有豐富的黏性多糖物質(zhì)，主要是由阿拉伯聚糖、鼠李糖、半乳聚糖、果膠類多糖及少量糖蛋白組成的混合物[1-2]。黏液是黃秋葵最突出的特點，此黏液可以助消化、防便秘、促進膽固醇物質(zhì)排出體外、治療胃炎、保護腸胃，潤滑關(guān)節(jié)、增強身體抵抗力、抗疲勞[3-4]。多糖是一種大分子化合物，具有非常重要的生物功能，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品功能化學(xué)關(guān)注的焦點之一[5-6]。多糖大多采用熱水浸泡提取[7]，但熱水浸提存在時間長、得率低的缺點。

隨著國民的健康意識越來越強，營養(yǎng)保健成為廣大人民群眾的基本需求之一。保健食品的功能也擴展到各種生物活性功能，如抗疲勞、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、降血脂等[8]。然而除了市場上出現(xiàn)的黃秋葵凍干食品、黃秋葵罐頭、黃秋葵餅干、黃秋葵酸奶等加工產(chǎn)品，黃秋葵的保健產(chǎn)品種類較少，因此具有很大開發(fā)空間。

采用超聲輔助熱水提取黃秋葵多糖，其效率較傳統(tǒng)熱水浸提法有顯著提高；鑒定黃秋葵多糖功能性多糖組分；研制黃秋葵多糖噴霧干燥粉，篩選多糖粉輔料，對多糖粉的收率、抗氧化能力進行測定。試驗旨在為黃秋葵的深加工、黃秋葵保健品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵（產(chǎn)于青海省貴德縣，冷凍運輸，-60 ℃凍存）。

DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B填料（Pharmacia公司）；葡聚糖T-series標準品（色譜純，Sigma公司）；麥芽糊精、β-環(huán)糊精、可溶性淀粉、卵磷脂、氫氧化鈣（均為食品級，廣州嘉德樂生化科技有限公司）；總抗氧化能力測定試劑（南京建成生物工程研究所）；其余試劑（均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；TH-500A梯度混合器（上海青浦滬西儀器廠）；HL-2恒流泵（上海滬西分析儀器廠）；BSZ-100自動部份收集器（上海滬西分析儀器廠）；Nicolet Nexus FT-IR紅外光譜儀（美國Thermo Electron公司）；DSH水分活度測定儀（上海佑科儀器儀表有限公司）；FB-110F1500ML噴霧干燥機（上海勵途機械設(shè)備工程有限公司）；Finnigan Trace GC-2000氣相色譜儀（美國Finnigan公司）；Finnigan DSQ質(zhì)譜儀（美國Thermo Finnigan公司）；高效液相色譜（美國Waters公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵粗多糖的提取純化

提?。簠⒄誛ang等[9]的方法進行黃秋葵粗多糖（ROP）的提取。ROP得率計算如式（1）。

ROP得率=粗多糖凍干粉質(zhì)量（g）/提取用黃秋葵干粉質(zhì)量（g）×100% （1）

純化：準確稱取ROP 70.0 mg，溶于21 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)孔徑0.45 μm混合纖維素微孔膜過濾。將處理好的樣品溶液緩慢上樣于DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱（2.6 cm×20 cm），吸附20 min。依次用150 mL緩沖液洗脫、200 mL含0～0.6 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，洗脫速度4 mL/min，8 mL/tube收集。采用苯酚-硫酸法測定樣品液中的糖含量[10-11]。根據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰，用扁平寬度26 mm、透過相對分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da的透析袋透析72 h，凍干。

1.3.2 黃秋葵粗多糖組分純度鑒定

凝膠柱層析檢測：準確稱取多糖樣品10.0 mg，溶于4 mL微濾水中，經(jīng)孔徑0.22 μm混合纖維素微孔膜過濾，上樣于Sepharose CL-6B凝膠柱。用0.15 mol/L NaCl的微濾水以1 mL/min，4.0 mL/tube洗脫樣品。采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中的糖含量。根據(jù)洗脫曲線收集洗脫峰，透析（方法同1.3.1），凍干。

高效液相色譜檢測：使用Shodex SB-805HQ色譜柱，以0.1 mol/L NaNO3為流動相，柱溫38 ℃、進樣量20 μL、體積流量0.8 mL/min、檢測池溫度45 ℃。用KANUER示差折光檢測器跟蹤檢測，得到樣品在色譜柱中的保留峰。用葡聚糖T-系列標準品：T-1（1 kDa），T-7（7 kDa），T-10（10 kDa），T-40（40 kDa），T-500（500 kDa），T-1000（1 000 kDa）作標準曲線[12]。根據(jù)標品的保留時間（x）和其相對分子質(zhì)量的對數(shù)（y）制作標準曲線，所得方程為y=-1.282 7x+20.136（R2=0.998 9）。

