復(fù)方板藍(lán)根制劑中靛玉紅提取工藝的研究

張前珍 李懂琴 陳國良

板藍(lán)根和大青葉是中藥復(fù)方板藍(lán)根制劑主要成分，是我國傳統(tǒng)的中藥。板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)的干燥根，其主要化學(xué)成分為靛玉紅和靛藍(lán)等，有清熱解毒、涼血利咽功能，用于瘟毒發(fā)斑、療腮、喉痹、爛喉丹府、大頭瘟疫、丹毒、癰腫等癥，板藍(lán)根的主要化學(xué)成分為靛玉紅和靛藍(lán)等，臨床上常用于病毒性及細(xì)菌性感染疾病[1]。大青葉為十字花科菘藍(lán)的葉，其主要化學(xué)成分為有機(jī)酸、靛藍(lán)、靛玉紅、菘藍(lán)苷、色胺酮等化合物[2]。現(xiàn)代藥理研究表明具有抗菌、抗癌、抗病毒、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用[3]。目前，復(fù)方板藍(lán)根制劑有顆粒劑、沖劑、糖漿劑、片劑、口服液等，對板藍(lán)根和大青葉中有效成分靛玉紅的提取，傳統(tǒng)的提取方法是水煎煮醇沉，其有效成分損失過大，為了最大限度提取有效成分，本實驗分別采用水和乙醇為溶媒，用正交試驗設(shè)計法，以確定合理的提取工藝路線和最佳提取條件，靛玉紅為指標(biāo)進(jìn)行比對，為復(fù)方板藍(lán)根制劑的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 試藥 中藥板藍(lán)根：批號：170101；大青葉：批號：170301（產(chǎn)地：甘肅）。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：U3000（Thermo Fisher美國）；電子天平：SARTORIUS CPA2250（德國，dz0.01 mg）；電熱恒溫水浴鍋HWS-2b（上海）；KQ5200E超聲清洗器（昆山）。

1.3 試劑 甲醇，色譜純；超聲重蒸餾水（自制）；乙醇，分析純。

1.4 對照品 靛玉紅（批號：110717-200204）。

2 方法和結(jié)果

2.1 靛玉紅含量測定 ①條件：色譜柱：AgilentC18,ZORBAX 58- Aq（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（58:42）；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 mm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；時間：40 min。②對照品溶液制備：精密稱取靛玉紅對照品9.52 mg置50 mL量瓶中，加甲醇稀至釋度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋度，搖勻，制成每1 mL約含2 μg的靛玉紅對照品溶液。③供試品溶液的制備：精密稱取以水為溶媒和以乙醇為溶媒L9（34）正交試驗的清膏各1 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，精密稱重，超聲處理60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。④測定靛玉紅含量：精密吸取對照品溶液20 μL，再按試驗號分別吸取L9（34）正交試驗供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀中測定含量。

2.2 試驗方法 按照復(fù)方板藍(lán)根制劑中板藍(lán)根和大青葉的比例，分別以水和乙醇為溶劑進(jìn)行水煎煮提取和回流提取，以靛玉紅作為檢測指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗，根據(jù)正交試驗結(jié)果，進(jìn)行比較、分析、驗證試驗和重復(fù)試驗，最后得出結(jié)論。

2.2.1 水煎煮提取的正交試驗 平行稱取板藍(lán)根30 g、大青葉45 g各9 份，按照L9（34）正交試驗設(shè)計的因素水平表進(jìn)行水煎煮提取，合并濾液，濃縮，醇沉，過濾，濾液濃縮（回收乙醇）成清膏，備用。按照2.1.4 項測定靛玉紅的含量。見表1、表2。

2.2.2 乙醇回流提取的正交試驗 平行稱取板藍(lán)根30 g、大青葉45 g各9 份，按照L9（34）正交試驗設(shè)計的因素水平表進(jìn)行回流提取，合并濾液，濃縮（回收乙醇），再醇沉，過濾，濾液濃縮（回收乙醇）成清膏，備用。按照2.1 中的第4 項測定靛玉紅的含量。見表3、表4。

