酸化奶飼喂量對(duì)荷斯坦?fàn)倥ＩL(zhǎng)及斷奶后期瘤胃菌群的影響

李叔臻，王雅晶，董旭明，朱 云，王雅春，曹志軍，李勝利，馬 云，淡新剛，康曉龍，史遠(yuǎn)剛

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100083）

我國(guó)作為奶牛養(yǎng)殖大國(guó)，規(guī)?；图s化奶牛場(chǎng)建設(shè)加快，奶牛各生長(zhǎng)階段飼養(yǎng)管理技術(shù)與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段不斷發(fā)展，犢牛培育環(huán)節(jié)直接影響成年奶牛生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)， 受經(jīng)營(yíng)者重視[1-2]。瘤胃發(fā)育是犢牛培育環(huán)節(jié)重要部分。進(jìn)食初乳后，其消化代謝產(chǎn)物影響犢牛瘤胃發(fā)育和微生物區(qū)系建立[3-4]。通過(guò)宏基因組學(xué)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，犢牛瘤胃內(nèi)存在乳酸桿菌和蛋白水解菌，隨食物改變，瘤胃內(nèi)微生物種類與數(shù)量逐漸接近成年[5]。奶牛養(yǎng)殖實(shí)踐中，犢牛哺乳常用兩種模式，一種是自由飲奶，另一種是限制飼喂，不同采食模式影響犢牛瘤胃發(fā)育、開食料采食量及斷奶后對(duì)飼草料的消化吸收能力[6-7]。研究表明自由采食增加犢牛采食量和增重，但對(duì)斷奶后固體飼料采食量無(wú)影響；限量飼喂?fàn)倥：笃谏L(zhǎng)優(yōu)勢(shì)更明顯[8]，生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)自由采食與限量飼喂方案存有疑慮。

本試驗(yàn)研究犢牛哺乳期不同酸化奶飼喂量對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和斷奶后期6 月齡犢牛瘤胃微生物區(qū)系建立的影響，旨在為犢牛健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019 年9 月10 日～2020 年3 月19 日在寧夏回族自治區(qū)金宇浩興第一牧場(chǎng)展開，采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選用12 只出生日期接近健康荷斯坦母犢牛（體重40±3 kg），隨機(jī)分為2組，每組6頭，在哺乳期采用兩種不同喂奶量，即L1組：自由采食酸化奶（約12 L·d-1·頭-1）；L2組：限量飼喂酸化奶（6 L·d-1·頭-1）。試驗(yàn)期共6 個(gè)月，其中哺乳期60 d（兩組犢牛均在60 日齡后斷奶），斷奶犢牛采食相同飼料至斷奶期結(jié)束（60日齡～6月齡），每月測(cè)量體尺，6月齡末采集瘤胃液。

1.2 試驗(yàn)日糧

奶源由金宇浩興第一牧場(chǎng)自產(chǎn)。兩組犢牛所喂初乳均為巴氏殺菌冷凍乳，常乳為平均乳脂率3.2%～3.5%，平均乳蛋白含量3.0%～3.9%的酸化奶。犢牛開食料由內(nèi)蒙古博瑞飼料有限公司提供，組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

犢牛出生后2 h內(nèi)飼喂優(yōu)質(zhì)冷凍巴殺初乳4 L·頭-1，6 h 后飼喂同樣質(zhì)量初乳2 L·頭-1。2 日齡開始，每個(gè)處理的6頭犢牛群養(yǎng)于同一畜欄。1～3 日齡通過(guò)奶瓶人工飼喂， 4～60日齡L1組使用具有人工乳頭的奶桶飼喂，自行吮吸采食，L2 組則奶瓶限量飼喂，50 日齡后，兩組犢牛均逐漸減少喂量。具體飼喂量見(jiàn)表2。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

犢牛出生后立即測(cè)定體重，試驗(yàn)期間于每月20日測(cè)定兩組犢牛體重和體高，于測(cè)定日晨飼前完成，準(zhǔn)確記錄，計(jì)算日增重。

1.4.2 采食量測(cè)定

0～60 d 試驗(yàn)期間，顆粒料稱重，每日投放定量開食料和牧草，次日稱取剩料量，計(jì)算犢牛每日每頭開食料采食量，并作記錄。

表1 犢牛開食料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Starter composition and nutrient level of calf (DM basis, %)