1.3.3 黃秋葵粗多糖組分的單糖組成分析

參照Li等[13]方法，取2 mg黃秋葵粗多糖組分樣品進行前處理。GC-MS色譜條件：采用Agilent公司的GC-MS分析儀進行分析，DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱溫50 ℃，100 ℃（15 ℃/min）、170 ℃（10 ℃/min）、300 ℃（3 ℃/min）；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃，以He作載氣，進樣量0.5 μL，流速0.8 mL/min，分流比1∶30；質(zhì)譜條件為電子轟擊源EI，電子能量70 eV，倍增器電壓350 V，接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍10～800 amu。

1.3.4 黃秋葵多糖噴霧干燥粉的開發(fā)

稱取一定量過孔徑0.425 mm篩的黃秋葵凍干粉[14]，經(jīng)脫脂、脫游離糖的前處理，分別按照1∶30（g/mL）的料液比加入去離子水，用飽和石灰水調(diào)節(jié)至pH 7.6±0.3。在功率522 W、溫度59 ℃下超聲30 min，以8 000 r/min離心8 min，取上清液。重復(fù)超聲提取操作3次，將上清液合并，減壓濃縮[9]。在進風(fēng)溫度170 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速21 r/min，通針8 s（通針間隔指2次噴霧的間隔時間），風(fēng)速50 Hz，進氣壓力0.5 MPa，添加7.5%卵磷脂，固形物含量1.1%條件下，考察不添加助干劑以及添加量為總固形物含量40%的不同助干劑（麥芽糊精、β-環(huán)糊精及可溶性淀粉）對產(chǎn)品噴霧干燥的綜合影響。

1.3.4.1 噴霧干燥工藝單因素試驗

在風(fēng)速50 Hz，進氣壓力0.5 MPa，添加7.5%卵磷脂，固形物含量1.1%條件下，分別考察β-環(huán)糊精添加量（10%，20%，30%，40%和50%）、進風(fēng)溫度（150，160，170，180和190 ℃）、蠕動泵轉(zhuǎn)速（17，19，21，23和25 r/min）、通針間隔（2，6，10，14和18 s）等對產(chǎn)品噴霧干燥的綜合影響。評價主要從含水率、粉末收率、抗氧化保留率和噴霧效果4個方面進行[15]。噴霧干燥粉末的含水率通過DSH水分活度測定儀測得。

粉末收率=噴霧干燥粉末質(zhì)量（g）/噴霧干燥液固形物含量（g）×100% （2）

具體評分方法為含水率、粉末收率和抗氧化保留率中的最大值定為10分，3項中其余的按照其與最大值的比例分別評分，最終的綜合評分結(jié)果等于3個指標的分值相加。噴霧效果則通過感官評定。

1.3.4.2 噴霧干燥工藝正交優(yōu)化試驗

通過單因素試驗，發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精添加量、進風(fēng)溫度和通針間隔3個因素對黃秋葵多糖液噴霧干燥效果的影響最大。以這3個因素為自變量，以單因素試驗得出的各個最佳條件為中心點，以黃秋葵多糖噴霧干燥粉的綜合評分為響應(yīng)值，進行三因素三水平正交試驗方案，詳細條件見表1。

表1 噴霧干燥試驗因素水平表

1.3.5 總抗氧化能力測定

采用南京建成總抗氧化能力測定試劑盒進行多糖干粉的抗氧化能力測定。以抗壞血酸為陽性對照，繪制標準曲線，y=0.004 48x+0.018 42（R2=0.997）。

總抗氧化能力定義：37 ℃時，與0.4 mL 10 mg/mL的樣品有相同吸光度（抗氧化效果）的抗壞血酸的量為總抗氧化能力（μg）。

抗氧化保留率=樣品的總抗氧化能力/黃秋葵多糖噴霧干燥原料的抗氧化能力×100% （3）

1.3.6 傅里葉紅外光譜掃描

參照Woo[15]的方法進行試驗。將黃秋葵多糖ROP-2與OPSP的紅外光譜掃描圖進行比對分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20分析軟件及Microsoft Excel 2010軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。顯著水平p=0.05，p＜0.05時，表示存在顯著性差異。采用Origin 9進行圖形處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵粗多糖的提取及純化

