FGF-21緩解阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌炎癥反應(yīng)和凋亡作用機(jī)制研究

李德山 , ，王宗寶，康 凱，任桂萍，于 丹

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222002）

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是臨床上用于治療各類惡性腫瘤的蒽醌類高效廣譜化療藥物[1]，但劑量依賴心臟毒性副作用限制其臨床應(yīng)用，主要體現(xiàn)在心肌損傷[2]。近年來(lái)，針對(duì)阿霉素心臟毒性研究發(fā)現(xiàn)，DOX 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥和凋亡方面在毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3]，包括激活心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，線粒體功能紊亂，心功能下降等，揭示該類疾病具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制[4]。阿霉素可激活NF-κB 通路，引起下游如IL-6 等炎癥介質(zhì)釋放，引發(fā)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[5]。此外NF-κB通路激活也可能促進(jìn)凋亡[6]，進(jìn)一步引起心肌損傷。其他研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可通過(guò)Nrf2 通路上調(diào)caspase-3 和bax表達(dá)，下調(diào)bcl-2表達(dá)，引起心肌細(xì)胞凋亡造成心肌損傷[7]。同時(shí)STAT3信號(hào)通路在心肌凋亡方面發(fā)揮重要作用，激活STAT3 通路可抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[8]，為緩解阿霉素毒副作用機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21（Fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF-21）是由209 個(gè)氨基酸組成的內(nèi)分泌蛋白[9]，目前，已知FGF-21 在降血糖[10]、降血脂、調(diào)節(jié)能量代謝、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥[11]、抑制器官纖維化[12]和抑制血小板活化[13]等方面效果明顯。FGF-21可通過(guò)SIRT1/LKB1/AMPK信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[14]。除此之外，F(xiàn)GF-21緩解DOX誘導(dǎo)心臟毒性作用的機(jī)制與NF-κB 和STAT3 通路之間的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。本研究利用DOX 所誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型，探究FGF-21 對(duì)該大鼠模型的保護(hù)作用，進(jìn)一步探究FGF-21緩解DOX誘導(dǎo)的大鼠心肌炎癥反應(yīng)和凋亡過(guò)程中發(fā)揮的作用，同時(shí)明確FGF-21緩解DOX誘導(dǎo)大鼠心肌損傷過(guò)程中對(duì)NF-κB 和STAT3 通路作用。本研究為FGF-21緩解DOX誘導(dǎo)大鼠心肌損傷預(yù)防機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pSUMO-FGF-21重組質(zhì)粒、E.coli Rosetta 表達(dá)菌株和H9C2細(xì)胞均保存自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心生物制藥實(shí)驗(yàn)室；SUMO蛋白酶制于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心生物制藥實(shí)驗(yàn)室[15]。

1.2 試劑與器材

鹽酸阿霉素（DOX）購(gòu)自都萊公司；血糖儀、血糖試紙購(gòu)自青島厚美德公司；Rat IL-1β、Rat IL-6和Rat TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自北京安迪華泰科技有限公司；兔抗bcl-2、Caspase-8抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗β-actin抗體、兔抗bax抗體、鼠抗stat3抗體、兔抗P-stat3抗體、兔抗Caspase-3抗體、兔抗P-NF-κB 抗體、兔抗NF-κB 抗體和兔抗GAPDH 抗體購(gòu)自Cell Signaling 公司；HRP 羊抗鼠抗體和HRP 羊抗兔抗體購(gòu)自R&D；Western quick block kit 購(gòu)自Genescript 公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液和一抗二抗去除液均購(gòu)自碧云天公司。

1.3 引物序列

Rat 引物序列由Sangon Biotech 合成： IL-6（ 上 游： AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下 游：TAGCACACTAGGTTTGCCGA）， IL- 1β（ 上 游：GACTTCACCATGGAACCCGT； 下 游： GGAGACT GCCCATTCTCGAC），TNF-α（上游：GATCGGTCC CAACAAGGAGG；下游：GTGAGGAGCACATAGT CGGG）， GAPDH（上游： AGTGCCAGCCTCGTCT CATA；下游：GATG GTGATGGGTTTCCCGT）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 雄性小鼠20 只，20～25 g，購(gòu)自北京唯尚立拓科技有限公司，合格證號(hào)：NO.11036419 11001109，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0009；10月齡SD 雄性大鼠25 只，約230～270 g，購(gòu)自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.5 方法