表1 水煎煮提取工藝正交試驗因素水平表

表2 水煎煮提取工藝L9（34）正交試驗結(jié)果

表3 乙醇回流提取工藝正交試驗因素水平表

表4 乙醇回流提取工藝L9（34）正交試驗結(jié)果

3 結(jié) 果

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)算出極差值R的大小，反映各因素對指標(biāo)性成分靛玉紅的影響程度。

3.1 水煎煮提取的最佳工藝 根據(jù)正交試驗設(shè)計水煎煮提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅，從表2中看出，因素D（溫度）對提取靛玉紅總量有顯著性影響，因素B（次數(shù)）和因素A（時間）對提取靛玉紅總量影響非常顯著，因素C（水量）無顯著性影響，實驗結(jié)果表明水煎煮提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅的最佳提取條件：D3 B2 A3 C1 即溫度100 ℃、次數(shù)2 次、時間2 h、水量8 倍。對上述結(jié)果我們進(jìn)行驗證和重復(fù)實驗，結(jié)果見表5。

表5 水煎煮提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅驗證試驗和重復(fù)試驗

3.2 乙醇回流提取的最佳工藝 根據(jù)正交試驗設(shè)計乙醇回流提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅，從表4 中看出，因素A（乙醇濃度）對提取靛玉紅總量有顯著性影響，因素B（回流時間）和因素D（乙醇用量）對提取靛玉紅總量影響非常顯著，因素C（回流次數(shù)）影響較小，實驗結(jié)果表明乙醇回流提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅的最佳提取條件：A3B2D2C2，即乙醇濃度80%、回流時間80 min、乙醇用量7 倍、回流次數(shù)2 次。對上述結(jié)果我們進(jìn)行驗證和重復(fù)實驗，結(jié)果見表6。兩種不同溶劑和提取工藝通過正交設(shè)計并進(jìn)行L9（34）正交試驗進(jìn)行優(yōu)化，對優(yōu)化后的提取工藝條件進(jìn)行驗證和重復(fù)試驗，其結(jié)果基本一致。

表6 乙醇回流提取板藍(lán)根和大青葉中靛玉紅驗證試驗和重復(fù)試驗

3.3 兩種不同溶劑和提取工藝的比對 采取兩種不同溶劑和不同提取工藝，用優(yōu)化的最佳工藝條件提取靛玉紅，結(jié)果顯示：乙醇回流法提取板藍(lán)根和大青葉中有效成分靛玉紅是水煎煮法提取靛玉紅的97 倍。見表7。

表7 兩種不同溶劑和提取工藝提取靛玉紅總量的比對

4 討 論

本文選擇的溶劑和提取工藝?yán)碚撘罁?jù)，根據(jù)靛玉紅的溶解性來確定。靛玉紅溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇，根據(jù)人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)大會（ICH）制定的指導(dǎo)原則[4]要求，氯仿屬于第二類溶劑，乙酸乙酯、丙酮、乙醚屬于第三類溶劑，不能使用，所以本實驗選擇乙醇和水為溶劑。

目前，復(fù)方板藍(lán)根制劑（包括片劑、顆粒劑、沖劑、糖漿劑、口服液等）大部分都是采取水煎煮醇沉提取，復(fù)方板藍(lán)根制劑的有效成分靛玉紅不溶解水，即使在煮沸時溶解很少。本實驗證明，即使用正交試驗優(yōu)化工藝后提取的靛玉紅也是很少，制劑產(chǎn)品質(zhì)量很難控制。曾經(jīng)有報道[5]用65%乙醇進(jìn)行回流或滲漉提取來提高制劑產(chǎn)品質(zhì)量。我國中醫(yī)用清熱解毒法在治療溫?zé)岵≈械匚缓苤匾?，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療感染性疾病應(yīng)用抗菌藥物為基本手段相一致，板藍(lán)根是清熱解毒中藥的典型藥物[6]，在抗擊SARS過程中，以中國中醫(yī)藥研究院專家牽頭的治療小組從1000 多個中成藥方中篩選出8 個有效的藥物，其中有板藍(lán)根顆粒劑。所以，研究復(fù)方板藍(lán)根制劑有效成分提取工藝，對板藍(lán)根的開發(fā)利用有著重要意義。