ROP的得率為10.35%，其中多糖含量為47.92%，蛋白質(zhì)含量為2.13%。試驗結(jié)果與已報道的熱水提取工藝[16]相比較，提取溫度下降31 ℃，提取時間縮短10 h，得率提高64.15%。

ROP的洗脫曲線如圖1，對其3個主要的峰分別命名為ROP-1、ROP-2和ROP-3。由去離子水洗脫得到ROP-1，由濃度約0.15 mol/L和0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫分別得到ROP-2和ROP-3。結(jié)果表明，試驗獲得的3種黃秋葵多糖組分中，ROP-2是中性多糖，ROP-1、ROP-3為酸性多糖。由于實際操作中ROP-1和ROP-3的得率過低，無法收集，故僅對ROP-2進行收集研究。進樣量70.00 mg，收集ROP-2 26.74 mg，得率為38.2%。

2.2 黃秋葵粗多糖組分純度鑒定

對ROP-2進行凝膠柱（Sepharose CL-6B）[17]和HPLC法[18]進行純度鑒定。從圖2和圖3均可以看出，ROP-2的洗脫曲線均為單一對稱峰，可以證明其為均一組分。圖3中ROP-2出峰時間為11.58 min，根據(jù)標準曲線方程y=-1.282 7x+20.136（R2=0.998 9）計算可以得出ROP-2的相對分子質(zhì)量為1.92×105Da。

圖1 離子交換層析結(jié)果

圖2 ROP-2 Sepharose CL-6B凝膠過濾曲線

圖3 ROP-2的HPLC洗脫曲線

2.3 黃秋葵粗多糖組分的單糖組成分析

通過GC-MS分析表明，ROP-2主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、鼠李糖組成。

2.4 黃秋葵多糖噴霧干燥粉助干劑的選擇

從表2可知，與未添加助干劑的樣品相比，3種助干劑均可大幅降低OPSP含水率并可提粉末收率。這主要是由于糖類玻璃化轉(zhuǎn)化溫度較低，黃秋葵多糖液糖類物質(zhì)含量較高，而3種助干劑均可提高樣品的玻璃化轉(zhuǎn)化溫度，使霧滴顆粒容易轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，從而提高粉末收率[19]。此外，助干劑為β-環(huán)糊精時，黃秋葵多糖噴霧干燥粉抗氧化保留率最高，達到83.64%±1.23%。這可能是由于β-環(huán)糊精是聚合度為7的低聚糖，其結(jié)構(gòu)具有高度的對稱性，呈圓筒形立體結(jié)構(gòu)，分子中的糖苷鍵是共平面，疏水性基團在環(huán)內(nèi)，親水性基團在環(huán)外，可使β-環(huán)糊精很容易包裹樣品中的抗氧化活性物質(zhì)，從而保護其不被高溫破壞[20]。綜合4項指標，采用β-環(huán)糊精作為黃秋葵多糖液的噴霧干燥助干劑。

表2 不同助干劑對噴霧干燥效果的影響

2.5 噴霧干燥工藝單因素試驗結(jié)果

不同β-環(huán)糊精添加量的試驗結(jié)果（圖4A）表明，隨著添加量增加，OPSP的含水率下降，粉末收率明顯上升?？寡趸Ａ袈氏壬仙?0%添加量時達到最大值83.64%±1.23%，隨后稍有下降。這可能是因為添加量增大，對黃秋葵多糖的保護效果增強，故抗氧化保留率上升。但添加量過大會降低干粉中的多糖比例，故抗氧化保留率在較高添加量下成下降趨勢。從圖4A可以看出，在40%添加量時達到最大分值28.40±1.95，即噴霧干燥綜合效果最好。隨著添加量增大，噴霧效果有明顯改善，掛壁情況減輕、粉末分散性好、色澤佳。故選擇30%，40%和50%這3個添加量進行后續(xù)的正交試驗。

隨著溫度的升高，OPSP含水率明顯下降，粉末收率則先上升后下降；抗氧化保留率隨著溫度的升高顯著降低，推測是高溫破壞了多糖的結(jié)構(gòu)進而降低其抗氧化活性。從圖4B看出，進風(fēng)溫度在170 ℃時綜合評分達27.83±1.37。溫度較低時，有粘壁現(xiàn)象，隨著溫度上升，粘壁現(xiàn)象減輕、粉末分散性變好。但在190 ℃的高溫下，多糖干粉有輕微焦糊現(xiàn)象。綜合上述分析，選擇160，170和180 ℃這3個進風(fēng)溫度進行后續(xù)的正交試驗。