1.5.1 FGF-21蛋白發(fā)酵表達(dá)與純化

將pSUMO-FGF-21重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta表達(dá)菌，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于氨芐抗性（100 μg·mL-1）20 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6～8 h 后，SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)菌體上清中SUMO-FGF-21蛋白表達(dá)。按1%接種量接種于2個(gè)氨芐抗性（100 μg·mL-1）250 mL LB 液體培養(yǎng)基，120 r·min-1，37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600達(dá)到2時(shí)，作為發(fā)酵一級(jí)種子。以1%接種量接種于5 L 培養(yǎng)基發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度37 ℃，pH 7，溶氧百分比為30%，當(dāng)菌體OD600達(dá)到7時(shí)，取少量菌液制作蛋白樣品，溫度調(diào)至25 ℃，加入IPTG（0.25 mmoL·L-1）誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h[16]。收集菌液，取少量菌液制作蛋白樣品，剩余菌液，溫度4 ℃，4 000 r·min-1離心，棄上清，將菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液攪拌均勻倒入高壓勻漿機(jī)破碎，離心后收集上清并經(jīng)中空纖維柱澄清。運(yùn)用AKTA purifier100 純化系統(tǒng)純化，利用His Trap TM FF crude 親和層析柱一次親和得到SUMO-FGF-21， Hi Prep TM 26/10 Desalting脫鹽柱脫鹽后，加入SUMO 蛋白酶4 ℃過(guò)夜酶切。再利用His Trap TM FF crude 親和層析柱二次親和，脫鹽后得到成熟FGF-21 蛋白。15%蛋白凝膠電泳分析蛋白純化情況。

1.5.2 FGF-21蛋白活性鑒定

為檢測(cè)FGF-21 蛋白活性，糖尿病模型組和FGF-21組C57BL/6 小鼠按照100 mg·kg-1腹腔注射一次STZ，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水，根據(jù)血糖變化情況每天測(cè)量血糖，直至高血糖趨勢(shì)穩(wěn)定[16]。每日FGF-21 組注射FGF-21 蛋白，注射劑量為1 mg·kg-1。注射前和后2、4 h 分別取各組小鼠尾尖血，血糖儀檢測(cè)血糖。

1.5.3 心肌損傷大鼠模型建立

SD 大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（Control）、心肌損傷模型組（Model）、 FGF- 21 高劑量組（FH）、FGF-21 中劑量組（FM）、FGF-21 低劑量組（FL）5 組。利用PBS 將DOX 配制成2 mg·mL-1工作液，除Control組外其余各組SD大鼠于每周1、3、5、7日均尾靜脈注射2 mg·kg-1DOX 工作液，Control 組給予等量生理鹽水，同時(shí)FH、FM和FL組從第1次注射DOX 工作液開(kāi)始每天腹腔注射FGF-21 蛋白，劑量分別為5、2 和1 mg·kg-1，注射4 周，直至大鼠處死[17]。處死大鼠時(shí)，取各組大鼠心臟組織，一部分心臟組織浸泡于4%多聚甲醛，一部分組織保存于-80 ℃；胸、腹腔積液2 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min保存于-80 ℃。

1.5.4 Real-time PCR檢測(cè)炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平取-80 ℃保存的各組大鼠心臟組織0.1 g，Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作Realtime PCR擴(kuò)增，每組3個(gè)平行反應(yīng)。具體循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃5 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)后記錄數(shù)據(jù)。引物序列：IL-6（上游：AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下游： TAGCACA CTAGGTTTGCCGA），IL-1β（上游：GACTTCA CC ATGGAACCCGT； 下游： GGAGACTGCCCATTCTC GAC），TNF-α（上游：GATCGGTCCCAACAAGGA GG；下游：GTGAGGAGCACATAGTCGGG），GAPDH（上游：AGTGCCAGCCTCGTCTCATA；下游：GAT GGTGATGGGTTTCCCGT）。

1.5.5 阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠相關(guān)炎癥因子指標(biāo)測(cè)定

