低溫等離子體對粘蓋牛肝菌菌絲生長的影響*

劉慶洪，李元慧，王艷瓊，羅 瑞，王 鵬，田果廷

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系，北京 100094；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221 3.中華全國供銷全國總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

等離子體是一種導(dǎo)電流體，可以由任何中性氣體在高壓下電離為激發(fā)或未激發(fā)的分子、原子、自由電子、具有正負(fù)電荷的離子以及自由基等，整體呈電中性的狀態(tài)[1-2]。低溫等離子體可以影響酶的活性，修飾食品基質(zhì)功能特性；降解毒素和農(nóng)藥；對農(nóng)產(chǎn)品原材料進(jìn)行滅菌等[3-4]。等離子體殺菌作為一種新興的廣譜滅菌技術(shù)，可以殺滅多種食品有害微生物，從而達(dá)到農(nóng)產(chǎn)品保鮮保藏的目的[5-6]。研究中低溫等離子體滅菌的原理是通過射頻電源給過氧化氫一定的能量，讓過氧化氫以等離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變成活性基團(tuán)；并與微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)和核糖核酸發(fā)生氧化反應(yīng)，使細(xì)胞嚴(yán)重受損而死亡。研究發(fā)現(xiàn)等離子體除引起細(xì)胞在細(xì)胞結(jié)構(gòu)（細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的損傷）的傷害外，對遺傳物質(zhì)DNA也有一定損傷[7]。而在動物細(xì)胞試驗中，等離子體對促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡存在劑量效應(yīng)，并會激活一些DNA修復(fù)信號通路[8]。等離子體產(chǎn)生的自由基還可以擾亂微生物的正常功能[9-10]。氬氣、氧氣、氮氣經(jīng)過放電處理后形成活性粒子，如氧原子、羥基自由基以及臭氧等。這些活性物質(zhì)伴隨其他成分一起作用于被處理物表面，發(fā)生一系列的生物、化學(xué)和物理反應(yīng)，對被處理的微生物產(chǎn)生一系列的后果。

粘蓋牛肝菌（Suillus bovinus），又名乳牛肝菌，是牛肝菌屬（Boletus）中一種重要的食（藥）用真菌[11]。粘蓋牛肝菌味道鮮美，營養(yǎng)豐富，對糖尿病有很好的療效，且有抗流感病毒、防治感冒的作用[12]；其子實體以及菌絲體的提取物具有抗癌活性，對小鼠肉瘤S180和艾氏癌的抑制率分別達(dá)到90%和100%[13]。粘蓋牛肝菌等菌根菌不能人工栽培，合理開發(fā)利用菌根型食用菌資源，菌絲體培養(yǎng)是開發(fā)利用的先決條件[14]；用菌絲體代替粘蓋牛肝菌子實體在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用已越來越受到人們的重視[15-16]。通過以低溫等離子體處理粘蓋牛肝菌的菌絲體，探討其對粘蓋牛肝菌菌絲生長發(fā)育的影響和效果，為粘蓋牛肝菌的生長發(fā)育條件的探索和完善提供一定的試驗研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

粘蓋牛肝菌（Suillus bovinus） 菌株，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所收集、分離、純化和鑒定。標(biāo)本號2018CX065，保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所資源庫。

粘蓋牛肝菌菌絲體分離、純化和培養(yǎng)的母種培養(yǎng)基采用PDA。菌絲體培養(yǎng)基采用：玉米粉4.0%、麩皮5.0%，磷酸二氫鉀0.10%、硫酸鎂 0.05%、瓊脂1.20%。最適培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基pH 6.0，培養(yǎng)溫度28℃，在此培養(yǎng)條件下，粘蓋牛肝菌菌絲體生長良好[17]。

1.2 儀器與試劑

等離子發(fā)生器由北京大學(xué)自主研發(fā)，提供給本項目研究使用；PD培養(yǎng)基和MMN培養(yǎng)基購自美國碧迪醫(yī)療器械有限公司。常規(guī)試劑購自國藥集團(tuán)。

1.3 不同電流、電壓下低溫等離子體對粘蓋牛肝菌生長的影響

將粘蓋牛肝菌的菌絲碎片接種于MMN培養(yǎng)基（pH 4.2） 上，培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，避光培養(yǎng)。待菌落直徑約為1.5 cm時進(jìn)行不同電壓、電流下等離子體的處理，再繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 理想電壓、電流下不同時間的等離子處理對粘蓋牛肝菌生長的影響

在理想電壓、電流條件下，設(shè)計不同處理時間 （0、0.5 min、1 min、2 min、3 min），對菌落達(dá)到1.5 cm的粘蓋牛肝菌菌落進(jìn)行處理。將處理后的粘蓋牛肝菌置于28℃～30℃下避光培養(yǎng)，觀察試驗結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 不同電壓、電流大小低溫等離子體對粘蓋牛肝菌生長的影響

不同電壓、電流下低溫等離子體作用對粘蓋牛肝菌生長的影響情況統(tǒng)計見表1。

表1 不同電壓電流條件下低溫等離子體處理對粘蓋牛肝菌的生長情況的影響Tab.1 Effect on growth of Suillus bovinus by non-thermal plasma treatment under different voltage and current conditions

表1結(jié)果顯示，處理時間對于粘蓋牛肝菌的生長情況影響最大，電壓在0.35 kV、電流為0.25 A處理2 min，促進(jìn)菌落生長效果最佳。

對所得結(jié)果打分以利于分析，設(shè)定“不明顯”為0分，“微弱抑制作用”為-1分，“微弱促進(jìn)作用”為1分，“促進(jìn)作用”為2分，“抑制作用”為-2分。賦值結(jié)果填入表并對結(jié)果進(jìn)行極差分析如表2所示。