表2 不同日齡犢牛牛奶飼喂量Table 2 Feeding amount of milk to calves in different age(L)

1.4.3 瘤胃液采集與測(cè)定

6月齡12頭試驗(yàn)牛于晨飼前采樣。利用口腔胃管采集瘤胃液，將牛頭壓低，牛鼻夾固定牛頭，用犢牛專用胃管，將一端通過(guò)口腔逐步送入瘤胃，另一端用針管緩慢抽取瘤胃液并用4層紗布過(guò)濾。所得瘤胃液立即測(cè)定pH，取20 mL分裝于2個(gè)10 mL 離心管-20 ℃保存，用于檢測(cè)VFA 濃度。另取瘤胃液10 mL，分裝于2個(gè)5 mL凍存管中，立即投入液氮速凍，干冰運(yùn)輸至天津諾禾致源生物檢測(cè)公司作16S rDNA 測(cè)序分析。瘤胃液pH 用pH 計(jì)測(cè)定，乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸用氣相色譜法測(cè)定。

1.5 瘤胃液菌群多樣性測(cè)定與分析

瘤胃液菌群多樣性采用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析。試驗(yàn)操作流程如下：樣品DNA 提取及檢測(cè)；設(shè)計(jì)合成引物接頭（目的片段為V3 +V4區(qū)，長(zhǎng)度：468 bp，引物為341F-806R，341 正向引物F： CCTAYGGGRBGCASCAG; 806 反向引物R：GGACTACNNGGGTATCTAAT）；PCR 擴(kuò)增與產(chǎn)物純化；PCR 產(chǎn)物定量與均一化；文庫(kù)制備及庫(kù)檢；Illumina NovaSeq上機(jī)測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010 初步整理， 采用SPSS 22.0 軟件分析顯著性，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛體尺及日增重的影響

由表3 可知，L2 組與L1 組犢牛各月齡體重差異均顯著（P＜0.05）；3、5、6月齡L1組犢牛體高顯著高于L2組（P＜0.05），1、2、4月齡，體高差異不顯著（P＞0.05）；日增重方面， 2、3、4、5 月齡時(shí)兩組試驗(yàn)牛差異均顯著（P＜0.05），1、6 月齡時(shí)兩組試驗(yàn)牛差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛開食料采食量的影響

由表4可知，0～20和41～60日齡因酸化奶飼喂水平不同造成限飼組犢牛開食料采食量極顯著高于自由采食組犢牛（P＜0. 01），21～40日齡開食料采食量不顯著（P＞0.05），但限飼組仍高于自由采食組。

2.3 酸化奶飼喂量對(duì)斷奶后期犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5 可知，哺乳期采食不同量酸化奶對(duì)pH、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸及總揮發(fā)性脂肪酸濃度影響均不顯著（P＞0.05）。

表3 不同酸化乳飼喂量對(duì)犢牛體高、體重及日增重的影響Table 3 Effect of different milk feeding amount on the height, weight and daily weight gain of calves

表4 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛開食料采食量的影響Table 4 Effect of acidified milk feed quantity on feed intake of calves

表5 不同酸化奶飼喂量對(duì)斷奶后期犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 5 Effects of different milk feeding amounts on rumen fermentation parameters of calves

2.4 限飼與自由采食酸化奶對(duì)犢牛瘤胃微生物多樣性的影響

2.4.1 16S rDNA 基因V3+V4 區(qū)域擴(kuò)增結(jié)果與數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

2.4.1.1 擴(kuò)增結(jié)果

檢測(cè)12個(gè)瘤胃液樣品總DNA 質(zhì)量，濃度及純度均符合測(cè)序平臺(tái)要求，作16S rDNA 基因V3+V4區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶如圖1所示，目的條帶明亮單一且濃度合適，達(dá)到建庫(kù)要求，適合后續(xù)分析。

2.4.1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

對(duì)Illumina NovaSeq 測(cè)序得到下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw PE）拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再嵌合體過(guò)濾，獲得可用于后續(xù)分析有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。數(shù)據(jù)處理過(guò)程中數(shù)據(jù)量與質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表6，Q20%與Q30%平均值分別為98%與93%，質(zhì)量良好。

