大豆種皮多糖對模擬腸液流變特性和腸道菌群的影響

黃靖航，楊立娜*，趙亞凡，林 芊，韓 琳，雒明朔，王勝男，宋 虹，周大宇，劉 賀

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州121013 2 遼寧省糧谷類食品生物高效轉(zhuǎn)化工程研究中心 遼寧錦州121013）

大豆種皮作為大豆深加工過程的主要副產(chǎn)物，約占大豆總質(zhì)量的8%，其成分的86%均為碳水化合物的復(fù)合物[1]。微波輔助萃取法具有穿透性強，選擇性高，加熱均勻、快速和提取時間短等優(yōu)點[2]。大豆種皮多糖不僅具有增稠性、凝膠性和乳化性等功能特性，還具有較高的營養(yǎng)價值，在食品生產(chǎn)加工中具有重要的生物學(xué)作用[3-4]。許多研究表明，酸法提取的植物多糖具有較高的提取率和生理活性[5-6]。采用微波輔助酸法萃取可顯著提高大豆種皮多糖得率，充分發(fā)揮其功能和生物學(xué)特性，提高大豆產(chǎn)業(yè)的附加值。

在人體腸道中存在龐大的微生物群（主要為細菌），數(shù)量約1013～1014，其種類繁多，有500～1 000 個種類[7]。研究表明，多糖可以調(diào)節(jié)腸道菌群，促進益生菌的生長，維護微生態(tài)平衡[8]。徐永杰等[9]發(fā)現(xiàn)牛蒡多糖可以有效促進小鼠腸道中乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的增殖，且隨著劑量的增加，促增殖效果也更加明顯。Chen 等[10]研究表明茯磚茶多糖可被腸道菌群分解利用，可顯著調(diào)節(jié)普雷沃菌和擬桿菌2 種菌群的組成和豐度。Gao 等[11]研究發(fā)現(xiàn)四君子湯中的均一多糖S-3-1 可以調(diào)節(jié)腸道中乳酸菌、片球菌、鏈球菌、類桿菌、腸球菌和梭狀芽孢桿菌等菌屬的豐度，并調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸（SCFA）含量，影響機體免疫活性。由此可見，腸道菌群在維持人體健康和預(yù)防疾病發(fā)生的過程中扮演著重要的角色。腸道體外模擬系統(tǒng)是體外模擬人體腸道生理機能，研究營養(yǎng)物質(zhì)、藥物和非營養(yǎng)化合物的變化、相互作用以及生物可及性的有用工具[12]。本文采用體外模擬的方法探究不同萃取劑提取的大豆種皮多糖對模擬腸液流變學(xué)特性的影響，進而明晰其對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，為大豆種皮多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆種皮，錦州大豆皮經(jīng)銷公司；草酸（分析純級），天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸（分析純級），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；菊粉（Inulin），北京新營養(yǎng)科技有限公司；豬腸胃黏蛋白，上海源葉生物有限公司；BCA 試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；糞便DNA 快速提取試劑盒，德國凱杰公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 紫外-可見分光光度計，日本島津公司；NanoDrop One 超微量分光光度計，美國賽默飛公司；DHR-1 流變儀，美國TA 公司；厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水溶性大豆種皮多糖的制備 水溶性大豆種皮多糖的提取劑為草酸和檸檬酸，微波輔助萃取參數(shù)為480 W，35 min。提取流程如下：豆皮粉碎→乙醇脫色→過濾干燥→加入萃取劑→微波輔助提取→離心→真空濃縮→乙醇沉淀→干燥→大豆種皮多糖[13]。獲得2 種大豆種皮多糖分別為微波輔助草酸提取大豆種皮多糖 （Microwave-assist ed oxalic acid extraction of soybean hull polysaccharide，MOSP）和微波輔助檸檬酸提取大豆種皮多糖（Microwave-assisted citric acid extraction of soybean hull polysaccharide，MCSP）。

1.3.2 大豆種皮多糖組成成分測定 水分含量的測定參照GB/T 5009.3-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》直接干燥法[14]；灰分含量測定參照GB/T 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》高溫灼燒法[15]；粗脂肪含量測定參照GB/T 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》酸水解法[16]；多糖含量測定參照SN/T 4260-2015 《出口植物源食品中粗多糖的測定》苯酚硫酸法[17]；蛋白質(zhì)含量參照BCA 試劑盒操作方法進行測定。

1.3.3 大豆種皮多糖體外模擬消化試驗

1.3.3.1 糞便菌群（Fecal Microbiota，F(xiàn)M）的提取選取健康成年人的糞便 （不包括最近使用抗生素治療，以及有頻繁的胃腸疾病和代謝疾病的成年人）。取20 mL PBS （NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L）加入50 mL離心管中，加2～5 g 新鮮糞便樣品，渦旋振蕩混勻后稱重，差重法計算需要補加的PBS，制成質(zhì)量分數(shù)為10%的糞便漿液[18]。