取-80 ℃保存各組大鼠心臟組織0.1 g，加入1 mL生理鹽水勻漿，低溫離心機(jī)中2 000 r·min-1離心20 min后收集上清液體；取-80 ℃保存各組大鼠胸、腹腔積液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白指標(biāo)

取-80 ℃保存各組大鼠心臟組織約0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，組織勻漿機(jī)充分勻漿，4 ℃裂解1 h 后，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移到NC 膜上，Western quick block kit 封 閉5～10 min， PBS 洗 膜5 s，分別加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBST洗膜3次，每次10 min，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗室溫避光孵育1 h（鼠抗stat3 抗體孵育的膜應(yīng)用HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗避光孵育1 h），PBST 洗膜3 次后化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image Lab 6.0軟件分析條帶。

1.5.7 HE和Masson染色病理檢測(cè)

處死大鼠時(shí)取各組大鼠心臟部分組織，浸泡于4%多聚甲醛，送南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科作病理組織切片。

1.5.8 阿霉素誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷模型建立

H9C2 細(xì)胞分成正常對(duì)照組（Control）、模型組（Model）、FGF-21 高劑量（80 μg·mL-1）組（FH）、FGF-21中劑量（40 μg·mL-1）組（FM）、FGF-21低劑量（20 μg·mL-1）組（FL）。利用生理鹽水將DOX配制成終濃度5 μg·mL-1工作液， FH、FM和FL組預(yù)先用FGF-21干預(yù)2 h，劑量分別為80、40 和20 μg·mL-1，Model 組與FH、FM、FL 組同時(shí)用5 μg·mL-1DOX工作液刺激H9C2 細(xì)胞22 h，Control 組用同體積生理鹽水處理[14]。利用各組細(xì)胞制作蛋白樣品，作Western blot檢測(cè)，具體步驟見(jiàn)1.5.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 SUMO-FGF-21發(fā)酵表達(dá)

將一級(jí)種子接入發(fā)酵罐，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)4 h，25 ℃、0.25 mmoL·L-1IPTG條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，通過(guò)蛋白凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖1，1號(hào)泳道誘導(dǎo)前菌種無(wú)SUMO-FGF21蛋白表達(dá)，2號(hào)泳道誘導(dǎo)后全菌有SUMO-FGF21蛋白表達(dá)，3號(hào)泳道誘導(dǎo)后上清有SUMO-FGF21蛋白表達(dá)，4號(hào)泳道誘導(dǎo)后沉淀有SUMO-FGF21 蛋白表達(dá)。SUMOFGF21蛋白發(fā)酵表達(dá)成功。

2.2 FGF-21蛋白純化

運(yùn)用AKTA purifier100 純化系統(tǒng)純化FGF-21蛋白，結(jié)果如圖2 所示，1 號(hào)泳道為最終純化所得FGF-21蛋白，約23 ku，且無(wú)雜蛋白。

2.3 FGF-21蛋白生物學(xué)活性體內(nèi)檢測(cè)

為鑒定FGF-21 蛋白活性，將純化所得FGF-21 蛋白注射于STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型體內(nèi)，如圖3 所示，注射FGF-21蛋白前，糖尿病模型組和FGF-21組小鼠血糖水平無(wú)顯著差異。注射FGF-21蛋白2 h后，F(xiàn)GF-21組小鼠血糖濃度明顯降低，較糖尿病模型組差異極顯著（P＜0.01）。注射FGF-21 蛋白4 h 后，F(xiàn)GF-21 組小鼠血糖濃度明顯降低，較糖尿病模型組差異極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21蛋白降血糖蛋白活性較好。

2.4 FGF-21對(duì)阿霉素誘導(dǎo)后大鼠體重的影響

如圖4a 所示，造模前各組大鼠體重均處于相同水平。造模1個(gè)月后，與正常對(duì)照組相比，模型組、FGF-21 高、中和低劑量組大鼠總體重極顯著降低（P＜0.01）。如圖4b 所示，造模1 個(gè)月后，各組大鼠除去胸、腹腔積液，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高劑量組大鼠體重降低緩慢，差異顯著（P＜0.05）。如圖4c 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠胸、腹腔積液極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高劑量組大鼠胸、腹腔積液顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)GF-21 中、低劑量組大鼠積液無(wú)顯著變化。FGF-21 呈劑量依賴性顯著緩解阿霉素誘導(dǎo)大鼠后體重降低，減少阿霉素誘導(dǎo)大鼠胸、腹腔積液產(chǎn)生。