隨著蠕動泵轉(zhuǎn)速加快，OPSP含水率升高，粉末收率和抗氧化保留率都成先升高后降低的趨勢。因為轉(zhuǎn)速越高，進料速度越快，樣品中水分蒸發(fā)不完全，粘壁現(xiàn)象也較其他條件嚴重。圖4C為不同蠕動泵轉(zhuǎn)速的分數(shù)，在21 r/min時綜合評分顯著高于其他4個條件下的總分，達到28.82±1.57分，其他4個條件總分無顯著性差異。因此，選定21 r/min為噴霧干燥的蠕動泵轉(zhuǎn)速。

隨著通針間隔增長，各含水率之間無顯著性差異，粉末收率則呈先增長后下降趨勢。通針間隔短，噴霧壓力小，多糖液霧化顆粒無法形成，或形成的液滴顆粒直徑較大、比表面積小，熱交換不充分，故難以達到物料的玻璃化溫度，從而導(dǎo)致粉末收率較小；通針間隔大于14 s時，所形成的霧化液滴雖然水分蒸發(fā)面積大、熱交換充分，但由于顆粒小，容易被熱空氣帶走，粉末收率反而下降[20]。通針間隔過高或過低，都使得粘壁現(xiàn)象加重，噴霧效果相對較差。由圖4D可知，綜合評分呈現(xiàn)先增后減的趨勢，10 s時分數(shù)最大，為29.16±0.37。因此，選擇6，10和14 s 3個通針間隔進行后續(xù)的試驗。

圖4 噴霧干燥工藝單因素試驗結(jié)果

2.6 噴霧干燥工藝正交優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗中β-環(huán)糊精（A）、進風(fēng)溫度（B）和通針間隔（C）對噴霧干燥總分數(shù)的影響進行分析，以含水率、粉末收率和抗氧化保留率的綜合評分為指標，采用三因素三水平的正交設(shè)計，結(jié)果見表3和表4。由表3知，各因素的影響的主次順序為B＞A＞C（進風(fēng)溫度＞β-環(huán)糊精添加量＞通針間隔）。由表4知，β-環(huán)糊精添加量和進風(fēng)溫度的3個水平的變動均對噴霧干燥總分數(shù)有顯著性影響（pβ-環(huán)糊精添加量＜0.05，p進風(fēng)溫度＜0.01）；通針間隔（C）的F＜9，表明該因素的3個水平的變動對噴霧干燥總分數(shù)沒有顯著性影響。通過極差分析，可以確定正交試驗最佳組合為A2B2C1，最佳工藝條件為添加40%的β-環(huán)糊精，進風(fēng)溫度170 ℃，通針間隔6 s。經(jīng)驗證，在所得最佳工藝條件下，含水率3.29%，粉末得率45.26%，抗氧化保留率83.31%，總得分29.39分。

2.7 傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果

ROP-2與OPSP的紅外掃描圖譜重合性較高（圖5），說明噴霧干燥沒有給黃秋葵多糖的結(jié)構(gòu)和官能團造成太大改變。試驗證明ROP-2有體外抗氧化功能，故紅外掃描光譜給OPSP具有體外抗氧化性提供支持。

表3 正交試驗結(jié)果與極差分析

表4 正交試驗方差分析

圖5 ROP-2和OPSP的紅外掃描圖

3 結(jié)論

試驗制備ROP的超聲輔助提取與POSP。試驗的提取方式與現(xiàn)已報道的熱水提取工藝相比較，溫度下降31 ℃，提取時間縮短10 h，得率提高64.15%。因此超聲輔助提取是一個值得推廣的ROP提取方式。試驗還對ROP功能性組分進行分離、鑒定。通過助干劑篩選試驗，確定β-環(huán)糊精作為噴霧干燥的助干劑。通過正交試驗，確定制備黃秋葵多糖噴霧干燥粉的最佳工藝條件。紅外光譜掃描結(jié)果以及體外抗氧化性測定結(jié)果顯示噴霧干燥的加工方式并未對ROP的結(jié)構(gòu)和官能團造成太大影響。試驗結(jié)果為ROP的高效提取和組分鑒定提供理論基礎(chǔ)，也為黃秋葵高值化深加工提供思路和基本試驗參數(shù)。