1.3.3.2 體外模擬腸道消化 參考文獻[19]的模擬腸液配方并改進，培養(yǎng)基組成：酵母提取物（2.25 g/L），蛋白胨（0.75 g/L），NaCl（12.5 g/L），豬膽鹽（6.0 g/L），胰酶（0.9 g/L），豬胃黏蛋白（3 g/L）和L-半胱氨酸（0.37 g/L），調(diào)節(jié)pH 值至6.8。將1%MOSP 和MCSP 分別加入到培養(yǎng)基中，以添加1%Inulin 的培養(yǎng)基作為陽性對照，以不添加多糖和Inulin 的培養(yǎng)基作為陰性對照，將體積分數(shù)1%的腸道菌群接種到培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 腸道菌群生長變化測定 本試驗分為4組：FM 對照組，MOSP+FM 發(fā)酵組，MCSP+FM 發(fā)酵組和Inulin+FM 對照組。在培養(yǎng)過程中取0，12，24，36，48 h 的模擬腸液，于波長600 nm 處測定OD 值及相應(yīng)pH 值，繪制曲線。

1.3.5 發(fā)酵液流變特性測定 對培養(yǎng)0，24，48 h的模擬腸液進行黏性測定，參考文獻[20]的方法并改進。采用40 mm 平行板夾具，于4 ℃下線性剪切，剪切速率為0.1～100 s-1，測定時間為300 s，連續(xù)測定30 個數(shù)據(jù)點，檢測樣品的表觀黏度隨剪切速率的變化情況。

1.3.6 細菌16S rDNA V3-V4 區(qū)高通量測序 根據(jù)糞便DNA 快速提取試劑盒操作步驟提取FM，MOSP+FM，MCSP+FM，Inulin+FM 中的模擬腸液總DNA 并定量，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取的完整性。以細菌總DNA 為模板，用V3-V4 區(qū)通用引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）擴增。PCR 擴增條件：預(yù)變性94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，55 ℃，20 s，72 ℃，30 s 共25 個循環(huán)，退火溫度 72 ℃，5 min。利用Qubit 3.0 DNA 檢測試劑盒對回收的DNA 精確定量，以便按照體積比1∶1 混合后在MiSeq 平臺進行測序。PCR 擴增、測序文庫制備及測序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每個試驗重復(fù)3 次，采用Origin 9.1 軟件作圖，SPSS 19.0 軟件進行方差分析，以P＜0.05 為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取劑提取的大豆種皮多糖化學(xué)組成

通過微波輔助草酸和檸檬酸萃取大豆種皮多糖發(fā)現(xiàn)，MOSP 得率為10.2%，MCSP 得率為5.9%。如表1所示，MOSP 的純度、水分和脂肪含量顯著高于MCSP（P＜0.05），而MCSP 的蛋白質(zhì)和灰分含量顯著高于MOSP（P＜0.05）。微波輔助酸法萃取大豆種皮多糖的得率均高于孫元琳等[21]報道的大豆皮多糖熱水提取率 （2.69%）和草酸銨提取率（2.96%）。本試驗結(jié)果與部分文獻報道的微波輔助酸提法可以提高多糖的得率保持一致[2]，主要由于微波提高了大豆皮細胞壁的破碎程度，酸處理解除了細胞壁聚合物分子間的物理化學(xué)作用，使得不溶性纖維素、木質(zhì)素與多糖之間的化學(xué)鍵斷裂，并且在低pH 值條件下多糖的溶解度降低，因此微波輔助酸提法更利于多糖分子的溶出[22-24]。然而，不同萃取劑的螯合性、酸堿性、沉淀性和還原性等化學(xué)性質(zhì)不同，導(dǎo)致粗多糖的化學(xué)組分之間存在些許差異。