2.5 FGF-21 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠心臟TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響

如圖5a 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α mRNA 表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比， FGF- 21 高劑量組大鼠TNF- α mRNA顯著降低（P＜0.05），與正常對(duì)照組水平無(wú)顯著差異，F(xiàn)GF-21中、低劑量組大鼠無(wú)顯著差異。如圖5b 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-1β mRNA 表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21高、中劑量組大鼠IL-1β表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)GF-21 低劑量組大鼠無(wú)顯著差異。圖5c 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-6 mRNA 表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21高劑量組大鼠IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)GF-21 中、低劑量組大鼠無(wú)顯著變化。結(jié)果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低阿霉素誘導(dǎo)大鼠心臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)。

2.6 FGF-21 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠心臟TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響

如圖6a 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α 表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21高、中、低劑量組大鼠TNF-α表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），與正常對(duì)照組水平無(wú)顯著差異。如圖6b 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-1β 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高、中、低劑量組大鼠IL-1β 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。如圖6c 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠IL-6 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21高、中劑量組大鼠IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)GF-21 低劑量組大鼠無(wú)顯著變化。結(jié)果表明FGF-21可有效降低阿霉素誘導(dǎo)大鼠心臟中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，呈劑量依賴性降低大鼠心臟IL-6表達(dá)。

2.7 FGF-21對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠胸、腹腔積液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響

如圖7a 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠積液中TNF-α 表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高、中劑量組大鼠積液中TNF-α 表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)GF-21 低劑量組大鼠TNF-α 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。如圖7b 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠積液中IL-1β 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高、中、低劑量組大鼠積液中IL-1β 表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。如圖7c 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠積液中IL-6 表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高、低劑量組大鼠積液中IL-6 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低阿霉素誘導(dǎo)大鼠胸、腹腔積液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)量。

2.8 FGF-21對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷大鼠炎癥蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、stat3和P-NF-κB 表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），P-stat3 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），bcl-2 表達(dá)無(wú)顯著差異；與模型組相比，F(xiàn)GF-21 高劑量組大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3 和P-NF-κB 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），P-stat3表達(dá)顯著增加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 無(wú)顯著變化，F(xiàn)GF-21 中劑量組大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3和P-NF-κB表達(dá)顯著降低（P＜0.05）， P- stat3 表 達(dá) 顯 著 增 加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 無(wú)顯著變化，F(xiàn)GF-21 低劑量組大 鼠P- NF- κB 表達(dá) 顯 著降 低（P＜0.05）， bax、cleaved-caspase-3、 cleaved-caspase-8、stat3和Pstat3無(wú)顯著變化。結(jié)果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低bax、cleaved caspase-3 和P-NF-κB 表達(dá)，增加P-stat3 表達(dá)，激活阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷模型中STAT3 通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制NF-κB信號(hào)通路，緩解心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2.9 FGF-21對(duì)阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌損傷的影響

如圖9 所示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠左心室壁及心腔面有多處膠原纖維沉積，呈斑塊狀，局部心肌細(xì)胞缺失，周圍心肌細(xì)胞空泡變，并見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞增生，左心室壁多處見(jiàn)藍(lán)染膠原纖維沉積；與模型組相比， FGF-21高劑量組大鼠左心壁肌間血管周圍纖維組織增多，周圍心肌細(xì)胞空泡變，有極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周圍藍(lán)染區(qū)擴(kuò)大；FGF-21中劑量組大鼠左心壁肌間見(jiàn)纖細(xì)網(wǎng)狀分布的成纖維細(xì)胞，周圍心肌細(xì)胞空泡變，有極少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，藍(lán)染纖維呈纖細(xì)網(wǎng)狀；FGF-21低劑量組大鼠局部左心室壁極薄，心腔面和心包膜面大量纖維組織增生，存留中間少量心肌纖維。周圍心肌細(xì)胞變性，并見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心腔面和心包膜面為藍(lán)染膠原纖維。結(jié)果表明FGF-21有效緩解阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化損傷。