2.4.2 操作分類單位（OTU）數(shù)量

兩種不同飼喂方式所得OUT Venn 圖（見(jiàn)圖2）顯示，兩組樣本共有OTU 數(shù)為2 152個(gè)，自由采食（L1）組特有OTU 數(shù)為330 個(gè)，限飼（L2）組特有OTU 數(shù)為283個(gè)。自由采食使?fàn)倥Ａ鑫敢壕憾鄻有陨摺?/p>

表6 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控Table 6 Data preprocessing statistics and quality control

2.4.3 測(cè)序深度分析

從測(cè)序樣本中隨機(jī)抽取一部分?jǐn)?shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)OTUs 數(shù)目，以抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)OTUs 數(shù)構(gòu)建稀釋曲線。

由圖3～4可知，單樣本和組別稀釋曲線均逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。

2.4.4 OTU Alpha多樣性分析

對(duì)L1組與L2組作Alpha多樣性指數(shù)分析，包括shannon、Simpson、Chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree 指數(shù)等，由表7 可知，Shannon 指數(shù)自由采食組大于限飼組，而Simpson指數(shù)自由采食組小于限飼組，說(shuō)明自由采食提高犢牛瘤胃微生物多樣性指數(shù)；自由采食組Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和PD_whole_tree 均高于限飼組，說(shuō)明自由采食提高瘤胃細(xì)菌豐富度指數(shù)； 兩組覆蓋率均大于99%，說(shuō)明所取樣品足以反映瘤胃菌群情況。

2.4.5 多樣本比較分析（Beta Diversity）

利用Beta diversity 對(duì)不同樣本微生物群落構(gòu)成作比較分析。樣本群落結(jié)構(gòu)相似度高則傾向聚集，樣本群落差異大則離散。本研究基于非加權(quán)距離主成分分析（PCoA）得到圖5，由5圖可知，主成分2（PC2）貢獻(xiàn)率為8.08%，主成分1（PC1）貢獻(xiàn)率為21.97%，L1組聚類最好，L2組相對(duì)分散，說(shuō)明組間群落結(jié)構(gòu)差異較大。

表7 樣品多樣性指數(shù)Table 7 Diversity indices of samples

2.5 瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 門水平

根據(jù)注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣本在各注釋層級(jí)上最大豐度排名前10 功能信息，分別生成如圖6所示12個(gè)樣本及圖7所示2組在門水平上物種相對(duì)豐度柱狀堆積圖，表7 表示排名前10 的門水平菌落，豐度最高細(xì)菌為擬桿菌門（Bacteroidetes），其次厚壁菌門（Firmicutes），占總菌群比例90%以上。 與L1 組相比， L2 組增加厚壁菌門（Firmicutes）、未注釋球菌門（unidentified_Bacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）相對(duì)豐度；減少擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、螺旋體門（Spirochaetes）相對(duì)豐度，但均不顯著（P＞0.05）。

表8 酸化奶飼喂量對(duì)6月齡犢牛瘤胃液菌群門水平相對(duì)豐度的影響Table 8 Effect of acidified milk feeding on relative abundance of gastric flora at gate level

2.5.2 屬水平

取每個(gè)樣本在屬水平上排名前10 菌屬，分別生成如圖8及圖9所示柱狀圖，并將前10屬水平菌落如表9表示，可得出兩組優(yōu)勢(shì)菌屬中未注釋普雷沃氏菌屬（unidentified Prevotellaceae）相對(duì)豐度最高，其次是未注釋瘤胃球菌屬（unidentified Ruminococcaceae）和未注釋毛螺菌屬（unidentified Lachnospiraceae），且無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與L1組相比，L2 組增加未注釋瘤胃球菌屬（unidentified Ruminococcaceae）、未注釋毛螺菌屬（unidentified Lachnospiraceae）、 Acetitomaculum、 Sharpea、 Shuttleworthia、擬桿菌屬（Alistipes）相對(duì)豐度，降低未注釋普雷沃氏菌屬（unidentified Prevotellaceae）、Saccharofermentans、琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）相對(duì)豐度，其中顯著降低未注釋韋榮氏菌屬相對(duì)豐度（P＜0.05）。