表1 MOSP 和MCSP 的化學(xué)成分Table 1 The chemical composition of MOSP and MCSP

2.2 不同多糖干預(yù)后腸道菌群的增殖情況

通過0～48 h 內(nèi)發(fā)酵液的OD 值和pH 值變化，表征腸道菌群在不同培養(yǎng)條件下的增殖情況。OD 值的大小反映發(fā)酵液中菌群數(shù)量的多少，變化速率的大小反映菌群增殖速度的快慢[25]。如圖1所示，0～12 h，MOSP 組OD 值快速上升，變化速率高于其它組；12～24 h，MOSP 組OD 值上升緩慢，變化速率低于其它組。隨著發(fā)酵時間的延長，MOSP 和MCSP 組間差異逐漸變小最終趨于一致。與Inulin 組相比，MOSP 和MCSP 干預(yù)后腸道菌群的數(shù)量和增殖速度較高，表現(xiàn)出較好的增殖效果。MOSP 和MCSP 都能促進腸道菌群的增殖，但是MOSP 促進腸道菌群增殖的效果優(yōu)于MCSP。由于不同的提取方法獲得的多糖之間化學(xué)組分不同，所以在腸道菌群增殖效果方面也存在一定的差異。文獻報道稱枸杞多糖、人參多糖和羊棲菜多糖等都可以被腸道菌群降解并促進腸道菌群生長[26-28]，與本文試驗結(jié)果一致。人體腸道菌群可利用的主要營養(yǎng)來自于膳食中的碳水化合物，因此腸道菌群可以降解復(fù)雜的植物多糖，從中獲取能量和營養(yǎng)供自身生長繁殖[29]。

圖1 腸道菌群的生長曲線和pH 值變化曲線Fig.1 Intestinal flora growth curve and pH change curve

pH 值下降是發(fā)酵過程中的一個顯著變化，主要是由于接種的微生物作用于多糖等碳水化合物，使其分解為乳酸、醋酸或其它有機酸，從而導(dǎo)致pH 值降低。pH 值的降低可以有效抑制雜菌生長。由圖1可知，0～12 h，MOSP 發(fā)酵液的酸化程度和酸化速率均高于其它組；12～24 h，MOSP 發(fā)酵液的酸化程度緩慢下降，酸化速率低于其它組；24～48 h，各組發(fā)酵液的酸化程度趨于穩(wěn)定。pH 值的變化趨勢與OD 值的變化趨勢相互對應(yīng)，說明腸道菌群對多糖的利用程度越高，菌群數(shù)量越多，發(fā)酵液的酸化程度越高。張其圣等[30]和楊靖鵬等[31]發(fā)現(xiàn)乳酸菌的生長繁殖過程呈現(xiàn)相似的趨勢，與本文的研究結(jié)果保持一致。

2.3 不同多糖發(fā)酵液的流變特性

腸液流變性的變化通常會影響腸道菌群的定殖、分布與生長，進而影響營養(yǎng)物質(zhì)和藥物的吸收效果[32]。在0～100 s-1的剪切速率下，測定了腸道菌群發(fā)酵液的表觀黏度。由圖1可知，在0～20 s-1的剪切速率下，0，24，48 h 各組的表觀黏度均隨剪切速率的增加而迅速降低，呈現(xiàn)剪切稀化的流動特征，因為在外力的剪切下，發(fā)酵液的結(jié)構(gòu)被破壞，所以表觀黏度呈現(xiàn)不斷下降的趨勢[33]。剪切速率大于20 s-1后，表觀黏度下降速度基本保持一致，表現(xiàn)為恒定的理想牛頓流體行為[34]。隨著剪切應(yīng)力停止，發(fā)酵液的黏度不再變化，這種剪切稀化和凝固特性的規(guī)律更類似于人體腸道黏液實際的流變學(xué)特性[32]。張杰等[35]和Marie 等[32]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。通過比較發(fā)現(xiàn)，0 h 時MCSP 發(fā)酵液的表觀黏度較高，這是由于MCSP 的蛋白質(zhì)含量較高，導(dǎo)致其多糖溶液的黏度較高；24 h 時MOSP 發(fā)酵液的表觀黏度明顯上升，高于MCSP，因為0～24 h 內(nèi)腸道菌群快速利用MOSP，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與MCSP 存在差異，所以改變了發(fā)酵液的表觀黏度；48 h 時MOSP 和MCSP 發(fā)酵液的表觀黏度趨于一致，主要因為腸道菌群發(fā)酵接近終點，發(fā)酵終產(chǎn)物差異較小。

