柳州黑山羊不同首免日齡接種小反芻獸疫弱毒疫苗田間試驗

覃 維 韋玉慶 黃小武 韋 鈺 曾慶倫 賀 春

1.廣西柳州市城中區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西柳州545006；2.廣西鹿寨縣動物疫病預防控制中心，廣西鹿寨545600；3.廣西柳州市動物疫病預防控制中心，廣西柳州545006；4.廣西融水縣動物疫病預防控制中心，廣西融水545300；5.廣西融安縣動物疫病預防控制中心，廣西融安545400

小反芻獸疫于2007年首次傳入我國西藏阿里地區(qū)[1]；2013年11月底再次傳入我國并不斷蔓延，對養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[2]。接種小反芻獸疫弱毒疫苗是防控該病重要措施之一。羔羊小反芻獸疫疫苗的首免日齡尚無統(tǒng)一標準，各地養(yǎng)殖狀況存在明顯差異，優(yōu)化或完善免疫程序是全面深入推進小反芻獸疫防控的重要內(nèi)容。本試驗旨在評估當?shù)睾谏窖虿煌酌馊正g接種小反芻獸疫弱毒疫苗的免疫效果，為優(yōu)化當?shù)匦》雌c獸疫免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗疫苗。小反芻獸疫弱毒疫苗，新疆天康畜牧生物技術股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：50 頭份/瓶，批號：2016044-2，每頭份疫苗含有的小反芻獸疫弱毒病毒至少為1×103TCID50。按瓶簽注明頭份，用滅菌生理鹽水將疫苗稀釋至每毫升含有1 頭份，充分混合均勻，冷藏保存?zhèn)溆?，稀釋后的疫苗? h內(nèi)用完。

2）診斷試劑。

①羊小反芻獸疫抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）：購自北京勤邦生物技術有限公司，批號為20170802。

②小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒：購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，批號：PPR20161010。

3）儀器。Multiskan FC 酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），熒光PCR 儀（CFX96 Touch）（美國BIO- RAD（伯樂）），可調(diào)移液器，恒溫培養(yǎng)箱。

4）試驗動物。選取接種過小反芻獸疫弱毒疫苗的母羊所產(chǎn)后代，且未接種過小反芻獸疫弱毒疫苗、臨床檢查健康、30~80日齡的柳州本地黑山羊80 只。

1.2 試驗方法

1）疫苗的接種。試驗時間為2016年9月-2017年3月，將試驗山羊隨機分為A（30~44日齡）、B（45～54日齡）、C（55～64日齡）、D（65～80日齡）4 個試驗組，每組20 只，采集棉拭子樣品后每只山羊頸后皮下注射試驗疫苗1 頭份，在未改變原有條件下飼養(yǎng)。

2）樣品的采集。

①棉拭子。免疫前，逐頭采集試驗組山羊的眼拭子、鼻拭子樣品。

②血清。分別于接種疫苗后第28、120、180 天頸靜脈采血，每份不少于3 mL/次，分離血清不少于1 mL/份，血清清亮、無溶血、無染污，于-20 ℃以下保存待檢。

3）病原核酸的檢測。采用熒光RT-PCR 方法檢測小反芻獸疫病毒核酸，具體操作參照說明書。結果判定：陽性對照Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct 值并且無特定擴增曲線，實驗室結果成立；被檢樣品Ct 值≤30 并出現(xiàn)擴增曲線為陽性，30＜Ct＜37 并出現(xiàn)擴增曲線為可疑，重新抽提檢測仍為可疑，可判陽性；被檢樣品Ct≥37，判定為陰性。

4）血清抗體的測定。采用阻斷ELISA 方法檢測PPR 血清抗體，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。以OD450nm吸光值為判定標準。試驗正常情況下，陰性對照吸光值≥1.0，陽性對照吸光值≤陰性對照吸光值×50%。按照公式計算阻斷率（PI）：PI（阻斷率）=（1-樣本值/陰性對照孔均值）×100%，根據(jù)PI 進行結果判定：PI≥50%為陽性；PI＜50%為陰性。

5）數(shù)據(jù)處理。試驗數(shù)據(jù)處理和結果顯著性檢驗均采用Excel 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 試驗動物病原核酸檢測結果

采用熒光RT-PCR 方法對采集的80 份拭子樣品進行小反芻獸疫病毒核酸檢測，檢測結果全部為陰性（表1）。

2.2 試驗動物血清抗體檢測結果

1）第28 天的檢測結果。從表2 可以看出，山羊在接種小反芻獸疫弱毒疫苗后的第28 天各試驗組均產(chǎn)生了一定水平的免疫抗體，抗體陽性率平均值為77.50%，其中A 組免疫抗體陽性率最低為60%，D 組免疫抗體陽性率最高為100%。