2.5 樣品組間差異LEfSe 分析

利用LEfSe 分析工具分析兩組數(shù)據(jù)如圖10 所示，可知L2組梭菌目（Clostridiales）、梭菌綱（Clostridia）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、未注釋疣微菌科（unidentified Ruminococcaceae）相對(duì)豐度較L1組顯著增加（P＜0.05）；棲瘤胃普雷沃菌（Prevotella ruminicola）、未注釋普雷沃氏菌科（unidentified Prevotellaceae）、擬桿菌目（Bacteroidales ）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌門（Bacteroidetes)、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）相對(duì)豐度較L1組顯著減少（P＜0.05）。

表9 酸化奶飼喂量對(duì)斷奶犢牛瘤胃菌群在屬水平相對(duì)豐度的影響Table 9 Effect of acidified milk feeding on relative abundance of gastric flora in genus levels

3 討 論

3.1 酸化奶飼喂量對(duì)斷奶犢牛后期體重、體高、日增重的影響

犢牛生長(zhǎng)發(fā)育情況影響育成牛生長(zhǎng)發(fā)育、配種產(chǎn)犢及成年牛各項(xiàng)生產(chǎn)性能，因此犢牛培育階段至關(guān)重要。日糧是影響犢牛生長(zhǎng)發(fā)育主要因素之一，且瘤胃內(nèi)微生物隨日糧而變化[9-10]。本試驗(yàn)中，兩組犢牛初生重?zé)o顯著差異（P＞0.05），試驗(yàn)期L1 組犢牛體重顯著高于L2 組（P＜0.05），這與Schaff報(bào)道自由采食可增加犢牛采食量和增重結(jié)論一致[11]，犢牛出生不久，各項(xiàng)消化機(jī)能不完善，不喜食開食料或固體飼料，酸化奶攝入量提高[12]。但吳志強(qiáng)將高牛奶量定為6 L，低牛奶量定為3 L，得出高牛奶飼喂量顯著增加2～4、4～6 周齡體重和日增重，而6～8周齡體重、體高、日增重均無(wú)顯著影響[13]，與本研究飼喂配方不同。本試驗(yàn)自由采食組斷奶后犢牛體重、體高、日增重高于限制飼喂組，一方面由于犢牛個(gè)體發(fā)育程度不同，另一方面自由采食組犢牛在哺乳階段體重較高，斷奶后期對(duì)飼料需求量更大，這與鮑宇紅報(bào)道限量飼喂組犢牛后期生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)更明顯結(jié)論不一致[14]，原因可能是本試驗(yàn)考慮犢牛斷奶時(shí)日糧突然改變可能引發(fā)斷奶應(yīng)激[15]，在斷奶前調(diào)整兩組犢牛牛奶攝入量，逐漸減少牛奶攝入量，增加開食料攝取，降低斷奶應(yīng)激。因此，從增重和應(yīng)激兩個(gè)方面考慮，哺乳期犢牛一段時(shí)間內(nèi)自由采食效果更好。

3.2 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛開食料采食量的影響

犢牛從10 日齡開始采食固體飼料，當(dāng)牛奶飼喂量減少或斷奶時(shí)，犢牛對(duì)固體飼料采食量迅速增加[1]。本試驗(yàn)中酸化奶飼喂量影響犢牛開食料采食量，犢牛在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)牛奶飼喂量減少時(shí)，必須采食更多固體飼料補(bǔ)充能量，所以限量飼喂增加開食料采食量，這與前人研究結(jié)果一致[16]。

3.3 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃發(fā)酵參數(shù)中揮發(fā)性脂肪酸（VFA），是微生物分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的，且是反芻動(dòng)物主要能量來(lái)源，揮發(fā)性脂肪酸主要是由乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸，異戊酸、戊酸等組成[17]。研究表明，牛奶不同飼喂量影響后期固體飼料攝入，從而影響瘤胃發(fā)酵與微生物區(qū)系，但本試驗(yàn)中牛奶飼喂量高低對(duì)乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸以及總VFA無(wú)顯著影響，這一結(jié)果與張千結(jié)論一致[18]。自由采食組降低瘤胃pH，但不顯著（P＞0.05），這與吳志強(qiáng)結(jié)論一致[13]，瘤胃pH 又受各種VFA 比例影響，其中影響pH最大的是丙酸，瘤胃pH與丙酸濃度可能呈負(fù)相關(guān)，與乙酸濃度呈正相關(guān)，瘤胃pH 和乙酸濃度隨纖維含量增加而增加，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，但與丙酸濃度隨纖維含量增加而降低，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與日齡因素有關(guān)，斷奶到六月齡犢牛飼喂模式一致，前期營(yíng)養(yǎng)干擾在后期同模式飼養(yǎng)下發(fā)生改變的原因有待研究。