2.4 腸道菌群多樣性分析

經(jīng)Illumina-miseq 平臺16S rDNA 測序后，在97%的相似水平下，對序列進行操作分類單元（OTU）劃分，OTU 數(shù)目代表物種的豐度。OTU 聚類分析結(jié)果如表2和圖3所示，發(fā)酵24 h 時MOSP特有OTU 多于MCSP 和Inulin，但是3 組均低于0 h FM 組；發(fā)酵48 h 時MOSP 與MCSP 特有OTU 幾乎相同，均高于Inulin 低于0 h FM 組，表明MOSP 相較于MCSP 和Inulin 可以顯著提高厭氧腸道菌的豐度，但低于糞便中腸道菌的豐度。α 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，其中Chao1 和Ace 指數(shù)反映了群落中物種的數(shù)量，Shannon 和Simpson 指數(shù)用于衡量群落多樣性，Chao1，Ace，Shannon 指數(shù)值越大，Simpson 指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高[36]。根據(jù)表2所示，0 h FM 組物種多樣性最高，24 h 時MOSP 組物種多樣性高于MCSP 和Inulin 組，根據(jù)發(fā)酵液流變特性的差異，可能因為MOSP 干預(yù)體系黏度較高，降低了有害因子對微生物的抑制速率。48 h時3 組沒有明顯規(guī)律，差異不大。有研究報道稱體外模擬發(fā)酵會降低腸道菌群的多樣性，不同的碳水化合物對腸道菌群有篩選作用[37]，本試驗也出現(xiàn)了相同的結(jié)果。如果增加不同種類碳水化合物的組合有可能大幅度提高體外模擬條件下的腸道菌群多樣性。如圖3所示，發(fā)酵24 h 4 組共有OTU 是15 個，而發(fā)酵48 h 4 組共有OTU 是19個。隨著發(fā)酵時間的延長，處理組腸道菌群豐度趨向于正常組腸道菌群豐度。

圖2 剪切速率對發(fā)酵液表觀黏度的影響Fig.2 Effects of shear rate on the apparent viscosities of fermentation fluid

圖3 腸道菌群OTU 分布韋恩圖Fig.3 OTU distribution Venn diagram of intestinal flora

表2 腸道菌群的OTU 及α 多樣性指數(shù)Table 2 OTU and alpha diversity index of intestinal flora

2.5 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

由圖4a，4b 可知，4 組腸道菌群中擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）是3 大優(yōu)勢菌，這與姚虹等[38]的研究結(jié)果一致。FM 組中擬桿菌門含量最為豐富，其次是厚壁菌門和變形菌門。Inulin 組由厚壁菌門和變形菌門組成，不同的發(fā)酵時間沒有明顯變化。24 h 時，MOSP 和MCSP 組以變形菌門和擬桿菌門為主，并且MOSP 的擬桿菌門含量高于MCSP；48 h 時，MOSP 和MCSP 組出現(xiàn)了少量的厚壁菌門，擬桿菌門含量明顯增多，而且MOSP 的擬桿菌門含量依舊高于MCSP。有報道稱擬桿菌主要通過PULs 的susCH/susDH 降解系統(tǒng)利用多糖，提高復(fù)雜聚糖的營養(yǎng)利用率并為維持微生態(tài)平衡貢獻力量；厚壁菌門則通過gpPULs 聚糖降解系統(tǒng)參與聚糖降解[29，39]。本研究結(jié)果證實MOSP 和MCSP 通過增加擬桿菌門和厚壁菌門的含量來提高多糖的利用率，而且MOSP 比MCSP 對菌群的促增殖的效果更明顯，可能與其誘導(dǎo)腸道黏液流變性差異有關(guān)。

通過UniFrac 的3D-PCoA 對不同多糖發(fā)酵液中腸道菌群落結(jié)構(gòu)差異進行分析，系統(tǒng)進化距離代表各組物種群落結(jié)構(gòu)差異，并在三維空間上表征差異，圖中距離越近的點表示樣品間菌群結(jié)構(gòu)越相似[40]。由圖4c，4d 可知，發(fā)酵24 h 時，未加權(quán)主坐標(biāo)分析顯示第1 主成分、第2 主成分和第3 主成分的貢獻率分別為53%，30%，18%；發(fā)酵48 h 時，未加權(quán)主坐標(biāo)分析顯示第1 主成分、第2主成分和第3 主成分的貢獻率分別為45%，34%，21%。結(jié)果表明，不同多糖發(fā)酵液中細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，彼此間很好的分隔開來。路上云等[41]的結(jié)果也與本文相似。發(fā)酵液中細菌的構(gòu)成與糞便樣品相比較為簡單，菌群的種類和數(shù)量也不盡相同，表明在培養(yǎng)過程中優(yōu)勢菌群大量存活下來。

圖4 腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)分類和3D-PCoA 分析Fig.4 Classification and 3D-PCoA analysis of intestinal flora structure on the phylum level

3 結(jié)論

微波輔助草酸或檸檬酸萃取的2 種大豆種皮多糖均能在一定程度上改變體外腸道模擬體系的流變學(xué)特性，并改善腸道菌群的多樣性與結(jié)構(gòu)特征，而微波輔助草酸萃取法獲得的多糖在調(diào)整微生態(tài)平衡和發(fā)揮益生元活性方面更具優(yōu)勢。大豆種皮多糖酵解和調(diào)控腸道菌群平衡的分子機制，尚需要進一步研究與探索。