引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

張莞苓，薛雅蓉，郭雨，左廣勝，劉常宏

（1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023；2.北京中龍創(chuàng)科技有限公司，北京 100071）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科姜屬多年生草本植物，也是重要的藥食兩用經(jīng)濟(jì)類蔬菜作物，在亞洲、非洲、南美洲等地區(qū)都有栽培。我國是生姜主產(chǎn)國之一［1］，主產(chǎn)區(qū)在山東、河南、四川等省［2］，是種植區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱作物，且具有很高的出口創(chuàng)匯價值。生姜塊莖腐爛等病害的連年發(fā)生嚴(yán)重影響了生姜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-4］。分離并鑒定引起生姜塊莖腐爛的病原菌并有針對性的防治，是控制該病發(fā)生的根本方法。

已報道的引起生姜塊莖腐爛的病原菌主要有青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）［5］、歐文氏菌（Erwinia spp.）［6］、短 小芽 孢桿 菌 （Bacillus pumilus）［7］、群 結(jié) 腐 霉 菌 （Pythium myriotylum）［8，9］和 尖 孢 鐮 刀 菌 （Fusarium oxysporum）［10，11］。由于地理環(huán)境及氣候差異，這些病原菌在各地的分布不盡相同，并且還可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的新病原菌。

山東為我國生姜種植面積最大的省份，2019年種植面積10.15萬公頃，占北方生姜種植總面積（11.39萬公頃）近90%，超過全國生姜種植總面積（28.43萬公頃）的 1／3［12］，在我國生姜種植產(chǎn)業(yè)和生姜產(chǎn)品供應(yīng)體系中有著舉足輕重的地位和作用。為了解引起山東省濰坊市生姜種植區(qū)生姜塊莖腐爛的原因，本試驗從濰坊市多地生姜種植田采集腐爛塊莖，進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐爛生姜塊莖：于2017年8月（生姜大培土期）采自山東省濰坊市青州朱家埠村（QZ）、安丘凌河鎮(zhèn)馬家河崖頭村（AQ）、昌邑北孟鎮(zhèn)上坡村（CY）、昌樂紅河鎮(zhèn)王家埠村（CL）生姜栽培區(qū)發(fā)病地塊（發(fā)病率超過60%），生姜莖葉嚴(yán)重失綠黃化、根莖腐爛。

細(xì)菌分離培養(yǎng)基：LB瓊脂培養(yǎng)基。

真菌分離培養(yǎng)基：含0.5 mg／mL的硫酸鏈霉素和氯霉素的PDA培養(yǎng)基。

1.2 病原菌的分離

清洗發(fā)病生姜；75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次；3%的次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗3次；滅菌濾紙吸干表面水分。用無菌刀片將病健交界處組織切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.1 cm大小，分別放于固體 LB（37℃，24 h）和 PDA（28℃，5 d）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落長出后進(jìn)行純化，并對純培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)保種。

1.3 病原菌的鑒定

根據(jù)菌落及菌絲形態(tài)觀察，結(jié)合基于細(xì)菌16SrDNA（引物：27F／1492R）和真菌 ITS（引物：ITS1／ITS4）的特異性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果［8］，確定引起生姜塊莖腐爛的病原菌分類地位。

1.4 接種體的制備

細(xì)菌菌懸液的制備：挑取純化細(xì)菌單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基，37℃、150 r／min培養(yǎng)24 h；4 000 r／min離心5 min收集細(xì)菌，用PBS緩沖液重懸并調(diào)菌懸液濃度至3×108cfu／mL，用于致病性接種試驗。

真菌菌餅的制備：挑取少量菌絲于PDA平板上，置于28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)5 d，沿菌落邊緣用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅。

真菌孢子懸液的制備：參照黃福新等［13］的方法。將真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)10 d；在超凈工作臺內(nèi)將菌絲刮入無菌水中，攪拌后用無菌紗布過濾除去菌絲；濾液用無菌水調(diào)孢子懸液濃度為1×105個／mL。

1.5 致病性試驗

按照1.2的方法消毒健康生姜塊莖表面，然后將其橫切成厚度約1 cm的姜片；向其表面涂布細(xì)菌菌懸液（以涂布無菌水為對照）或接種真菌菌餅（以接種PDA固體培養(yǎng)基為對照）；將涂布有細(xì)菌和無菌水的姜片置37℃黑暗培養(yǎng)48 h，將接種真菌菌餅和PDA固體培養(yǎng)基的姜塊置30℃封閉保濕培養(yǎng)5 d。肉眼觀察生姜塊莖的腐爛情況，檢測所接種細(xì)菌或真菌對生姜塊莖組織的致病性。進(jìn)一步分離鑒定腐爛塊莖組織中的病原菌，檢查其與原接種菌的一致性。

1.6 盆栽試驗

按照1∶10（V／W）的比例，將病原細(xì)菌菌懸液或病原真菌孢子懸液混入滅菌營養(yǎng)土中，同時設(shè)置接種等體積的無菌水為對照，攪拌均勻后裝入花盆中，播種1塊健康生姜塊莖，每處理共5盆，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察生姜生長及發(fā)病情況。56 d后刨出生姜塊莖，用無菌水沖洗干凈，觀察生姜塊莖腐爛情況，并統(tǒng)計生姜植株葉片數(shù)、株高、莖圍、莖葉鮮重與塊莖鮮重。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graphpad Prsism 6軟件進(jìn)行Duncan’s檢驗（P＜0.05）；采用Mega 10構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 引起生姜塊莖腐爛病原菌的分離與鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)和基因序列分析，從20個腐爛塊莖中共分離獲得10株細(xì)菌和3株真菌（表1）。