2.1 0 FGF-21 對(duì)阿霉素誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞炎癥蛋白和凋亡蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖10 所示。

由圖10 可知，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞bax表達(dá)水平極顯著增加（P＜0.01），cleaved-caspase-3、cleaved-caspase- 8、NF-κB、stat3 和PNF-κB 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），P-stat3 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)GF-21高劑量組細(xì)胞bax、cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-8、NF-κB、stat3 和P-NF-κB 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），P-stat3 表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），F(xiàn)GF-21 中劑量組細(xì)胞bax、cleaved-caspase-3、stat3、NF-κB 和P-NF-κB 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），P-stat3和cleaved-caspase-8表達(dá)水平無(wú)顯著差異，F(xiàn)GF-21 低劑量組細(xì)胞bax、stat3和P-NF-κB 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）, cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、NF-κB和P-stat3無(wú)顯著變化。結(jié)果表明FGF-21 可激活H9C2 心肌細(xì)胞STAT3 通路，增加心肌細(xì)胞P-stat3 表達(dá)，下調(diào)bax、 cleaved- caspase- 3 和cleaved- caspase- 8 表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制P-NF-κB 表達(dá)，緩解心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

DOX 誘導(dǎo)心臟毒性發(fā)病機(jī)制涉及復(fù)雜的過(guò)程，涉及激活各種下游的促炎、促氧化和促凋亡過(guò)程[18]，嚴(yán)重可誘導(dǎo)心力衰竭，繼而發(fā)展成心臟疾病[19]。近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)DOX 可增加IL-6 等炎癥因子mRNA 表達(dá)，上調(diào)炎癥因子蛋白表達(dá)，誘發(fā)H9C2心肌細(xì)胞炎癥，除此之外激活NF-κB信號(hào)通路也可誘發(fā)心肌炎癥[20]。同時(shí)DOX可通過(guò)TGF-β1/Smad3通路促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡作用[21-22]。Zhang 等報(bào)道FGF-21 對(duì)抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激方面有較好效果[5]，通過(guò)激活Nrf2 抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，也可通過(guò)Nrf2通路保護(hù)小鼠肝臟[23]。在凋亡方面，F(xiàn)GF-21 也發(fā)揮重要作用，有氧運(yùn)動(dòng)可上調(diào)心梗大鼠內(nèi)源性FGF-21 表達(dá)抑制H9C2 心肌細(xì)胞凋亡[24]，但在阿霉素誘導(dǎo)的心肌凋亡大鼠模型中，尚無(wú)FGF-21 與NF-κB 和STAT3 信號(hào)通路關(guān)系的報(bào)道。因此本研究利用DOX 誘導(dǎo)心肌損傷大鼠模型探究FGF-21 對(duì)NF-κB 和STAT3 信號(hào)通路的作用，并在細(xì)胞水平上開(kāi)展相同通路探究，闡明FGF-21經(jīng)NF-κB 和STAT3 信號(hào)通路緩解DOX 誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷的作用。

本研究表明，在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型中，F(xiàn)GF-21 可減少胸、腹腔積液和積液中炎癥因子表達(dá)，通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制大鼠心肌炎癥反應(yīng)，激活STAT3 信號(hào)通路抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡作用，預(yù)防心肌纖維化發(fā)生。本研究不僅為FGF-21臨床應(yīng)用、阿霉素毒副作用預(yù)防與機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，也為其他藥物性等原因心肌炎癥反應(yīng)和凋亡作用的預(yù)防與機(jī)制研究提供參考。但本研究發(fā)現(xiàn)DOX 誘導(dǎo)的心肌損傷大鼠和細(xì)胞模型中，bcl-2 表達(dá)無(wú)明顯變化，與蘭蕊等研究指出DOX 誘導(dǎo)心肌病中bcl-2 表達(dá)下調(diào)變化不同[17]，同時(shí)心肌損傷大鼠模型出現(xiàn)胸、腹腔積液原因尚未明確，此為本實(shí)驗(yàn)室未來(lái)研究主要方向。