3.4 酸化奶飼喂量對(duì)犢牛瘤胃微生物多樣性的影響

本研究探討限量飼喂和自由采食酸化奶對(duì)荷斯坦斷奶犢牛后期瘤胃菌群多樣性的影響，通過(guò)Venn 圖和稀釋曲線發(fā)現(xiàn)，L2組特有OTU數(shù)少于L1組，且測(cè)序深度合理；通過(guò)PCoA 發(fā)現(xiàn)L1 組聚類好，L2 組相對(duì)分散，組間群落結(jié)構(gòu)差異較大。說(shuō)明一定時(shí)間內(nèi)自由采食更有利于微生物繁殖，前期飼喂量不足影響瘤胃菌群發(fā)展。

在門水平上，大量研究表明擬桿菌門和厚壁菌門是哺乳動(dòng)物胃腸道優(yōu)勢(shì)菌群[19-20]，與本試驗(yàn)結(jié)論相同，但菌群變化趨勢(shì)不同，L2 組與L1 組相比，L2 組在厚壁菌門、未注釋球菌門、梭桿菌門、變形菌門等呈上升趨勢(shì)，但擬桿菌門、軟壁菌門、螺旋體門等呈下降趨勢(shì)，且限量飼喂?fàn)倥：癖诰T相對(duì)豐度較自由采食犢牛更高，主要原因是厚壁菌門具有分解纖維的能力，限飼造成犢牛饑餓，犢牛采食開食料，對(duì)纖維消化能力更強(qiáng)。兩組犢牛除哺乳期哺乳量不同外其他飼養(yǎng)條件均相同，僅牛奶飼喂量不同。

在屬水平上，兩處理組優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬和毛螺菌屬，且無(wú)顯著差異。L2 組普雷沃氏菌屬低于L1 組，但差異不顯著（P＞0.05）。普雷沃氏菌屬屬于擬桿菌門，這類菌屬具有一定蛋白酶活性，是瘤胃主要蛋白降解菌之一[21]。Rey 和郭凱研究發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬在瘤胃中含量與比例不受飼糧結(jié)構(gòu)影響，且一直處于優(yōu)勢(shì)地位，與本試驗(yàn)結(jié)果一致[22,5]。研究還發(fā)現(xiàn)，限飼提高犢牛瘤胃與半纖維素分解有關(guān)的毛螺菌屬相對(duì)豐度，顯著降低以利用乳酸為主的未注釋韋榮氏菌屬相對(duì)豐度（P＜0.05），可能與開食料采食量有關(guān)，但具體機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

通過(guò)LEfSe分析，限量飼喂組高于自由采食組菌類有梭菌目、梭菌綱、厚壁菌門、疣微菌科、未注釋疣微菌科；限飼組低于自由采食組菌類有棲瘤胃普雷沃菌、未注釋普雷沃氏菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、擬桿菌門、普雷沃氏菌科。梭菌與哺乳動(dòng)物腹瀉存在相關(guān)[24]，本試驗(yàn)中限量飼喂?fàn)倥Ａ鑫肝⑸镏兴缶鄬?duì)豐度顯著高于自由采食（P＜0.05），可能是由于犢牛瘤胃發(fā)育吸收與利用有關(guān)[25]，可能是L1組犢牛體重顯著高于L2組原因之一。

4 結(jié) 論

自由采食酸化奶顯著提高哺乳期犢牛日增重及斷奶犢牛日增重。門水平上擬桿菌門與厚壁菌門以及屬水平上普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬和毛螺菌屬均為優(yōu)勢(shì)菌群。與限量飼喂?fàn)倥Ｏ啾?，自由采食酸化奶提高未注釋韋榮氏菌屬、棲瘤胃普雷沃菌、未注釋普雷沃氏菌科、擬桿菌目、擬桿菌綱、普雷沃氏菌科相對(duì)豐度。