2）第120 天的檢測結果。由表3 可知，山羊在接種小反芻獸疫弱毒疫苗后的第120 天，抗體陽性率平均值為85.00%，其中A 和B 組免疫抗體陽性率均為70%，C 和D 組免疫抗體陽性率均為100%，與A、B 組結果存在顯著差異。

3）第180 天的檢測結果。由表4 可知，山羊在接種小反芻獸疫弱毒疫苗后的第180 天時，抗體陽性率平均值為83.75%，其中A 組免疫抗體陽性率為65%，B 組免疫抗體陽性率為70%，C 和D 組免疫抗體陽性率均為100%，前二者與后二者組間結果存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 試驗動物病原核酸檢測結果

表2 試驗動物血清抗體檢測結果（第28 天）

表3 試驗動物血清抗體檢測結果（第120 天）

表4 試驗動物血清抗體檢測結果（第180 天）

2.3 免疫抗體陽性率趨勢曲線

曲線圖顯示，A 組免疫抗體陽性率呈先升高后下降的趨勢，B 組、C 組和D 組免疫抗體陽性率上升后能較長時間維持在一定水平（圖1）。

3 討 論

眾多學者研究結果[3-8]表明，我國當前應用的小反芻獸疫疫苗具有良好的免疫原性，可產(chǎn)生良好的臨床免疫效果。該項研究旨在優(yōu)化當?shù)匦》雌c獸疫免疫程序，有效提高轄區(qū)小反芻獸疫免疫質量，防止疫情發(fā)生和擴散，保護當?shù)厣窖蝠B(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

試驗動物血清抗體檢測結果顯示，A 組免疫抗體陽性率呈先升高后下降的趨勢，免疫后第180 天時免疫抗體陽性率為65%、已經(jīng)低于70%，A 組與C 組、D 組免疫后第28、120 和180 天時的免疫抗體陽性率均存在顯著差異；B 組、C 組和D 組免疫抗體陽性率上升后能較長時間維持在一定水平，但B 組與C 組、D 組免疫后第28、120 和180 天時的免疫抗體陽性率均存在顯著差異，造成這些結果原因可能與母源抗體有直接關系，母源抗體對疫苗抗原有部分中和作用。研究[9-12]證實，免疫母羊后代獲得一定水平母源抗體。試驗動物病原核酸檢測結果顯示，采集的80 份試驗動物拭子樣品均為陰性，表明試驗動物沒有感染小反芻獸疫病毒，排除了野毒感染對試驗結果的干擾。

圖1 免疫抗體陽性率趨勢曲線

從試驗結果看，以35~44日齡為首免日齡接種疫苗的免疫效果不理想，以45~54日齡、55~64日齡和65~80日齡為首免日齡接種疫苗取得了良好免疫效果。李芳等[12]研究報道，大部分羔羊1~2月齡時母源抗體維持較高水平，2月齡以后顯著下降至30%以下。過早接種疫苗易受母源抗體干擾而造成免疫失敗，接種疫苗過晚則母源抗體空窗期太長，又會增加PPRV 侵襲風險。因此，建議選擇55~64日齡為柳州當?shù)睾谏窖蚪臃N小反芻獸疫疫苗的首免日齡。

徐雅萍等[13]研究表明，具有母源抗體的湖羊羔羊的最佳免疫時間為100日齡左右，群體保護率高，免疫期長。張子榮等[9]研究分析，對于經(jīng)免場PPR 的最佳免疫時間應選擇在斷奶后30日齡左右，即60日齡斷奶、90日齡免疫；90日齡斷奶、120日齡免疫。免疫抗體受多種因素影響，免疫抗體水平是動態(tài)變化過程，各地應當依據(jù)實際監(jiān)測情況來調(diào)整或優(yōu)化當?shù)馗嵫蚴酌馊正g。該試驗樣本數(shù)量較小，結果存在一定局限性。

4 結 論

建議選擇55~64日齡段為柳州當?shù)睾谏窖蚪臃N小反芻獸疫疫苗的首免日齡。我國國土面積遼闊，各地養(yǎng)殖品種、飼養(yǎng)方式和地理條件等存在差異，可以根據(jù)實際免疫效果評估來調(diào)整或優(yōu)化當?shù)氐母嵫蚴酌馊正g，這樣可以有效提高免疫質量。養(yǎng)殖場在實施疫苗接種的同時應當高度重視生物安全技術措施的落實，才能最終實現(xiàn)凈化和消滅該疫病。