由表2可以看出，處理時間的極差最大，表明處理時間對于粘蓋牛肝菌的生長情況影響最大。結(jié)果還表明，只有處理的電壓達(dá)到了有效最高點（1分），電流和時間都未達(dá)到有效最高點?？梢源_定，電壓在0.35 kV時最有效。

當(dāng)電壓在0.35 kV時，電流大小對牛肝生長狀況的影響有一個時間效應(yīng)，即當(dāng)處理時間較短時（2 min） 時表現(xiàn)為促進(jìn)作用，在處理時間較長（5 min）時表現(xiàn)為抑制作用。這表明在電壓在0.35 kV、電流大小0.25 A時，粘蓋牛肝菌的生長有一個最佳促進(jìn)時間點。

表2 不同電壓電流條件下低溫等離子體處理對粘蓋牛肝菌生長影響的極差分析Tab.2 Range analysis of Suillus bovinus growth by non-thermal plasma under different voltage and current

2.2 理想電壓、電流下不同時間的等離子處理對粘蓋牛肝菌生長影響的結(jié)果

理想電壓、電流下不同時間的等離子處理對粘蓋牛肝菌生長影響結(jié)果見表3和圖1。

表3 定壓定流下低溫等離子體不同處理時間對粘蓋牛肝菌生長的影響Tab.3 Growth affection of Suillus bovinu by non-thermal plasma under different time with same voltage and current

表3和圖1結(jié)果顯示，處理0.5 min對粘蓋牛肝菌有微弱的促進(jìn)作用，1 min處理促進(jìn)作用略強(qiáng)于2 min處理時間，3 min處理時已無促進(jìn)作用。

低溫等離子體發(fā)生器電壓電流參數(shù)設(shè)置為電壓0.35 kV、電流0.25 A條件時，處理時間小于1 min，隨著處理時間的延長，低溫等離子體對粘蓋牛肝菌的生長促進(jìn)作用逐漸明顯或變強(qiáng)。

低溫等離子體發(fā)生器電壓0.35 kV、電流0.25 A條件時，當(dāng)處理時間超過1 min，低溫等離子體處理對粘蓋牛肝菌的促進(jìn)生長作用開始變?nèi)酰幚頃r間3 min促進(jìn)效果接近消失。

3 討論

對粘蓋牛肝菌的甲醇提取物抗氧化試驗表明，粘蓋牛肝菌具有較強(qiáng)的還原力和抗脂質(zhì)氧化作用，并有一定的自由基清除能力[18]。同時粘蓋牛肝菌多糖的抗氧化性試驗也表明，粘蓋牛肝菌的多糖具有較強(qiáng)的氫氧自由基和氧負(fù)離子自由基的清除作用[19]。由于粘蓋牛肝菌菌絲具有較強(qiáng)的還原力和脂質(zhì)抗氧化作用，并有一定的清除自由基的能力，在低溫等離子體對粘蓋牛肝菌菌絲處理過程中，在稍短的時間中，粘蓋牛肝菌菌絲對低溫等離子體產(chǎn)生的氧化性傷害具有一定抗性，甚至加速其菌絲的生長[20]。

低溫等離子體對粘蓋牛肝菌菌絲生長的效應(yīng)可能基于以下原因。1）紫外射線效應(yīng)：大量紫外射線會在低溫等離子體產(chǎn)生過程中被放出。短時的紫外線照射有助于粘蓋牛肝菌菌絲的生長，而大量的紫外射線會破壞DNA等核酸物質(zhì)，從而對粘蓋牛肝菌菌絲生長起到一定的抑制作用[21]。2）活性自由基和粒子的作用：在氧化性氣體等離子體中，含有大量自由基（如NO·）。特定的自由基（NO·） 在低濃度下會作用于細(xì)胞代謝，促進(jìn)粘蓋牛肝菌菌絲生長；高濃度則會對其菌絲生長不利[22]。

利用各種不同的高壓電源和反應(yīng)器，可以產(chǎn)生性狀特異的多種低溫等離子體。這些等離子體與不同種類生物的細(xì)胞相互作用時會形成多種生物學(xué)效應(yīng)，如致死和亞致死效應(yīng)，在不同的領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[23]。在本試驗研究中，由于電壓0.35 kV和電流0.25 A的值比較小，在時間較短的情況下（如1 min），高速粒子穿透效應(yīng)和電場效應(yīng)的作用并不是最重要因素，此時紫外射線和活性自由基起主要作用。粘蓋牛肝菌具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基作用。此試驗條件下短時間內(nèi)低溫等離子體對粘蓋牛肝菌菌絲的損傷作用不明顯，反而卻由于其他一些目前未知的原因促進(jìn)了粘蓋牛肝菌菌絲的生長。低溫等離子體對粘蓋牛肝菌菌絲生長的促進(jìn)作用有待進(jìn)一步研究和探索。當(dāng)處理時間變長后，各種損傷效應(yīng)開始累積。促進(jìn)粘蓋牛肝菌菌絲生長作用漸變成抑制生長作用，進(jìn)而隨著損傷的加劇，導(dǎo)致菌絲體細(xì)胞的死亡，使牛肝菌生長受到嚴(yán)重的抑制。低溫等離子體與菌根菌細(xì)胞之間的相互作用機(jī)理，以及相關(guān)等離子體技術(shù)的開發(fā)，會是低溫等離子體影響粘蓋牛肝菌等菌根型食用菌人工培養(yǎng)的一個研究方向。