利用生姜塊莖切片接種技術(shù)，評估了分離獲得的細(xì)菌和真菌菌株引起健康生姜塊莖腐爛的能力，發(fā)現(xiàn)只有2株細(xì)菌（E4，E17）和1株真菌（F01）能夠引起健康生姜塊莖組織病變（表1，圖1），分別占總細(xì)菌種類的20.0%和總真菌種類的33.3%。從發(fā)病組織中能夠重新分離獲得相同的病原菌，因此，E4、E17和F01鑒定為引起生姜塊莖腐爛的病原菌，并且在山東濰坊市的青州（QZ）、安丘（AQ）、昌邑（CY）和昌樂（CL）等地來源的腐爛生姜塊莖中普遍存在（表1）。

E4菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，不透明，邊緣整齊，有黏性（圖2A）。顯微鏡觀察顯示，E4菌株呈短桿狀，大?。?.3～1.5）μm ×（0.7～0.9）μm，兩端鈍圓，中生芽孢，無鞭毛和莢膜、革蘭氏陽性（圖2B）。16SrRNA基因序列相似性分析（表1）及系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，E4菌株與短小芽孢桿菌（Bacilluspumilus）親緣關(guān)系最近。綜合形態(tài)學(xué)和基因序列分析，鑒定E4菌株為短小芽孢桿菌。

表1 病姜塊中分離到的病原菌、分布及侵染性

圖1 病原菌（E4、E17、F01）引起生姜塊莖腐爛癥狀

圖2 E4菌株的菌落和菌體形態(tài)

圖3 E4菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

E17菌株LB培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，表面光滑，濕潤有黏性，邊緣整齊，產(chǎn)生可擴(kuò)散的水溶性綠色色素（圖4A）。菌體革蘭氏染色呈陰性，桿狀，兩端鈍圓（圖4B）。16S rRNA基因序列相似性（表1）和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）分析表明，E17菌株與銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）親緣關(guān)系最近。綜合形態(tài)學(xué)和基因序列分析，鑒定E17菌株為銅綠假單胞桿菌。

圖4 E17菌株的菌落和菌體形態(tài)

圖5 E17菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

F01菌株在PDA培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲為白色絮狀或絨毛狀；培養(yǎng)初期，菌落為白色，中間以輻射狀出現(xiàn)淡紫紅色，背面產(chǎn)生深紫紅色色素；菌株氣生菌絲茂盛，菌絲濃密，質(zhì)地厚實（圖6A）；大型分生孢子呈鐮刀形，兩端漸尖，基細(xì)胞足狀，多數(shù)3個分隔，少數(shù)4～7個分隔，大小為（20.5～56.7）μm ×（3.0～6.3）μm（圖6B）；分生孢子梗呈瓶頸狀，小型分生孢子較多，呈卵形或橢圓形，0～1個分隔，大小為（5.2～16.8）μm ×（2.1～5.0）μm；厚垣孢子間生或頂生，球形或橢圓形，壁光滑（圖6C）。ITS序列相似性分析（表1）和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）表明，F(xiàn)01菌株與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的親緣關(guān)系最近。

圖6 F01菌株的菌落特征及孢子形態(tài)

2.2 盆栽試驗結(jié)果

盆栽試驗結(jié)果表明，接種病原菌E4、E17和F01菌株56 d后，生姜長勢極差（圖8A）。刨出生姜塊莖后發(fā)現(xiàn)，3種病原菌均可致生姜塊莖100%發(fā)生褐變，以接種E17菌株引起的褐變最為嚴(yán)重（圖8B）。該結(jié)果進(jìn)一步表明E4、E17和F01菌株均為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

由表2可知，E4、E17和F01菌株侵染后，生姜的葉片數(shù)、株高、莖圍、莖葉鮮重和塊莖鮮重均顯著低于對照，但不同病原菌對生姜生長的危害程度差異不顯著（P ＞0.05）。

表2 不同病原菌對生姜生長的影響

圖7 F01菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 不同病原菌對生姜塊莖及植株生長的影響

3 討論與結(jié)論

通過對山東省濰坊市多地生姜腐爛塊莖中病原菌的分離、鑒定及致病性評價，共獲得10株細(xì)菌3株真菌，其中，2株細(xì)菌（短小芽孢桿菌E4和銅綠假單胞桿菌E17）和1株真菌（尖孢鐮刀菌F01）為引起生姜塊莖腐爛的病原菌。

已有報道顯示，短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌為引起萊蕪區(qū)生姜塊莖腐爛的病原菌［7，10］。本研究發(fā)現(xiàn)，該兩種病原菌在濰坊生姜種植區(qū)也普遍存在，表明短小芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌可能是導(dǎo)致生姜塊莖腐爛的重要病原菌。

銅綠假單胞桿菌在自然界分布廣泛，是土壤常見細(xì)菌之一，可引起黃瓜細(xì)菌性白枯病［14］和煙草細(xì)菌性葉斑?。?5］等病害。迄今未見其作為引起生姜塊莖腐爛病原菌的報道。本次從生姜腐爛塊莖內(nèi)分離到該菌，姜塊組織及盆栽試驗均顯示其能夠引起生姜塊莖腐爛，植株生長受阻，是一種新的生姜塊莖腐爛致病菌。該研究結(jié)果對于研發(fā)針對銅綠假單胞桿菌的新型殺菌劑或優(yōu)化原有登記農(nóng)藥配方和使用技術(shù)［16，17］，確保生姜健康栽培有重要的參考價值。

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